CN111721863B

CN111721863B - 超高效液相色谱-串联质谱测定小麦粉及其添加剂中非食用物质三聚硫氰酸三钠盐的方法

Info

Publication number: CN111721863B
Application number: CN202010547607.7A
Authority: CN
Inventors: 刘艳明; 张艳侠; 尹丽丽; 祝建华; 薛霞; 胡梅; 张喜琦; 赵慧男; 王明栋
Original assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Current assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Priority date: 2020-06-16
Filing date: 2020-06-16
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2040-06-16
Also published as: CN111721863A

Abstract

本发明公开了一种超高效液相色谱‑串联质谱测定小麦粉及其添加剂中非食用物质三聚硫氰酸三钠盐（TMT）的方法，样品中总三聚硫氰酸三钠盐用乙腈‑甲酸/甲酸铵缓冲溶液体系提取，上清液经Oasis PRIME HLB通过式固相萃取柱净化，C18色谱柱分离，采用甲醇‑酸化甲酸铵流动相进行梯度洗脱，三重四级杆质谱电喷雾多反应监测模式(MRM)检测，外标法定量。所优化的乙腈‑甲酸/甲酸铵缓冲溶液提取体系不仅能高效提不同形式的TMT，还能够很好的分散不同基质样品，克服小麦粉改良剂提取易“胶化”问题。该方法简便、高效、准确性好、抗干扰能力强，适用于小麦粉及其处理剂中痕量非食用物质TMT总量的准确定性、定量分析。

Description

超高效液相色谱-串联质谱测定小麦粉及其添加剂中非食用物质三聚硫氰酸三钠盐的方法

技术领域

本发明属于食品检测领域，具体涉及一种超高效液相色谱-串联质谱测定小麦粉及其添加剂中三聚硫氰酸三钠盐的方法。

背景技术

三聚硫氰酸三钠盐（TMT），为一种重金属离子去除剂，是一种金属离子处理剂，通过钠离子与重金属离子的交换，能与水溶液中的大多数一价和二价的重金属离子形成稳定的化合物而沉淀出来，从而达到去除重金属离子的目的。因其对传统碱中和方法不能去除的重金属离子具有很好的去除效果而得到广泛应用。TMT化学名为1,3,5-三嗪-2,4,6(1H,3H,5H)-三硫醇三钠盐，是一种纯白色结晶体，分子式为C₃N₃S₃Na₃，分子量为243.22，极易溶于水。其酸的形式为三聚硫氰酸（Trithiocyanuric acid），水溶性差，主要用途为丙烯酸酯橡胶专用硫化剂及铜矿的浮选药剂等。三聚硫氰酸及其钠盐均为化工用品，属于非食用物质，对水系统易产生危害，不允许大量产品接触地下水或城市用水系统。随着工业废水的大量排放，重金属污染的日益加剧，TMT在含重金属废水处理工业中的广泛应用也带来了严重安全隐患。小麦及其制品是重要的谷物资源之一，作为重要的主粮，其质量安全得到全社会的普遍关注。小麦及其制品存在的质量安全风险主要来源于本底污染、生物污染、化学污染、加工工艺的影响及违规使用添加剂或非法添加等方面。如何有效的控制和降低有害物质污染一直是各个政府及部门的关注重点，加强专项监测和风险评价是常用食品安全风险控制手段。近期有监测到小麦粉中含有非食用物质TMT，引起了研究者的强烈关注。食品中残留TMT这种化工产品，为非食用物质，其引入是污水处理带来的二次污染引起，还是不法分子非法添加还不明确。加强小麦粉及其相关产品中TMT的全链条式监测亟需开展，而不同产品中TMT检测方法的建立是最重要的技术支撑。

