CN112326848B

CN112326848B - 一种基于三甲基硅基重氮甲烷甲酯化植酸分析方法

Info

Publication number: CN112326848B
Application number: CN202011146617.6A
Authority: CN
Inventors: 蒋可志; 俞赛赛; 汪嫣
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2020-10-23
Filing date: 2020-10-23
Publication date: 2022-11-29
Anticipated expiration: 2040-10-23
Also published as: CN112326848A

Abstract

本发明公开了一种基于三甲基硅基重氮甲烷衍生化的植酸分析方法，包括：调节样品的pH值至酸性，并加入适量三甲基硅基重氮甲烷进行甲酯化；将所得到的衍生化产物溶液经过氮吹和定容后进行液相色谱质谱联用分析，并采用外标法进行定量分析。该方法采用甲酯化提高植酸的稳定性，并极大地降低了其极性、酸性以及金属离子的络合能力，从而在通用条件下实现了对植酸的液质联用分析，并显著提高了检测方法的灵敏度、选择性和准确度。同时，采用三甲基硅基重氮甲烷作为衍生化试剂，其衍生化反应快速，反应条件温和，反应操作简便，同时过量的衍生化试剂去除方便，因而该分析方法容易推广。

Description

一种基于三甲基硅基重氮甲烷甲酯化植酸分析方法

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种基于三甲基硅基重氮甲烷甲酯化的植酸分析方法。

背景技术

植酸(又称肌醇六磷酸酯，IP6)普遍存在于植物的种子、根干和茎中，是植物中磷的主要储存形式，其中植物种子中植酸或其盐约占种子重量的1-2％。作为多功能分子，植酸参与许多非常重要的细胞功能，诸如RNA表达、DNA修复、P-糖蛋白调节、胰岛素、自然免疫等等。

随着值酸功能不断被人们了解和挖掘，植酸在食品领域已被广泛地作为除金属剂、抗氧化剂、保鲜剂和发酵促进剂发挥作用，在医药领域可用于治疗糖尿病、肾结石等病症，还在化工领域可用于防锈、清洗、防静电及金属表面处理等。

在植酸酶作用下或者食物加工过程中，植酸会发生降解，生成去磷酸化异构体乃至无机磷酸盐。去磷酸化植酸表现出不同的生物功能，比如，只有肌醇六磷酸酯(IP6)和肌醇五磷酸酯(IP5)与锌、钙和铁等多价金属离子具有很强的络合能力，并会形成难溶盐，明显干扰了微量元素和矿物质的生物利用度。甚至，肌醇三磷酸酯(IP3)的4个异构体都表现出不同的生理学和病理学功能。因此，建立一种简便、准确的植酸分析方法，对其生理机能探索、相关产品质量控制和人类健康都有着极其重要的意义。

检测植酸的方法主要有基本沉淀法、比色法、同步荧光法、ICP-MS、离子色谱、固相萃取高效液相色谱测定法等。其中，沉淀法是基于形成植酸-铁(III)沉淀物的终点指示滴定；比色方法基于氯化铁和磺基水杨酸之间的反应，比沉淀法更快速和简单，因此成为目前最为常用的植酸检测方法；同步荧光法基于植酸、1,10-菲罗啉和Fe³⁺之间形成的三元络合物，进一步提高检测的灵敏度。但上述三种检测方法无法将肌醇六磷酸酯与低级肌醇磷酸酯区分，并且无法准确测定特别是加工食品中的植酸含量。

离子色谱法和固相萃取高效液相色谱测定法基于肌醇磷酸酯在固体吸附剂和离子交换树脂上的分离，适合于对加工食品中的植酸测定，但是难以适于复杂基质(特别是富有金属离子)中肌醇磷酸酯类的定量。

色谱质谱联用技术兼顾有机分子分析的高选择性和高灵敏度，成为复杂基质中微量有机组分定量分析的首选方法。然而，植酸结构中带有6个磷酸基团，具有强酸性、亲水性和金属离子的螯合能力，因而，植酸在常用的反相色谱柱上无保留流出，无法使用常规液相色谱进行分离分析，同时，磷酸基团与质子及各种金属离子结合，使植酸的质谱图严重复杂化，极大降低了植酸质谱检测的灵敏度和重现性。因此，至今为止，仍然无法直接对样品中的植酸类化合物进行色谱质谱联用分析。

