CN109212054B

CN109212054B - 一种高效液相色谱-质谱法测定番茄碱的方法

Info

Publication number: CN109212054B
Application number: CN201810820622.7A
Authority: CN
Inventors: 胥倩; 路雅茹; 谷淑波; 李彩霞
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong guocangjian Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2018-07-24
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2038-07-24
Also published as: CN109212054A

Abstract

本发明公开了一种液相色谱‑质谱法测定番茄碱和番茄皂苷的方法，包括如下步骤：(1)对待测样品进行预处理；(2)通过液相色谱‑质谱法测定预处理后的样品中番茄碱和番茄皂苷的含量。本发明实现了对番茄样品材料中的番茄碱和番茄皂苷的同时检测，该方法精密度、准确度、稳定性均满足定量分析的要求，具有准确度高、重现性好、稳定、可靠的特点，也可用于番茄育种过程中对番茄碱含量变化的分析定量。

Description

一种高效液相色谱-质谱法测定番茄碱的方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种液相色谱-质谱法测定番茄碱和番茄皂苷的方法。

背景技术

番茄碱又名番茄素，是番茄根茎、叶、青果中产生的次生代谢物，在番茄植株中的含量最高。番茄碱能够保护番茄植株在生长过程中免受细菌、真菌、病毒和某些昆虫的侵害，有明显的抗菌、驱虫的作用。据文献报道，番茄碱能够抑制某些对人和动物有危害的病原菌，具有显著的生物活性。

番茄皂苷是从番茄中分离得到的一种水溶性皂苷类化合物，主要存在于番茄的果实中，种子、叶子、茎等部位也有相当的含量。番茄皂苷具有一般皂苷的性质，国外特别是日本的研究人员对其理化性质及生理和药理活性进行了深入研究，证明番茄皂苷具有强的降血脂、降胆固醇、抗动脉硬化、抗氧化、抑制癌细胞增殖等生理活性。

目前对于番茄碱的研究较为深入，番茄碱的检测分析方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、分光光度法(VIS-UV)、质谱法(MS)、免疫测定法(Immunoassays)等。对于番茄皂苷的检测，目前仅见有采用高效液相色谱-蒸发光散射检测番茄中番茄皂苷A的报道(卢凤来等)。还未有能同时检测番茄碱和番茄皂苷的相关报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种液相色谱-质谱法测定番茄碱和番茄皂苷的方法。该方法能快速、准确的检测番茄中番茄碱和番茄皂苷的含量。为番茄原料及其提取物的质量控制提供了保障，同时也为番茄育种提供了技术支持。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种液相色谱-质谱法测定番茄碱和番茄皂苷的方法，包括如下步骤：

(1)对待测样品进行预处理；

(2)通过液相色谱-质谱法测定预处理后的样品中番茄碱和番茄皂苷的含量。

优选的，步骤(1)中，样品预处理的方法为：将番茄材料加液氮磨成粉状，以甲醇作为溶剂进行提取，提取液离心，取上清液，过滤。

进一步的，提取方法具体为：每40mg番茄材料中加入1.5ml纯甲醇，涡旋震荡10s，4℃条件下，3000rpm离心10min，上清液过0.22μmPVDF滤膜。

番茄材料中，特别是番茄果肉中果胶含量较高，导致果肉难以充分破碎，提取不完全，并且果肉容易粘在器壁上，处理不方便，提取液难以过滤，定量不准。本发明通过向番茄材料中加液氮进行处理，方便番茄材料的粉碎，再用甲醇进行提取，不仅提取完全，而且能最大程度的减少样品中的有效成分损失，定量准确。更为重要的是，番茄材料中的成分复杂，再加之番茄碱和番茄皂苷的理化性质不同，通过一种提取方法同时将番茄碱和番茄皂苷从番茄材料中提取出来存在难度。

为此，本发明还对提取溶剂进行了优选，分别以水、纯甲醇、80％甲醇、50％甲醇、20％甲醇和乙醇作为溶剂提取同一样品，结果发现，以纯甲醇作为提取溶剂能最大程度的同时将材料中的番茄碱和番茄皂苷提取出来。

优选的，步骤(2)中，液相色谱-质谱法的色谱条件为：采用C18柱；流动相由A相和B相组成，A相为0.1％甲酸水溶液，B相为甲醇；采用梯度洗脱。

进一步的，所述梯度洗脱的程序为：0-0.2min，A相＝90％；0.2-6min，A相递减至10％；6-8min，A相＝10％；8-8.1min，A相递增至90％；8.1-10min，A相＝90％。

进一步的，所述C18柱为Thermo HYPERSIL GOLD C18色谱柱。

流动相及洗脱程序的选择直接影响液相色谱的分离效果，本发明在试验过程中对多个流动相体系进行了试验，如乙腈-水、甲醇-水，结果发现，只有甲醇-水体系能将目标峰和别的杂质峰分开，其他的流动相体系都不能将目标峰分开，而且峰形较差。为进一步改善目标峰的分离度和峰形，本发明在流动相中加入了0.1％的甲酸，极大的改善了目标峰的峰形和分离度。同时，为了使番茄碱和番茄皂苷能够得到较好的分离，本发明采用梯度洗脱，并对洗脱程序进行多次优化，最终得到最优的梯度洗脱程序为：0-0.2min，A相＝90％；0.2-6min，A相递减至10％；6-8min，A相＝10％；8-8.1min，A相递增至90％；8.1-10 min，A相＝90％，在该洗脱程序下能够在最短的时间内将番茄碱和番茄皂苷分离。