TMT的研究主要集中在重金属污水处理方面，但是没有具体的检测研究。对于小麦粉及其处理剂中的研究目前未见文献报道且无相关检测标准。有文献报道三聚硫氰酸三钠盐药剂含量测定，分别利用酸碱滴定法和紫外分光光度计方法进行检测，定性定量差，为常量检测。此外，对于TMT的有机酸形式三聚硫氰酸作为橡胶助剂的检测是利用高效液相色谱法通过添加离子对试剂增加其保留的反相色谱分离，该方法只是标准品的分析，不涉及前处理。前处理方面，有效的提取和高效净化是前处理的关键，TMT与H₃TMT互为共轭酸碱，H₃TMT为三元酸，有三个离解常数，在水电离产生H₃TMT, H₂TMT^-, HTMT^2-和TMT^3-等4种形式。因此不同pH下TMT存在形式不同，如何有效的将TMT总含量进行提取和测定需要重点优化。基质方面，小麦粉基质复杂，其处理剂基质多样且差异大。面粉处理剂（改良剂），有面粉漂白剂、面团改良剂和营养强化剂等，成分较复杂。我们将面粉处理剂分为简单基质盐式处理剂和酶式处理剂，其中前者主要为各种矿物质盐和维生素C等营养元素，水溶性好，前处理简单。酶式处理剂以食用玉米淀粉、淀粉酶等复合酶等基质为主的添加剂，基质较复杂，遇水易成胶状，给提取带来较大难度。小麦粉及其添加剂基质复杂常用的净化技术有固相萃取柱法、基质固相萃取及免疫亲和柱法等等，Oasis PRiME HLB为通过型固相萃取柱，其特点是出色的除磷脂、蛋白、油脂、色素及盐等杂质，已有报道将其用于肉及肉制品、水产品、禽副产品等基质中兽药残留的检测。因此我们将通过式固相萃取与液相色谱-串联质谱法结合分析小麦粉及其处理剂中TMT的总量测定。

发明内容

本研究对小麦粉及其处理剂经乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液提取，通过式OasisPRiME HLB净化，超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱检测，外标法定量，建立了检测小麦粉及其处理剂中总三聚硫氰酸三钠盐的痕量检测方法。优化的乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液提取溶剂不仅有效的提取TMT的各种形式，还能很好的分散各种类型的面粉处理剂；采用的通过式Oasis PRiME HLB固相萃取柱无需活化和洗脱步骤，操作简单，可以有效的去干扰，降低了基体效应；优化的色谱分离条件完全满足TMT不同形式的测定。该方法简便快捷，灵敏度高，重现性好，检测效率高，特别适合小麦粉及其处理剂中总三聚硫氰酸三钠盐总量的准确定性、定量检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种超高效液相色谱-串联质谱测定小麦粉及其添加剂中三聚硫氰酸三钠盐的方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理：称取均匀样品于聚丙烯具塞离心管中，加入提取液乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液，涡旋1 min，超声15 min，8000 r/min离心5 min，得提取液；

（2）净化：准确取5 mL提取液上Oasis PRiME HLB固相萃取柱，再加1 mL乙腈进一步淋洗，合并所用流出液，加水转移定容至25.00 mL，涡旋混匀离心，过0.22 µm微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定；

（3）标准溶液的配制：准确称取10 mgTMT标准物质，用甲醇溶于10mL棕色容量瓶中，定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，0℃-4℃避光保存，移取标准储备液用乙腈-甲酸/甲酸铵溶液稀释，得到标准工作液，0℃-4℃避光保存；

（4）测定：试样用高效液相色谱进行检测分析计算。

优选地，所述的甲酸/甲酸铵缓冲溶液的pH为2.5-3，浓度为10-500 mmol/L。

更优选地，所述的甲酸/甲酸铵缓冲溶液的pH为2.5，浓度为100 mmol/L。

优选地，所述的提取液的加入量为：1 g样品中的加入乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液的总体积为20ml，乙腈与缓冲溶液的体积比为8：2。

上述所述的高效液相色谱条件为：

色谱柱：Waters HSS T3（100 mm×2.1 mm, 1.8 μm）；流动相：甲醇（A）和10 mmol/L甲酸铵缓冲溶液（pH3.0）（B），梯度洗脱程序（A）：梯度洗脱程序（A）：0~3.0 min: 2%保持；3.0~5.0 min: 2%→20%； 5.0~6.0 min: 20%→95%；6.0~8.0 min: 95%保持2 min；8.0~8.1min: 95%→2%；8.1~10.0 min: 2%保持；流速：0.3 mL/min；柱温：25 ℃；进样体积：2 µL。

