KR102571145B1 - 금전초의 폴리페놀-글루쿠로니드 콘쥬게이트 및 이를 이용한 금전초의 품질평가 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) 금전초 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석/탠덤(tandem) 질량 분석기(HPLC-MS/MS)로 분석하여 크로마토그램을 얻는 단계; 상기 단계 (a)에서 얻어진 크로마토그램에서 하기 폴리페놀-글루쿠로니드 콘쥬게이트(conjugate)인 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드, 아피제닌-7-O-디- 글루쿠로니드, 루테올린-7-O-글루쿠로니드 및 아피제닌-7-O-글루쿠로니드로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 지표물질로 하여 품질을 평가하는 단계를 포함하는, 금전초의 품질평가 방법에 관한 것이다.
본 발명의 풀리페놀 글루쿠로니드-콘쥬게이트의 정확한 동정 방법은 금전초 물질의 품질을 평가하는 데 매우 유용하고, 또한 폴리페놀의 이로운 효과를 제공하는데 관련된 생체내이용률 및 생리학적 단계를 연구하는 데 매우 유용하게 적용될 수 있다.
본 발명의 풀리페놀 글루쿠로니드-콘쥬게이트의 정확한 동정 방법은 금전초 물질의 품질을 평가하는 데 매우 유용하고, 또한 폴리페놀의 이로운 효과를 제공하는데 관련된 생체내이용률 및 생리학적 단계를 연구하는 데 매우 유용하게 적용될 수 있다.
Description
본 발명은 (a) 금전초 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석/탠덤(tandem) 질량 분석기(HPLC-MS/MS)로 분석하여 크로마토그램을 얻는 단계; 상기 단계 (a)에서 얻어진 크로마토그램에서 폴리페놀-글루쿠로니드 콘쥬게이트(conjugate)인 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드, 아피제닌-7-O-디- 글루쿠로니드, 루테올린-7-O-글루쿠로니드 및 아피제닌-7-O-글루쿠로니드로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 지표물질로 하여 품질을 평가하는 단계를 포함하는, 금전초의 품질평가 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 금전초 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여, 글루쿠로니드 콘쥬게이트를 순수한 상태로 분리정제하여 분취함으로써, 금전초 품질평가에 있어 폴리페놀-글리쿠로니드 콘쥬게이트 표준물질을 수득하는 방법에 관한 것이다.
금전초(glechoma hederacea longituba)는 북중국, 미국의 서부, 동부 해안 그리고 유럽과 아시아에 넓게 퍼져있는 식물이다. 금전초는 전통적으로 담석증, 요로 결석 제거, 담낭염, 황달 등의 질환의 한방치료 및 민간치료에 이용되어 온 생약소재이다. 근래에는 금전초를 항산화제, 항염증제, 항고혈압제, 저혈당증 치료제, 암세포 억제, 골괴사 치료제로도 사용한 예를 찾아볼 수 있다.
전형적으로, 금전초로부터 제조된 rosmarinic acid나 caffeic acid는 이로운 효과를 지니는 것으로 알려져있다. 금전초의 주된 구성성분은 다양한 폴리페놀, 플라보노이드, 트리터페노이드 및 에센셜 오일을 포함하는 것으로 보고되어 있다. 그 중, 폴리페놀, 플라보노이드 및 그의 유도체와 같은 친수성 물질은 수성 용매를 이용해 손쉽헤 추출가능한 물리화학적 특징을 지닌다. 금전초의 총(total) 수성 추출물은 많은 구성성분을 지니며 그 조성비가 추출물로부터 수득한 유익한 생물학적 효과에 영향을 끼칠 수 있으므로 추출물로 구성된 다양한 구성성분의 분석은 생약물질의 품질을 확인하는 것뿐만 아니라 생약을 건강보조식품이나 의약으로 사용하는 데 있어 중요하다.
따라서 금전초로부터 추출된 새로운 지표물질을 규명하고 이를 이용한 품질평가 방법을 확립하는 것이 요구된다. 액체 크로마토그래피-질량분석기 (LC-MS) 는 더 높은 감도를 제공하기 때문에 설령 미량이라 할 지라도 복잡한 군 속에서 화합물의 구조적인 분석이 가능하다.