化学衍生化检测方法是在待测物的结构中引入修饰基团，改变其物化性质，从而使得待测物在分析过程中可以排除基质干扰，增强质谱离子化效率。公开号为CN105021758A的专利说明书公开了一种基于化学衍生的磷脂分类检测和定量方法，采用三甲基硅重氮甲烷(TMSD)对磷脂分子中的磷酸基团进行甲酯化，并结合直接质谱(并非液质联用)分析技术应用于磷脂的定量分析。尽管如此，将三甲基硅基重氮甲烷的磷酸基团甲酯化能否应用于植酸的检测尚不清晰，未有相关报道。

发明内容

本发明提供了一种基于三甲基硅基重氮甲烷甲酯化植酸分析方法，结合液相色谱质谱联用技术对不同基质中微量植酸准确定量，所述微量植酸浓度在0.5ng/mL以上。

一种基于三甲基硅基重氮甲烷甲酯化的植酸分析方法，包括：

1)将样品溶于水-甲醇溶液中，采用无机酸溶液将样品溶液的pH值调节至酸性；

2)向步骤1)所得到的样品溶液中加入衍生化试剂进行甲酯化，反应温度为15-40℃，反应时间为10-120min，得到衍生物溶液；

3)将步骤2)中得到的衍生物溶液氮吹，加入乙二胺四乙酸(EDTA)，使用水-甲醇定容，利用液相色谱质谱联用技术检测，采用外标法进行定量分析含量。

三甲基硅基重氮甲烷无法对磷酸根离子甲酯化，只能对磷酸基团上的羟基衍生化，酸性条件下，植酸的磷酸基团以羟基形式存在，三甲基硅基重氮甲烷能够对植酸甲酯化。

采用三甲基硅基重氮甲烷对植酸的六个磷酸基团完全甲酯化，反应方程式如下：

植酸上所有的磷酸基团被甲酯化，这是进行植酸定量的基础。然而，植酸结构中有6个磷酸基团(12个羟基)，所有磷酸基团实现甲酯化是非常困难的，通常情况下，只能使植酸上部分磷酸基团甲酯化。

将样品溶于步骤1)中所述水-甲醇体系溶液，将样品溶液pH值调节至酸性，再加入衍生化试剂三甲基硅基重氮甲烷，才能使植酸上所有的磷酸基团完全甲酯化。

作为优选，所述步骤1)中水-甲醇体积比为1:6-1:9(V:V)。水-甲醇溶剂体系作为植酸溶剂，同时甲醇参与植酸的甲酯化反应。

在步骤1)中，所述无机酸溶液为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸或硝酸的水溶液，酸性较强。

作为优选，所述无机酸溶液为盐酸的水溶液，浓度为0.1-1mol/L。

作为优选，在步骤1)中，所述样品溶液pH值为3.0-6.5。

在步骤2)中，所述衍生化试剂为三甲基硅基重氮甲烷。

作为优选，所述步骤2)中，三甲基硅基重氮甲烷逐步滴加样品溶液中，防止三甲基硅基重氮甲烷浓度过高发生爆炸等安全风险。

作为优选，所述步骤2)中，三甲基硅基重氮甲烷的用量范围在50-400μL。

在步骤2)中，所述衍生化反应温度为15-40℃，防止三甲基硅基重氮甲烷溶液温度过高发生爆炸等安全风险。

作为优选，在所述步骤2)中，甲酯化反应结束后，加入10-100μL甲酸，去除多余衍生化试剂。

进一步优选，在所述步骤2)中，甲酸加入量为40-60μL。

三甲基硅基重氮甲烷是化学活性物质，会干扰植酸的测定，加入甲酸后，三甲基硅基重氮甲烷在甲酸的作用下，能快速转化成挥发性的氮气、甲酸甲酯和六甲基二硅醚，使用氮吹能够去除由剩余的三甲基硅基重氮甲烷转化的氮气、甲酸甲酯和六甲基二硅醚。