上述所述的质谱条件为：

离子源: 喷射流电喷雾离子源(Jet ESI)；离子化模式：负离子模式（ESI^-）；毛细管电压: 3.0 kV; 喷嘴电压: 0 V；干燥气温度250 ℃；干燥气流速: 5 L/min；雾化器压力：45psi；鞘气温度：350 ℃；鞘气气流速: 11 L/min；扫描方式：多反应监测(MRM)；TMT的定性离子定量离子对及质谱参数为；

表 1 TMT的质谱参数

Table 1 Optimized parameters of MS/MS for TMT

有益效果

本申请首次建立了适用于小麦粉及其处理剂中TMT总量的液相色谱-串联质谱测定方法。方法优化了小麦粉及其处理剂经乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液提取体系，克服小麦粉改良剂提取易“胶化”问题。采用无需活化、净化效果好的通过式Oasis PRiME HLB固相萃取柱及优化的色谱分离条件，从提取、净化、分离三方面克服了基质复杂的面粉处理剂的特殊性和TMT存在形式的多样性带来的提取效率低的难题，实现了不同小麦粉及其改良剂中TMT总量的痕量检测方法。该方法样品前处理简便快速，定性、定量准确，灵敏度高，可满足小麦粉及其添加剂中非食用物质三聚硫氰酸钠盐总量的快速检测，对于进一步加强小麦粉相关质量控制提供技术支持。

附图说明

图1 TMT的二级全扫描质谱图；

图2 TMT在亲水色谱柱BEH Amide上的色谱图（A-NF：流动相为乙腈-甲酸/甲酸铵；WATER：流动相为乙腈-甲酸/甲酸铵；10 mmol/L，pH3.0)；

图3 TMT标准溶液色谱图；

图 4不同影响因素对TMT提取效率的影响：

图5不同净化方式对抗氧化剂回收率的影响；

图6不同定容溶剂下TMT提取色谱图比较（A：乙腈-水（体积比，10+90）；B：乙腈-甲酸/甲酸铵；10 mmol/L，pH3.0，体积比，10+90）；

图7 小麦粉、酶式改良剂样品及加标色谱图（A:小麦粉样品；B:小麦粉加标样品；C: 酶式改良剂样品；D: 酶式改良剂加标样品）。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1实验部分

1.1 材料与试剂

实验检测用的小麦粉及面粉处理剂均购自于超市。三聚硫氰酸三钠盐（TMT）标准品(adamas-beta)，纯度≥98% ；避光保存；甲醇、乙腈（色谱纯，德国默克公司）；甲酸(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）；水为超纯水；氮气（>99.999%）；固相萃取柱：Oasis®PRiMEHLB, 200 mg/6 mL，有机微孔滤膜（0.22µm, 购自上海安谱科学仪器有限公司）。

1.2 仪器与设备

Agilent1290 InfinityⅡ液相色谱系统和Agilent 6470三重四极杆液质联用系统，配有喷射流电喷雾（JetESI）电离源，使用 Agilent MassHunter 采集软件（ B.08.00版）和 Agilent MassHunter 定量分析软件（ B.07.00 版）进行数据采集和分析 (美国Agilent公司)；色谱柱： Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm i. d., 1.8 μm）。Sigma3-18K高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；超声波清洗器（宁波新芝生物科技有限公司）；MS3涡旋混合器(IKA公司)，N-EVAP-45位氮吹仪(美国Organomation公司)；SQP-电子天平（塞多利斯科学仪器有限公司）；超纯水(Milli-Q超纯水机)。

1.3方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取10 mg(精确至0.01mg)TMT标准物质，用甲醇溶于10mL棕色容量瓶中，定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，0℃-4 ℃避光保存。移取标准储备液用初始流动相稀释到适当的浓度得到标准工作液，0℃-4 ℃避光保存。