이에, 본 발명자는 금전초의 열수 추출물로부터 폴리페놀 구성요소의 질량 분석, 더 구체적으로는 고성능 액체크로마토그래피-고해상도 및 탠덤 질량 분석기 (HPLC-HR MS/MSMS)를 통해 친수성 폴리페놀 구성성분을 효과적으로 규명하여 이를 통해 금전초의 품질을 평가할 수 있는 지표물질을 밝혀내고자 하였다. 특히 열수 추출물은 차(tea) 형태로 음용할 수 있는 직접적인 투여 형태이므로 이에 관한 발명은 매우 중요한 가치를 지닌다.
Pharmacognosy Magazine 2013 Jul-Sep; 9(35) 216-219
본 발명자는 금전초 추출물에 대하여 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석/탠덤(tandem) 질량 분석기 (HPLC-MS/MS)를 이용하여 연구에 정진한 결과 금전초의 품질평가 시 중요한 지표물질이 무엇이며 또한 그것이 어떤 화학적 구조를 가지는지 알아내고자 했다. 또한 HPLC를 이용하여 해당 지표물질을 분리정제하여 분취함으로써 금전초의 품질평가에 핵심적인 물질을 제공하고자 하였다.
본 발명의 일 측면에 따라, (a) 금전초 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석/탠덤(tandem) 질량 분석기(HPLC-MS/MS)로 분석하여 크로마토그램을 얻는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 크로마토그램에서 하기 폴리페놀-글루쿠로니드 콘쥬게이트(conjugate)인 루테올린-7-O-디- 글루쿠로니드, 아피제닌-7-O-디- 글루쿠로니드, 루테올린-7-O-글루쿠로니드 및 아피제닌-7-O-글루쿠로니드로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 지표물질로 하여 품질을 평가하는 단계를 포함하는, 금전초의 품질평가 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 (a) 단계의 금전초 추출물은 절단된 금전초를 90~100℃의 열수로 10분~2시간 동안 추출할 수 있다.
일 구현예에서, 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드의 분석은 HPLC-MS/MS 상 m/z 637.1의 값을 갖는 전구체 및 m/z 351, 285, 193, 175, 113 으로 구성되는 조각이온들을 동시에 확인할 수 있다.
일 구현예에서, 아피제닌-7-O-디-글루쿠로니드의 분석은 HPLC-MS/MS 상 m/z 621.1의 값을 갖는 전구체 및 m/z 351, 269, 193, 175, 113 으로 구성되는 조각이온들을 동시에 확인할 수 있다.
일 구현예에서, 루테올린-7-O-글루쿠로니드의 분석은 HPLC-MS/MS 상 m/z 461.1 의 값을 갖는 전구체 및 m/z 285, 175, 137, 113 으로 구성되는 조각이온들을 동시에 확인할 수 있다.
일 구현예에서, 아피제닌-7-O-글루쿠로니드의 분석은 HPLC-MS/MS 상 m/z 445.1의 값을 갖는 전구체 및 m/z 269, 175, 137, 113 으로 구성되는 조각이온들을 동시에 확인할 수 있다.
일 구현예에서, 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드 및 아피제닌-7-O-디-글루쿠로니드 각각의 함량이 5% 이상인 경우 글루쿠로니드 콘쥬게이트 함량이 우월한 것으로 판단할 수 있다.
일 구현예에서, 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드 및 아피제닌-7-O-디-글루쿠로니드 각각의 함량이 각각 2% 이하인 경우 글루쿠로니드 콘쥬게이트 함량이 열등한 것으로 판단할 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (a)의 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)의 조건에 있어 UV 검출기를 사용하고, 유속은 0.1 내지 10 mL/min이며, 이동상 용매는 이동상 A [수(water) 중 0.05~0.5% 포름산] 및 이동상 B [아세토니트릴]의 기울기 용리 (gradient elution) 방법을 사용할 수 있다. UV 검출기의 파장은 바람직하게는 220 ~ 400 nm이고 더욱 바람직하게는 270 ~ 290 nm이다. 또한 자명하게도, 폴리페놀-글루쿠로니드 콘쥬게이트들에 대한 본 크로마토그래피 분석방법은 대용량 분취용 조건에서 이들 콘쥬게이트 들의 분리 및 정제에 활용될 수 있다.