作为优选，在所述步骤3)中，在样品溶液中加入EDTA，破坏溶液微量金属离子与植酸衍生物的络合反应，提高植酸检测的灵敏度和重现性。

作为进一步优选，在样品溶液中所加入EDTA，浓度为1-100μg/mL。

作为优选，步骤3)中，所述液相色谱质谱联用技术使用C18、C30或C18-Amide色谱柱，采用甲醇-水或者乙腈-水作为淋洗液体系。

作为优选，步骤3)中，所述质谱采用大气压化学离子源或者电喷雾电离源，正离子模式扫描。

作为进一步优选，正离子模式扫描模式为多反应监测模式(m/z 829→m/z 451,m/z829→m/z 703，或者m/z 851→m/z 473)。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现：

(1)作为衍生化试剂的三甲基硅基重氮甲烷活性较高，衍生化条件比较温和，在室温、酸性条件下，能使植酸上的磷酸基团快速全部甲酯化，衍生化操作简单；通过甲酯化取代磷酸羟基的活泼质子，从而提高植酸类的稳定性，极大降低其极性、酸性和金属离子的络合能力。

(2)在样品溶液中加入EDTA，破坏溶液微量金属离子与植酸衍生物的络合，提高植酸检测的灵敏度和重现性。

(3)可以在常用条件下使用液相联用技术分析植酸衍生物，植酸衍生物的二级质谱图中产生的离子结构比较简单，定量离子(m/z 451或m/z 473)丰度高，因而提高了检测方法的灵敏度、重现性和准确性。

(4)样本溶液中加入无机酸，可以使植酸中的磷酸根离子转化为磷酸基团，促进所有磷酸基团的甲酯化，提高检测方法的准确性。

(5)三甲基硅基重氮甲烷可以从市售获取，与植酸反应后的衍生化合物室温下呈液态，在正已烷中能稳定的保存，毒性小。

(6)过量的三甲基硅基重氮甲烷在甲酸的作用下，能快速转化成挥发性的氮气、甲酸甲酯和六甲基二硅醚，去除方便。

附图说明

图1为植酸不完全衍生化产物的质谱图；

图2为植酸完全衍生化产物的质谱图；

图3为对比例1中植酸衍生化产物的二级质谱图；

图4为对比例1中植酸标样衍生化产物的液质联用MRM选择离子图；

图5为对比例1中由液相色谱质谱联用分析结果制得的植酸定量工作曲线图；

图6为实施例1中标样由液相色谱质谱联用分析结果制得的植酸定量工作曲线图；

图7为实施例2中饮料的植酸衍生化产物的液质联用MRM选择离子图；

图8为实施例3中大米的植酸衍生化产物的液质联用MRM选择离子图；

图9为实施例4中面粉的植酸衍生化产物的液质联用MRM选择离子图；

图10为实施例5中米线的植酸衍生化产物的液质联用MRM选择离子图；

图11为实施例6中面包的植酸衍生化产物的液质联用MRM选择离子图。

具体实施方式

通过下面实施例对本发明做进一步的阐述，下述说明仅为解释本发明，并不对其内容进行限定。

液相色谱质谱联用使用C18-Amide色谱柱(250m×4.6mm)，柱温：30℃；流速：0.5mL/min；流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为甲醇，等度洗脱：流动相A 50％，流动相B50％；进样量为15μL，质谱采用大气压化学离子源正离子(APCI+)扫描，扫描模式为多反应监测模式，电晕放电针电流4μA，毛细管电压4500V，雾化气(N₂)压力为20psi，干燥气(N₂₎的流速设为14L/min，干燥气(N₂)的温度设为200℃，汽化温度350℃。

在碱性条件下进行植酸衍生化，难以使所有的磷酸基团甲酯化。图1为植酸溶液在弱碱性(pH为8.5)条件下甲酯化产物的电喷雾质谱图(ESI-MS)，图中m/z 829离子对应植酸完全衍生化产物，m/z 815离子对应植酸结构中11个羟基衍生化产物，m/z 801离子对应10个羟基衍生化产物。通过优化衍生化条件，在样品溶液中加入步骤1)中所述水-甲醇体系溶液，将pH值调节到酸性，能够使植酸上所有的磷酸基团完全甲酯化(如图2所示)。