1.3.2样品前处理

提取：称取均匀样品1 g（精确至0.0001 g）于50 mL聚丙烯具塞离心管中，加入20mL乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸铵缓冲溶液（pH2.5，体积比8:2），涡旋1 min，超声15 min，8000 r/min离心5 min，待净化。

净化：准确取5 mL提取液上Oasis PRiME HLB固相萃取柱，再加1 mL乙腈进一步淋洗，合并所用流出液，加水转移定容至25.00 mL，涡旋混匀离心，过0.22 µm微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.3 基质效应

取空白基质样品，按1. 3的步骤制备空白基质溶液。分别用空白溶液和定容溶剂稀释标准储备液，得到同浓度水平的测定液。通过分别测定样品空白提取液与纯溶剂中添加同水平目标成分的响应值，计算二者的相对比值来评价基质效应（Matrix effect, ME），ME（%）=(基质匹配标准溶液响应/无基质标准溶液响应-1)×100。基质效应为负值表示存在基质抑制效应；基质效应为正值表示存在基质增强效应，0为无基质效应，绝对值越大基质效应越强。

1.3.3液相色谱条件

色谱柱：Waters HSS T3（100 mm×2.1 mm, 1.8 μm）；流动相：甲醇（A）和10 mmol/L甲酸铵缓冲溶液(pH3.0)（B），梯度洗脱程序（A）：梯度洗脱程序（A）：0~3.0 min: 2%保持;3.0~5.0 min: 2%→20% ; 5.0~6.0 min: 20%→95%；6.0~8.0 min: 95%保持2 min; 8.0~8.1 min: 95%→2%; 8.1~10.0 min: 2%保持。流速：0.3 mL/min；柱温：25 ℃；进样体积：2µL。

1.3.4质谱条件

离子源: 喷射流电喷雾离子源(Jet ESI)；离子化模式：负离子模式（ESI^-）；毛细管电压: 3.0 kV; 喷嘴电压: 0 V; 干燥气温度250 ℃; 干燥气流速: 5 L/min; 雾化器压力：45psi; 鞘气温度：350 ℃; 鞘气气流速: 11 L/min; 扫描方式：多反应监测(MRM)；TMT的定性离子定量离子对及质谱参数见表1。

表 1 TMT的质谱参数

Table 1 Optimized parameters of MS/MS for TMT

1.4 数据处理

通过与仪器配套的MassHunter色谱数据处理系统完成数据采集与处理，以及Origin 8.0进行绘图。

结果与讨论

2.1 仪器条件优化

2.1.1 质谱条件优化

TMT为带有三个巯基的三嗪类化合物，在ESI源下易电离形成负离子。将1 μg/mL的TMT标准溶液通过蠕动泵注入质谱仪，通过一级质谱扫描获得相应的母离子，并通过优化离子源质谱参数获得最优离子源参数；

TMT存在酮式和醇式两种同分异构体，从二级全扫描质谱图可以看到在负离子模式下，TMT主要以丢失一个质子后以[M-H]^-离子形式存在，且该碎片较稳定不易碎裂。优化碰撞能发现，当CE为5以下时主要以[M-H]^-准分子离子峰存在；当CE达到10时，58.1和116.8碎片出现，可以推测在此能量下杂环开始断裂，破坏稳定的环状结构仍然不是最优势反应，因此116.8碎片丰度较低；当能量达到40V时，整个环状成均裂式断裂得到丰度较高的58.1碎片。此外，58.1为不同断裂的叠加，响应较高，因此我们选在58.1为定量离子，116.8和175.8为两个定性离子。进一步优化裂解电压、碰撞能量等参数，得到目标化合物的MRM质谱参数，具体见表1。