일 구현예에서, 품질평가하는 금전초 추출물은 원산지가 한국일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여, 상기 금전초 추출물 중 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드, 아피제닌-7-O-디- 글루쿠로니드, 루테올린-7-O-글루쿠로니드 또는 아피제닌-7-O-글루쿠로니드를 순수한 상태로 분리정제하여 분취하는 방법이 제공된다.
본 발명의 발명자는 HPLC-HR MS를 이용한 정확한 분자량 측정 및 탠덤 질량 분석의 잘 조절된 조건 하에서 탠덤 질량 데이터를 해석하여, 금전초 열수 추출물로부터 다양한 폴리페놀과 그의 글루쿠로니드-콘쥬게이트를 확인하고 이를 금전초의 품질을 평가하는 지표물질로 삼을 수 있음을 밝혀냈다. 특히 여러 곳에서 채취된 금전초 추출물의 폴리페놀 디-글루쿠로니드-콘쥬게이트, 더 자세히는 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드 및 아피제닌-7-O-디-글루쿠로니드의 함량을, 가장 품질이 뛰어난 것으로 알려진 괴산 산 금전초의 추출물의 지표물질 함량과 비교함으로서 금전초의 품질을 평가할 수 있음을 밝혀냈다.
따라서, 본 발명에 따른 품질평가 방법은 금전초를 의약품이나 건강보조식품 등으로 사업화할 때 의료분야나 건강식품 업계에서 품질관리로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 금전초의 추출에서 탠덤 질량 분석까지 전체적인 흐름도를 나타낸다.
도 2는 괴산에서 채취된 검체 GS19의 HPLC 크로마토 그램을 나타낸다.
도 3은 금전초 추출물에서 본 발명의 분석기술을 통해 구조가 규명된, 주된 구성성분인 4종의 폴리페놀 글루쿠로니드-콘쥬게이트의 화학 구조를 나타낸다.
도 4는 산청에서 채취된 검체 SC18의 HPLC 크로마토 그램을 나타낸다.
도 5는 GS(괴산), HS(홍성), IS(익산), SC(산청), YC(영천)의 각 지역별 시료에 따른 모노-글루쿠로니드-콘쥬게이트의 양을 나타낸 것이다.
도 6은 GS(괴산), HS(홍성), IS(익산), SC(산청), YC(영천)의 각 지역별 시료에 따른 디-글루쿠로니드-콘쥬게이트의 양을 나타낸 것이다.
도 7은 SYNAPT G2, HR-ESI-MS/MS로부터 얻은 아피제닌-7-O-디-글루쿠로니드의 텐덤 질량 스펙트럼 및 조각 패턴을 나타낸다.
도 8은 SYNAPT G2, HR-ESI-MS/MS로부터 얻은 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드의 텐덤 질량 스펙트럼 및 조각 패턴을 나타낸다.
도 2는 괴산에서 채취된 검체 GS19의 HPLC 크로마토 그램을 나타낸다.
도 3은 금전초 추출물에서 본 발명의 분석기술을 통해 구조가 규명된, 주된 구성성분인 4종의 폴리페놀 글루쿠로니드-콘쥬게이트의 화학 구조를 나타낸다.
도 4는 산청에서 채취된 검체 SC18의 HPLC 크로마토 그램을 나타낸다.
도 5는 GS(괴산), HS(홍성), IS(익산), SC(산청), YC(영천)의 각 지역별 시료에 따른 모노-글루쿠로니드-콘쥬게이트의 양을 나타낸 것이다.
도 6은 GS(괴산), HS(홍성), IS(익산), SC(산청), YC(영천)의 각 지역별 시료에 따른 디-글루쿠로니드-콘쥬게이트의 양을 나타낸 것이다.