优选的，步骤(2)中，液相色谱-质谱法的质谱条件为：喷雾电压为2500V，鞘气为40Arb，辅助气为12Arb，雾化温度317℃，离子传输管温度333℃。

进一步的，所述质谱条件还包括：监测目标物番茄碱m/z 1032.543→576.391，番茄皂苷m/z 416.318→398.391，番茄碱的碰撞能量为48.629V，RF lens 159.528V，番茄皂苷的碰撞能量为30.022V，RF lens 112.809V。

优选的，步骤(2)中，采用外标法对处理后的样品中番茄碱和番茄皂苷进行定量测定。

进一步的，对番茄碱进行定量测定的标准曲线为：Y＝61804.1+944712X；对番茄皂苷进行定量测定的标准曲线为Y＝4.63303×10⁶+3.53565×10⁶X；其中Y代表分析物的峰面积，X代表分析物的浓度。

本发明还对上述所选用的参数进行了方法学验证，其中包括验证进样的精密度、方法的重复性、溶液的稳定性、方法的线性及回收率。试验结果表明，本发明所选用的高效液相色谱-质谱法参数能够满足对样品中番茄碱和番茄皂苷成分的检测分离要求。

上述方法在番茄及其提取物的质量控制和/或番茄育种中的应用也是本发明的保护范围。

本发明的有益效果：

本发明首次实现了对番茄样品材料中的番茄碱和番茄皂苷的同时检测，该方法精密度、准确度、稳定性均满足定量分析的要求，具有准确度高、重现性好、稳定、可靠的特点，可用于番茄及其提取物的质量控制，也可用于番茄育种过程中对番茄碱含量变化的分析定量。

附图说明

图1：番茄样品材料中番茄碱的出峰图。

图2：番茄样品材料中番茄皂苷的出峰图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：液相色谱-质谱法测定番茄碱和番茄皂苷

1.样品预处理：

(1)番茄材料加液氮磨成粉状，称取40mg材料于离心管中。

(2)样品加1.5ml纯甲醇，涡旋震荡10s。

(3)4℃条件下，3000rpm离心10min。

(4)取1.5ml上清中的100μl，过0.22微米PVDF滤膜，至带有内插管的玻璃进样小瓶。

2.标准工作液配制：

将番茄碱标准品(购自上海源叶生物科技有限公司，纯度>95％)用甲醇溶解，制成浓度分别为0.1ng/μl、1.0ng/μl、2ng/μl的标样；将番茄皂苷标准品(购自TRCI公司)用甲醇溶解，制成浓度分别为0.1ng/μl、1.0ng/μl、2ng/μl的标样。

3.液相色谱-质谱测定：

吸取配制好的不同浓度的番茄碱和番茄皂苷标样7μl，进行LC-MS分析，采用外标法分别建立番茄碱和番茄皂苷的标准曲线，其中，番茄碱的标准曲线为：Y＝6180.4+944712X， R²＝0.9986；番茄皂苷的标准曲线为：Y＝4.63303×10⁶+3.53565×10⁶X，R²＝0.9983；上述标准曲线中，Y代表分析物的峰面积，X代表分析物的浓度。

将预处理后的样品液7μl注入LC-MS系统进行分离分析，测得样品的峰面积，代入标准曲线，测得样品中番茄碱和番茄皂苷的含量。

液相条件：

色谱柱：Thermo HYPERSIL GOLD C18色谱柱(2.1×100，3μm)；

柱温：35℃；

流动相：A:0.1％甲酸水，B:甲醇；

洗脱梯度：0-0.2min，A＝90％；0.2-6min，A递减至10％；6-8min，A＝10％；8-8.1min， A递增至90％；8.1-10min，A＝90％；

进样体积：7μl。

流动相流速：0.3ml/min。

质谱条件：

喷雾电压：2500v；

鞘气：40Arb；

辅助气：12Arb；

雾化温度：317℃；

离子传输管温度：333℃；

离子化模式：H-ESI。

实施例2：方法学验证

1.回收率试验：

(1)取8份40mg番茄材料，加入纯甲醇提取液。

(2)其中4份材料分别加入400ng番茄碱标准品，100ng番茄皂苷标准品，并做标记。其余4份材料不加标样。

(3)按实施例1的提取流程操作，进样，跑样。

(4)数据处理，根据结果计算回收率。

回收率实验结果：

番茄碱回收率：77.51％；番茄皂苷回收率：91.66％。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种液相色谱-质谱法测定番茄碱的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）对待测样品进行预处理；

（2）通过液相色谱-质谱法测定预处理后的样品中番茄碱的含量；

步骤（2）中，液相色谱-质谱法的色谱条件为：采用C18柱；流动相由A相和B相组成，A相为0.1%甲酸水溶液，B相为甲醇；采用梯度洗脱；

所述梯度洗脱的程序为：0-0.2 min，A相=90%；0.2-6min，A相递减至10%；6-8min，A相=10%；8-8.1 min，A相递增至90%；8.1-10 min， A相=90%；

步骤（2）中，液相色谱-质谱法的质谱条件为：喷雾电压为2500V，鞘气为40Arb，辅助气为12Arb，雾化温度317 ℃，离子传输管温度333℃；

步骤（1）中，样品预处理的方法为：将番茄材料加液氮磨成粉状，以甲醇作为溶剂进行提取，提取液离心，取上清液，过滤；

提取方法具体为：每40mg番茄材料中加入1.5ml纯甲醇，涡旋震荡10s，4℃条件下，3000rpm离心10min，上清液过0.22μmPVDF滤膜。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C18柱为Thermo HYPERSIL GOLD C18色谱柱。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述质谱条件还包括：监测目标物番茄碱m/z 1032.543→576.391，番茄碱的碰撞能量为48.629V，RF lens 159.528V。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，采用外标法对处理后的样品中番茄碱进行定量测定；

对番茄碱进行定量测定的标准曲线为：Y=61804.1+944712X；其中Y代表分析物的峰面积，X代表分析物的浓度。