2.1.2 色谱条件优化

TMT在反相C18色谱柱比亲水色谱柱保留稍好，且亲水色谱柱存在严重的离子交换反应，不同形式的TMT很难以统一的形式在色谱柱上存在，表现在色谱图上出现TMT不同形式的色谱峰，见图2。C18色谱柱机理上更倾向于吸附-解吸附的分离模式，因此，在控制TMT单一形式上更有优势。分别对BEH C18（50 mm×2.1 mm, 1.7 μm）、BEH C18（75 mm×2.1mm, 1.7 μm）、BEH C18（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）、HSS T3（100 mm×2.1 mm, 1.8 μm）进行考察。发现，随着柱长的增加，保留增强，在相同色谱条件下，BEH C18（100 mm×2.1 mm,1.7 μm）虽然保留上达到了要求，但是对TMT有轻微的拖尾。而HSS T3色谱柱采用三键C18烷基键合和专有的端基封尾技术，耐酸性强，对碱性化合物有很好的峰形，具有消除酚类化合物拖尾严重的问题，对于含有巯基氢的化合物也有较好的改善效果。

流动相方面，分别考察甲醇-水、乙腈-水、甲醇-10 mmol/L甲酸/醋酸铵溶液(pH3.0)、甲醇-10 mmol/L甲酸/甲酸铵溶液(pH3.0)几种流动相对目标物的影响，结果发现质子性溶剂甲醇较乙腈有更好的响应。甲醇-水不利用分子状态TMT的形成，无法较好的控制TMT的存在状态。相同pH条件下，甲酸铵缓冲溶液较醋酸铵有更好响应和峰形。此外，实验发现不同pH的流动相对TMT的色谱行为有影响较大，比较甲醇-甲酸/甲酸铵(10M，pH6.0)，甲醇-甲酸铵(10M，pH5.0)，甲醇-甲酸铵(10M，pH4.0)，甲醇-甲酸/甲酸铵(10M，pH3.0)、甲醇-甲酸/甲酸铵(10M，pH2.5)对目标物的分离效果。结果发现，随着pH降低，保留性能提高，且可以较好的缓冲不同测试液pH，控制住目标物TMT的统一存在形式。因此综合考虑，我们选择甲醇-10 mmol/L甲酸/甲酸铵溶液(pH3.0)为流动相。通过优化梯度洗脱程序，使目标物与杂质组分有效地分离，且峰形良好，TMT标准溶液色谱图见图3。

前处理条件优化

2.2.1提取溶液的选择

TMT为多元弱碱，有多个解离常数，在不同溶液中存在形式不同。且不同形式TMT溶解性差异较大，如何有效提取是方法研究的第一步。常用的复合酶面粉改良剂含有玉米淀粉及各种酶，遇水易形成胶状，无法进一步实验。因此，提取需要兼顾提取效率和样品的有效分散。分别考察甲醇、乙腈、乙腈+水（体积比，1+1）、乙腈+1%甲酸水（体积比，1+1）、乙腈+100mmNH4FA（pH3，体积比，1+1）等溶液作为提取剂的提取效果。结果发现（表2），乙腈和甲醇均能较好的分散样品，但是对于多种形式存在的TMT提取效果差，乙腈较甲醇在提取效率上略好。含有一定比例水相的乙腈+水（体积比，1+1）、乙腈+1%甲酸水（体积比，1+1）处理改良剂1（酶式改良剂）时，出现成胶现象。从结果和实验现象来看改良剂2（盐式改良剂）基质简单，在控制住TMT形式的基础上即可达到较好的提取。对于小麦粉和改良剂2乙腈+100mmNH₄FA（pH3，体积比，1+1）提取回收率同乙腈+1%甲酸水（体积比，1+1）相当，分别为95.49%和94.15%，92.1%和91.3%，对于阳性样品提取效率稍高些，10.86 mg/kg和9.17 mg/kg。该体系满足小麦粉和改良剂1（酶式改良剂）的提取效率，加标回收率均在90%以上。对于改良剂1（酶式改良剂），大多数含水溶液均易出现成胶问题，优化的甲酸铵缓冲溶液的提取体系可以较好的分散样品，不成胶，提取回收率为72.1%，较甲醇和乙腈提取回收率有所提高。因此酶式改良剂是我们关注的重点。