도 7은 SYNAPT G2, HR-ESI-MS/MS로부터 얻은 아피제닌-7-O-디-글루쿠로니드의 텐덤 질량 스펙트럼 및 조각 패턴을 나타낸다.
도 8은 SYNAPT G2, HR-ESI-MS/MS로부터 얻은 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드의 텐덤 질량 스펙트럼 및 조각 패턴을 나타낸다.
본 발명은 (a) 금전초 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석/탠덤(tandem) 질량 분석기 (HPLC-MS/MS)로 분석하여 크로마토그램을 얻는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 크로마토그램에서 하기 폴리페놀-글루쿠로니드 콘쥬게이트(conjugate)인 루테올린-7-O-디- 글루쿠로니드, 아피제닌-7-O-디- 글루쿠로니드, 루테올린-7-O-글루쿠로니드 및 아피제닌-7-O-글루쿠로니드로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 지표물질로 하여 품질을 평가하는 단계를 포함하는, 금전초의 품질평가 방법을 제공한다.
상기 단계(a)의 금전초 추출물은 절단된 금전초를 90~100℃의 열수로 10분~2시간 동안 추출하며, 더 바람직하게는 95~100℃의 열수로 10분~1.5시간으로 추출한다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)의 조건은 유속 0.1 내지 10 mL/min, 더 바람직하게는 0,5 내지 5 mL/min이고, UV 검출기를 사용하며, 이동상 용매는 이동상 A [수(water) 중 0.05~0.5% 포름산] 및 이동상 B [아세토니트릴]의 기울기 용리 (gradient elution) 방법을 사용할 수 있다. UV 검출기의 파장은 바람직하게는 220 ~ 400 nm이고 더욱 바람직하게는 270 ~ 290 nm이다.
본 발명의 금전초 품질평가 방법의 지표물질 중 하나인 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드의 분석은 HPLC-MS/MS 상 m/z 637.1의 값을 갖는 전구체 및 m/z 351, 285, 193, 175, 113 으로 구성되는 조각이온들을 동시에 확인하여 동정할 수 있다.
본 발명의 금전초 품질평가 방법의 지표물질 중 하나인 아피제닌-7-O-디-글루쿠로니드의 분석은 HPLC-MS/MS 상 m/z 621.1의 값을 갖는 전구체 및 m/z 351, 269, 193, 175, 113 으로 구성되는 조각이온들을 동시에 확인하여 동정할 수 있다.
본 발명의 금전초 품질평가 방법의 지표물질 중 하나인 루테올린-7-O-글루쿠로니드의 분석은 HPLC-MS/MS 상 m/z 461.1 의 값을 갖는 전구체 및 m/z 285, 175, 137, 113 으로 구성되는 조각이온들을 동시에 확인하여 동정할 수 있다.
본 발명의 금전초 품질평가 방법의 지표물질 중 하나인 아피제닌-7-O-글루쿠로니드의 분석은 HPLC-MS/MS 상 m/z 445.1의 값을 갖는 전구체 및 m/z 269, 175, 137, 113 으로 구성되는 조각이온들을 동시에 확인하여 동정할 수 있다.
또한, 본 발명은 금전초 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 폴리페놀-글루쿠로니드 콘쥬게이트를 순수한 상태로 분리정제하여 분취하는 방법을 제공한다.
이상에서와 같이 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석/탠덤(tandem) 질량 분석기를 이용한 본 발명의 금전초 품질 방법은 전국의 자생지에 따른 금전초 생약 추출물들에 대한 각 분석지표 성분의 특성을 지도화하여, 금전조를 건강보조식품이나 의약으로 사업화할 때 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
1. 금전초 추출물의 제조
금전초의 폴리페놀 구성성분을 효과적으로 분석하기 위한 방법을 다음과 같이 설계하였다. 금전초 추출물은 알코올 유기용매 대신 정제된 열수를 사용하여 제조되었고 HPLC-MS 분석에 돌입하기 전 친수성 PVDF 멤브레인 필터를 이용하여 여과하였다.