对比例1：未添加EDTA条件下植酸检测的工作曲线制作

配制浓度为100μg/mL植酸标准储备液(溶剂为水-甲醇，体积比为1:9)，并加入0.1mol/L盐酸调节pH值到6.5，取1.0mL储备液加入150μL三甲基硅基重氮甲烷，室温下反应60min，加入50μL甲酸终止反应，得到衍生化产物溶液；然后采用甲醇-水(V:V＝1:1)作为溶剂逐级稀释成100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL标准溶液系列，并分别进行液质联用分析。

植酸衍生化溶液的二级质谱图如图3所示。图中m/z 829离子为植酸衍生化产物的质子化离子(母离子)，m/z 451离子为母离子的特征碎片离子。采用多反应监测模式对衍生化产物进行液质联用分析，其碎片离子(m/z 451)作为定量离子。

图4为100ng/mL植酸衍生化溶液的液质联用MRM选择离子图，衍生化产物在液质联用分析中的保留时间为6.357min。

以峰面积对植酸浓度做工作曲线如图5所示，相关系数r²>0.999，工作曲线相关的参数列于表1中。分别对10ng/mL和100ng/mL的植酸衍生物进行重现性实验，结果发现日内重现性(RSD)分别为3.4％和4.3％,日间重现性(RSD)分别为4.6％和2.7％。

表1植酸定量分析的回归方程、相关系数及线性范围

实施例1：添加EDTA条件下植酸检测的工作曲线制作

配制浓度为100μg/mL植酸标准储备液(溶剂为水-甲醇,体积比为1:9)，取储备液1.0mL，加入0.5mol/L盐酸调节溶液pH值到6.5，加入150μL三甲基硅基重氮甲烷，25℃下反应60min，加入50μL甲酸终止反应，得到衍生化产物溶液；然后采用含10μg/mL EDTA的甲醇-水(V:V＝1:1)溶液作为溶剂将上述衍生化产物溶液逐级稀释成100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL标准溶液系列，并分别进行液质联用分析，以峰面积对植酸浓度做工作曲线如图6所示，相关系数r²>0.999，工作曲线相关的参数列于表2中。分别对5ng/mL和50ng/mL的植酸衍生物进行重现性实验，结果发现日内重现性(RSD)分别为3.0％和1.9％,日间重现性(RSD)分别为2.2％和2.0％。

与未添加EDTA条件下的工作曲线，本工作曲线具有更低的检出限(0.31ng/mLvs0.075ng/mL)、定量下限(1.04ng/mL vs 0.25ng/mL)，以及更宽的线性范围。此外，5ng/mL植酸在添加EDTA条件下经液质分析所获得的重现性能与10ng/mL植酸在未添加EDTA条件下具有相当的重现性。上述对比结果，说明了添加EDTA能提高植酸检测的灵敏度和重现性。

表2植酸定量分析的回归方程、相关系数及线性范围

实施例2：饮料中植酸的检测

取某饮料100μL，加入浓度为0.2mol/L的盐酸，调节pH值到6.0，加入900μL甲醇，加入250μL TMSD，25℃下反应60min，10μL浓度为10mg/mL的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，加入50μL甲酸终止反应，氮吹、定容并过滤后，采用液质联用检测分析。其液质联用MRM选择离子图见图7，用所得峰面积代入表1线性回归方程即可得到饮料中植酸的含量，测得饮料中植酸的含量为1.07μg/mL，加标回收实验测得，其回收率为94.9％。

实施例3：大米中植酸的检测

将某品牌大米粉碎后取1g，加入浓度为0.1mol/L的盐酸，调节pH值到6.5，加入10mL甲醇-水(V:V＝1:9)和10μL浓度为10mg/mL的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，磁子搅拌2h，离心15min；取100μL上清液，加入900μL甲醇，加入300μL TMSD室温下反应90min，加入50μL甲酸终止反应，过滤后用液质联用检测分析，其液质联用MRM选择离子图见图8。用所得峰面积代入表2线性回归方程即可得到大米中植酸的含量，测得大米中植酸的含量为6.98mg/g，加标回收实验测得，其回收率为118.6％。