表2不同提取溶剂下小麦粉及面粉处理剂中TMT提取效率比较

Table 2 Average recoveries of TMT with different extraction solvent(n=3)

2.2.3缓冲盐溶液pH的选择

TMT在溶液中在不同的pH下TMT有不同的存在形式，当pH大于12.5时，TMT^3-为其主要存在形式；pH10和7分别为HTMT^2- 和H₂TMT^-两种离子进一步电离的pH环境；当pH低于4.8时H₃TMT为最主要存在形式。因此控制住提取溶液的pH环境非常有必要。我们对乙腈+100mmNH4FA（体积比1+1）提取体系的pH进一步优化。分别对pH为2，2.5，3，4，6.5几个水平进行考察，结果见图4，可以看到小麦粉和酶式面粉处理剂分别在pH为3和2.5时提取回收率及阳性结果最好，该结果与TMT的不同解离常数相吻合。小麦粉本身提取溶液pH在6.0~6.5左右，不同酶式面粉处理剂的pH在7~8左右，实验结果发现在pH2.5的缓冲溶液环境，两种基质均得到有效pH环境，随着pH值的进一步降低，TMT的提取效率变化不大。综合考虑选择pH2.5作为提取溶液的pH值。

缓冲盐溶液盐浓度的优化

TMT的提取同期解离常数有关，因此提取体系的离子强度应该对其也有一定的影响，在前面讨论中我们可以看到加入一定浓度的甲酸铵缓冲盐后，提取效率和分散效果均有明显提升，应该是溶液的离子强度对于提取效率有一定的影响。对于酶式处理剂在优化的pH下仍然存在提取不完全的问题，是否是因为溶液的离子强度未满足酶式处理剂中TMT的提取需求。我们对乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液（pH2.5，体积比1:1）的不同缓冲盐浓度进行考察，设计浓度点为10 mmol/L，20 mmol/L，50 mmol/L，100 mmol/L，200 mmol/L，500mmol/L。小麦粉中TMT的提取回收率区别不大，但是阳性样品对不同因素有明显波动，推测原因应该是通过加入标准溶液计算回收率的方式时，TMT同基质中的金属离子或杂质结合不紧密，较容易被提取。通过对阳性小麦粉的测定含量和酶式处理剂的加标回收率进行分析，发现缓冲溶液的盐浓度对TMT的提取效率有一定的影响，随着盐浓度的升高，提取效率呈升高趋势，当达到100 mmol/L时提取效率最高，进一步提高盐浓度有轻微的下降，推测原因可能是过高的盐浓度对于TMT的离子转化有抑制作用，因此我们选100 mmol/L作为提取体系的缓冲盐浓度。

提取体系中有机相含量的优化

对多元弱碱TMT不同解离常数分析发现，在pH<4.8时，主要以H₃TMT存在，该状态不易溶于水，因此需要对提取溶剂的有机相含量进行优化。对乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液（pH2.5）提取体系中40%，50%，60%，70%，80%，90%等乙腈含量进行考察。发现随着有机相的提高，TMT的提取效率呈线性升高，与我们推测的有利于TMT分子状态原因相符合。可以看到乙腈含量为80%时小麦粉和酶式处理剂的加标回收率分别达到了99.1%和96.0%，阳性样品的含量测定值为14.69 mg/kg，见图4。此外过高有机相比例，影响缓冲溶液所提供的离子强度和pH时，提取效率会有所下降，综合考虑我们选择80%的乙腈-缓冲溶液体系。酶式处理剂基质配方复杂，不同品牌差异较大，其中TMT的提取行为同小麦粉差异较大，推测原因应该是酶式处理剂中含有各种复合酶（蛋白）容易同TMT-金属离子复合物相互作用，或存在一定的包裹，提取难度较大。所优化的乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液（pH2.5，体积比8+2）提供高比例有机相和缓冲盐体系，一方面最大程度破坏蛋白等杂质的影响，可以有效分散样品；另一方面能够提高以分子状态存在的TMT目标物的提取效率。我们确定乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液（pH2.5，体积比8+2）为我们的提取溶剂。