추출물 속의 각 구성성분의 정확한 분자량을 측정하기 위해 고성능 액체크로마토그래피-고분해능 질량분석을 사용했고 탠덤 질량 데이터의 해석은 잘 통제된 조각 (fragment) 조건을 통해 얻었다. 제조된 금전초 추출물은 UV 검출기 및 SYNAPT G2 질량 스펙트로메터를 구비한 HPLC를 통해 비-특이적 스크리닝을 수행하였다. 눈에 띄는 피크 리스트(peak list)는 UV 검출기에 의해 기록된 HPLC 크로마토그래피 상 유의한 피크 강도와 더불어 동시에 토탈 이온 크로마토그래피 (TIC) 상 좋은 신호 강도를 가진 단일 분리된 전구체 분자량을 통해 확립되고 구성되었다. 피크 리스트에 포함된 각 화합물의 정확한 분자량은 TIC로부터 유래한 추출 이온 크로마토그래피 (EIC)를 사용하여 측정되었다. 각 구성성분의 조각 특성은 탠덤 질량분석기를 통해 측정했다.
2. 샘플 제조
금전초 물질은 가장 품질이 좋기로 알려진 괴산 및 그 외 여러 지역에서 채취하였다. 채취된 금전초는 약 25℃에서 건조되었다. 건조된 금전초 샘플은 잎과 줄기를 포함한 식물 전체로서 2~3 mm의 슬라이스로 절단되었다. 5 g의 금전초 슬라이스를 100 mL의 정제수에 쏟아 넣었다. 약 100℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 제조된 열수 추출물은 25℃ 까지 냉각되었다. 생약 물질의 잔여물은 셀룰로즈 필터를 동한 여과로 제거하였고 그에 따라 추출물의 부피는 조정되었다. 추출물의 각각의 분량은 -20℃에서 저장되었다. 분석 바로 직전, 정량적으로 3회 분석하기 위해 샘플을 상온에서 해동시키고 밀렉스-HV 친수성 PVDF 멤브레인 필터 유니트 (13 mm, 0.45 μm)를 사용해 여과했다.
3, HPLC 및 질량 분석 조건
폴리페놀 화합물의 구조는 SYNAPT G2를 통해 규명하였다. 고해상도 일렉트로스프레이 이온화 질량 스펙트로미터 (Waters)가 HPLC LC-20AD 펌프 및 SPD-20A UV/VIS 검출기 (시마추, 교토, 일본)과 커플링되었다. 크로마토그래피의 분리는 25℃의 온도로 ZORBAX 이클립스 C18 컬럼 (팔로알토, 캘리포니아, 미국) 상에서 수행되었다.
고성능 액체 크로마토그래프의 조건은 다음과 같다.
- 유속 1.0 mL/min
- 샘플 주입 부피 5 μL
- 이동상 A [수(water) 중 0.2% 포름산] 및 이동상 B [100% 아세토니트릴]. 두 이동상은 기울기 용리 (gradient elution) 프로그램을 이용했으며 그 조건은 다음과 같다. 0~1분, 3-6% B; 1~80분, 20-80% B; 94~99분, 80-80% B; 99~100분, 80-3% B; 100~110 분, 3-3%.
구비된 분석기기는 하이브리드 탠덤 4중 IMS-TOF로서, SYNAPT G2는 40,000의 해상도를 보였는데 (최고치 절반에서의 온전한 폭, FWHM), 9+ 전위 상태의 단일동위 해상도 (ESI)를 나타냈다. 스캔 속도는 20 spectra/sec 였다. 이온화 방법은 일렉트로스프레이 이온화 (ESI)를 사용하였다. 다른 MS 파라미터는 소스 온도 100℃, 탈용매화 온도 300℃, 탈용매화 기체 후속 800 L/h, capilliary 전압 (CV) 2000 V로 확립했다. 검출 과정을 도 1 에 간략히 정리하였다.
4, HPLC를 이용한 폴리페놀 화합물의 분취
상기에서 구조가 규명된 폴리페놀 화합물을 분취하기 위하여 HPLC을 이용해 업스케일을 실시하였다. 농축된 금전초 추출 시료를 4.6 x 150 mm 사이즈의 ZORBAX 이클립스 C18 컬럼 (팔로알토, 캘리포니아, 미국)을 사용하여 각 피크의 retention time에서 ±1분(min) 되는 구간에서 이동상을 취하여 진공건조함으로써 금전초 품질평가의 표준품인 폴리페놀 화합물을 분취하였다.