实施例4：面粉中植酸的检测

取某品牌1g面粉，加入10mL甲醇-水(V:V＝1:6)和50μL浓度为10mg/mL的EDTA溶液，加入1.0mol/L盐酸调节pH值到4.5，磁子搅拌2h，离心15min，取100μL上清液，加入900μL甲醇，加入400μL TMSD,在35℃下反应120min，加入100μL甲酸终止反应，过滤后用液质联用检测分析。其液质联用MRM选择离子图见图9，用所得峰面积代入表2线性回归方程即可得到面粉中植酸的含量，测得面粉中植酸的含量为0.95mg/g；加标回收实验测得，其回收率为112.3％。

实施例6：米线中植酸的检测

将某品牌米线粉碎后取1g，加入10mL甲醇-水(V:V＝1:9)和80μL浓度为10mg/mL的EDTA溶液，加入0.1mol/L盐酸调节pH值到3，磁子搅拌2h，离心15min，取100μL上清液，加入900μL甲醇，加入200μL TMSD，室温下反应90min，加入40μL甲酸终止反应，过滤后用液质联用检测分析，其液质联用MRM选择离子图见图10，用所得峰面积代入表2线性回归方程即可得到米线中植酸的含量，测得米线中植酸的含量为1.92mg/g，加标回收实验测得，其回收率为115.8％。

实施例7：面包中植酸的检测

取某品牌1g面包，加入10mL甲醇-水(V:V＝1:9)和50μL浓度为10mg/mL的EDTA溶液，加入浓度为1.0mol/L的盐酸，调节pH值到4.0，磁子搅拌2h，离心15min，取100μL上清液，加入900μL甲醇，加入100μL TMSD,室温下反应40min，加入50μL甲酸终止反应，过滤后用液质联用检测分析。其液质联用MRM选择离子图见图11，用所得峰面积代入表2线性回归方程即可得到面包中植酸的含量，测得面包中植酸的含量为4.94mg/g，加标回收实验测得，其回收率为116.9％。

Claims

1.一种基于三甲基硅基重氮甲烷甲酯化植酸分析方法，包括：

1）将样品溶于水-甲醇溶液中，采用无机酸溶液将样品溶液的pH值调节至酸性，pH值范围在3.0-6.5；

2）向步骤1）所得到的样品溶液中加入衍生化试剂进行甲酯化，反应温度为15-40℃，反应时间为10-120min，得到衍生物溶液；

3）将步骤2）中得到的衍生物溶液氮吹，加入乙二胺四乙酸，使用水-甲醇定容，所述乙二胺四乙酸溶液的浓度为1-100 μg/mL,利用液相色谱质谱联用技术检测，采用外标法定量分析含量；

所述步骤2）中，甲酯化反应结束后，加入40-60μL的甲酸，去除多余衍生化试剂

样品包括饮料、大米、面粉、米线和面包；

所述衍生化试剂为三甲基硅基重氮甲烷；

液相色谱质谱联用使用C18-Amide色谱柱，即250 m ×4.6 mm，柱温：30℃；流速：0.5mL /min；流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为甲醇，等度洗脱：流动相A 50%，流动相B 50%；进样量为15 μL，质谱采用大气压化学离子源正离子，即APCI+ 扫描，扫描模式为多反应监测模式，电晕放电针电流4 μA，毛细管电压4500 V，雾化气的压力为20 psi，干燥气的流速设为14 L/min，干燥气的温度设为200 ℃，汽化温度 350 ℃，干燥气和雾化气均为N₂。

2.根据权利要求1所述的基于三甲基硅基重氮甲烷甲酯化植酸分析方法，其特征在于，步骤1）中水-甲醇溶液体积比为1:6-1:9。

3.根据权利要求1所述的基于三甲基硅基重氮甲烷甲酯化植酸分析方法，其特征在于，在步骤1）中，所述无机酸溶液为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸或硝酸的水溶液。

4.根据权利要求3所述的基于三甲基硅基重氮甲烷甲酯化植酸分析方法，其特征在于，所述无机酸溶液为盐酸溶液，浓度为0.1-1mol/L。