称样量的选择

取样量是影响方法的一个直接因素，它关系到取样的代表性、方法灵敏度及方法的提取效率，综合三方面的需求才能更好的确定方法的称样量。分别对0.5 g、1g、2 g、3 g及4 g五个不同取样量进行实验，结果发现随着取样量的降低，阳性样品测定量和酶式处理剂回收理财有所提高，由于基质效应影响，4g小麦粉存在过高的加标回收率，说明过高取样量影响样品的分散和有效提取，具体见图4。小麦粉及面粉处理剂属于样品较均匀基质，综合考虑取样代表性及方法灵敏度，我们确定取样量为1g。

净化方式的选择

小麦粉及处理剂基质复杂且基质差异大，在有效的提取前提下，高效的净化方式对于测定结果定性定量的准确性及仪器的维护都是至关重要的。本实验在乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液（pH2.5，体积比8+2）提取体系提取后，进一步比较了直接提取（A）、直接提取-稀释（B）、PRiME HLB（C）、QuEChERS 1（D，C18 100mg，MgSO4 900mg）、QuEChERS 2（E，C18150mg，PSA 150mg，MgSO4 900mg）和PRiME HLB-稀释（F）四种方式，TMT在小麦粉及酶式处理剂中的平均回收率、阳性样品含量及基质效应的比较见图5。通过A、C、D、E比较发现两种QuEChERS方法比较发现QuEChERS 2中PSA可能对目标物有一定的吸附。PRiME HLB为四种方式中净化效果最好，回收率、阳性样品含量及基质效应均满足要求。PRiME HLB填料是在亲水-亲脂共聚物填料HLB基础上开发的反相固相萃取净化材料，具有极强水浸润性，无需活化和平衡步骤，操作简单，效率高，净化过程只吸附杂质，目标成分不保留，该种净化手段简便高效适用于批量样品的检测使用。稀释在一定程度上，有降低基质效应的作用，将A、B、E、F比较发现，通过直接稀释可以同PRiME HLB净化达到基本一致的效果，但其基质效应的RSD较净化后大。F净化方式为在PRiME HLB净化基础上进一步稀释，在满足灵敏度基础上，将基质效应控制到最低。采用PRiME HLB净化的前处理方法结合高灵敏度的HPLC-MS满足了TMT痕量检测要求。

定容溶剂的考察

综合考虑提取溶剂及不同溶剂对目标物色谱行为的影响，发现TMT对定溶液有一定的要求，首先是基本的溶剂效应，随着有机相的提高，TMT峰形变差，因为本方法将色谱保留时间优化在4 min之后，50%乙腈以下对TMT峰形及保留时间影响不大。其次为定溶液缓冲体系对TMT不同形式的影响，由图6可以看到乙腈-水（体积比，10+90）和乙腈-10 mmol/L，pH3.0甲酸/甲酸铵 (体积比，10+90）两种定容溶液对TMT的形式有区别，没有任何缓冲能力的乙腈-水不能很好的控制TMT的电离，在色谱图上表现为有少量离子形式的存在，而初始流动相溶液及较好的提供了溶剂环境。实验还发现一定范围的pH和盐浓度的变化对TMT的保留影响不大。鉴于提取液中甲酸铵浓度为100 mmol/L，在前处理最后稀释时选择用水稀释，标准溶液选择用初始流动相进行稀释。

方法学评价

2.3.1 线性范围、检出限和定量限

将标准储备液用初始流动相逐级稀释得质量浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、50、100、250 ng/mL的系列标准工作溶液。将系列标准工作溶液按质量浓度从低到高的顺序，按1.3.3和1.3.4条件进行测定，以TMT定量离子对的峰面积（Y）对质量浓度（X）作标准曲线。采用空白基质加标的方法，以信噪比S/N=10得到目标物的定量限(LOQ)，以信噪比S/N=3得到目标物的检出限(LOD)，检出限为0.02 mg/kg，定量限为0.05mg/kg。TMT在1.0～250 ng/mL之间线性关系良好，线性回归方程为：y = 112.23x +3.2342，R² = 0.9971。