분취 시 고성능 액체 크로마토그래프의 조건은 다음과 같다.
- 유속 1.0 mL/min
- 샘플 주입 부피 20 μL
- 이동상 A [수(water) 중 0.2% 포름산] 및 이동상 B [100% 아세토니트릴]. 두 이동상은 기울기 용리 (gradient elution) 프로그램을 이용했으며 그 조건은 다음과 같다. 0~1분, 3-6% B; 1~80분, 20-80% B; 94~99분, 80-80% B; 99~100분, 80-3% B; 100~110 분, 3-3%.
4. 결과
1) 폴리페놀 화합물의 검출과 동정
도 2는 괴산지역에서 채취된 금전초 추출물의 HPLC 분석 결과를 보여준다. UV 280 nm 에서 여러 피크가 나타났다. 각 4개의 검출된 피크의 고해상도 및 탠덤 질량 분석 데이터를 표 1 및 표 2에, 지표물질 4개의 피크를 형성하는 구성물질의 화학구조를 도 3에 정리하였다.
표 1
표 2
도 4는 산청 (SC) 출처의 금전초 추출물의 HPLC 분석 결과를 보여준다. 디-글루쿠로니드-콘쥬게이트의 양이 괴산 산 금전초에 비해 거의 미미하다는 것을 알 수 있다. 표 3은 다양한 지역에서 채취한 금전초의 추출물에 있어 지표물질 4개의 화합물의 조성비를 비교한 것이고, 도 5 및 도 6은 각각 모노-글루쿠로니드-콘쥬게이트 및 디-글루쿠로니드-콘쥬게이트 조성비를 그래프로 나타낸 것이다.
기존의 발명과는 다르게 본 발명의 구성물질은, 폴리페놀-글시코사이드 콘쥬게이트 보다는 표 1에 나타난 것처럼 폴리페놀-글루쿠로니드 콘쥬게이트가 더 중요한 구성요소로 드러났다.
2) 탠덤 MS에 의한 폴리페놀 화합물의 구조적 확인
30 V의 충돌 에너지에서 얻어진 아피제닌-7-O-디-글루쿠로니드 MS/MS 스펙트럼을 조사한 결과 (도 7), 이온 질량 값의 전구체로서 m/z 금전초를 품질평가하는 방법에서 유래한 조각이온은 m/z 351, 269, 193, 175, 131 및 113에서 검출되었다. 질량값 m/z 351은 di-glucuronic acid 조각을 초래했고, m/z 169 및 m/z 351은 각각 아피제닌 및 글루쿠로니드에서 유래한 것임이 드러났다. 다른 m/z 값은 아피제닌-7-O-디-글루쿠로니드의 분해산물임이 밝혀졌다.
또 다른 전형적 폴리페놀 글루쿠로니드-콘쥬게이트인 루테올린-7-O- 디-글루쿠로니드 (Rt=53.66분)은 실험적으로 m/z 637.1에서 0.418 ppm의 질량 정확도로 실험적으로 검출되었다. 30 V의 충돌 에너지에서 얻어진 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드의 MS/MS 스펙트럼을 조사한 결과 (도 8), 이온 질량 값의 전구체로서 m/z 637.1에서 유래한 조각이온은 m/z 351,285,193,175,131 및 113에서 검출되었다.
질량값 m/z 351은 di-glucuronic acid의 조각을 초래했고, m/z 285 및, m/z 193은 각각 루테올린 및 글루쿠로니드에서 유래한 것임이 드러났다. 다른 m/z 값은 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드의 분해산물임이 밝혀졌다. 아피제닌-7-O-디-글루쿠로니드 및 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드를 포함한 금전초 추출물의 주 구성성분으로 확인된 탬덤 질량 분석기의 결과는 표 2에 요약되어 있다.