回收率和精密度

分别在小麦粉、改良剂1、改良剂2中添加0.1、1、10.0 mg/kg三个浓度水平的TMT标准溶液，每个浓度水平重复测定6次，按照1.2所述前处理方法进行提取净化，最后经UHPLC-MS/MS测定，回收率及精密度的数据如表3所示，平均回收率在95.0%~109.6%之间，相对标准偏差均小于5.65%，小麦粉及酶式改良剂的样品及加标样品色谱图见图7。

表3 小麦粉及面粉处理剂中TMT的回收率及精密度（n=6）

Table 3 Recoveries and RSD of TMT in wheat flour and flour treatmentagents (n = 6)

2.4 基质效应

液相色谱-串联质谱具有较高的灵敏度，但基于其检测原理，存在一定的基质效应（Matrix effrct，ME），我们通过正己烷除脂结合PRiME HLB对样品提取液净化后，可以较好的去除盐、蛋白、脂肪及磷脂等干扰成分，降低样品的基质效应。按1.5步骤对小麦粉、酶式改良剂、盐式改良剂三种不同基质中TMT的基质效应进行评价。结果见图6。研究发现，TMT在不同基质中基质效应差异不大，经过优化的提取体系、PRiME HLB及进一步稀释，三种基质中TMT的基质效应基本在±5%以内，完全满足定量需求。因此，本方法采用纯溶剂标准曲线定量，减少了匹配相同空白基质的难度和难操作性及不同空白样匹配带来的差异性。

实际样品测定

应用本方法对市售的小麦粉及面粉处理剂等40 批次样品进行分析，TMT检测结果为见表4，小麦粉有3批次样品检出，面粉改良剂剂均未检出。

表4 不同小麦粉及其处理剂中TMT的检出情况

Table4 The sample of wheat flour and flour treatment agents

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种超高效液相色谱-串联质谱测定小麦粉及其添加剂中三聚硫氰酸三钠盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样品前处理：称取均匀样品于聚丙烯具塞离心管中，加入乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液，甲酸/甲酸铵缓冲溶液的pH为2.5-3、浓度为10-500 mmol/L，涡旋1 min，超声15 min，8000 r/min离心5 min，得提取液；

（3）标准溶液的配制：准确称取10 mgTMT标准物质，用甲醇溶于10 mL棕色容量瓶中，定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，0℃-4℃避光保存，移取标准储备液用乙腈-甲酸/甲酸铵溶液稀释，得到标准工作液，0℃-4℃避光保存；

（4）测定：试样用超高效液相色谱-串联质谱仪进行检测分析计算；

所述的添加剂为酶式面粉处理剂或盐式面粉处理剂；

超高效液相色谱条件为：

色谱柱：Waters HSS T3，尺寸为100 mm×2.1 mm，1.8μm；流动相：甲醇A和10 mmol/LpH3.0的甲酸铵缓冲溶液B；梯度洗脱程序：0~3.0 min: 2%A保持； 3.0~5.0 min: 2%A→20%A；5.0~6.0 min: 20%A→95%A；6.0~8.0 min: 95%A保持2 min；8.0~8.1 min: 95%A→2%A；8.1~10.0 min: 2%A保持；流速：0.3 mL/min；柱温：25 ℃；进样体积：2 µL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甲酸/甲酸铵缓冲溶液的pH为2.5，浓度为100 mmol/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提取液的加入量为：1 g样品中的加入乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液的总体积为20m L，乙腈与缓冲溶液的体积比为8：2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，质谱条件为：

离子源: 喷射流电喷雾离子源Jet ESI；离子化模式：负离子模式ESI^-；毛细管电压:3.0 kV; 喷嘴电压: 0 V；干燥气温度250 ℃；干燥气流速: 5 L/min；雾化器压力：45psi；鞘气温度：350 ℃；鞘气气流速: 11 L/min；扫描方式：多反应监测MRM。