금전초 추출물의 주 구성성분은 폴리페놀 aglycone보다는 작은 분자량의 폴리페놀 및 친수성 폴리페놀-당(sugar) 콘쥬게이트였는데 이는 추출을 알코올 용매 대신 정제된 열수로 수행했기 때문이다. 아피제닌 및 루테올린 같은 친수성이 적은 aglycone은 신호강도가 거의 흔적 정도로 검출되었고 탠덤 질량 분석기에 적용할 수 없었다. 전구체 질량값 m/z 445.0765로 검출된 화합물은 아피제닌-7-O-모노-클루쿠로니드 콘쥬게이트에 대응했는데 이는 디-글루코로니드의 값보다 176.0326 낮은 질랑값이다. 이러한 질량 차이는 글루쿠로니드 모노머 유닛의 질량값에 대응하는 것이다. 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드 및 그의 모노-글루쿠로니드-콘쥬게이트의 질량 차이는 역시 176.0332로 측정되었다.
본 발명에서 HPLC-HR MS을 이용한 정확한 분자량 측정 및 탠덤 질량 분석의 잘 조절된 조건 하에서 탠덤 질량 데이터를 해석하여, 금전초 열수 추출물로부터 다양한 폴리페놀과 그의 글루쿠로니드 콘쥬게이트를 확인했다. 기존의 발명에서는 HPLC 및 또는 질량 분석법을 통해 금전초 추출물의 주된 폴리페놀 구성성분의 정밀한 입증을 시도하였다. 본 발명에서도 예를 들어 메탄올-수성 추출물의 HPLC 분석을 통해 chlorogenic acid, caffeic acid, 아피제닌-7-O-글루코시드 및 rosmarinic acid가 확인되었다. 기존에는 루테올린-7-O-글루코시드, 루테올린 및 아피제닌 같은 15종의 페놀 성분을 주성분으로 하여 원산지를 판별하는 것이 보고되었다. 의미 있는 신호 강도로 폴리페놀 글리코시드 콘쥬게이트가 검출되지 않은 반면 rosmarinic acid는 여전히 주된 구성성분으로 분석되었다.
3) HPLC를 이용한 폴리페놀 화합물의 분취
상기에서 구조가 규명된 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드, 아피제닌-7-O-디-글루쿠로니드, 루테올린-7-O-글루쿠로니드 및 아피제닌-7-O-글루쿠로니드을 업스케일된 HPLC 시스템을 이용하여 정제분리하여 분취에 성공하였다. 분취된 폴리페놀 글루쿠로니드 콘쥬게이트를 다시 용매에 희석하여 단일 크로마토그램을 얻고 이를 금전초 추출물의 HPLC 크로마토 그램과 대조한 결과 동일한 retention time을 지님을 확인할 수 있었다.
4) 다양한 지역에서 채취된 금전초 시료의 품질평가
금전초 추출물의 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석/탠덤 질량 분석기를 이용한 품질평가 방법의 산업적 유효성을 확인하기 위해 국내 여러 지역에서 채취된 시료를 가지고 지표물질의 함량에 있어 비교분석을 수행하였다.
지역별 시료에 따른 루테올린의 모노-글루쿠로니드-콘쥬게이트 및 아피제닌의 모노-글루쿠로니드-콘쥬게이트의 함량을 도 5에 나타냈다. 지역별 시료에 따른 루테올린의 디-글루쿠로니드-콘쥬게이트 및 아피제닌의 디-글루쿠로니드-콘쥬게이트의 함량을 도 6에 나타냈다.
폴리페놀의 모노-글루쿠로니드-콘쥬게이트의 경우, 각 지역별 시료에 따른 함량 차이는 크지 않았다. 전반적으로 함량이 0 ~ 5% 사이로, 평균 2.9%를 보여주었다. 폴리페놀의 디-글루쿠로니드-콘쥬게이트의 경우, 특별히 괴산(GS) 시료에서 약 10% 정도로 높은 함량을 보였는데 이는 앞의 모노-글루쿠로니드-콘쥬게이트의 함량 평균보다도 현저히 높은 것이다. 반면 타 지역 시료에서는 폴리페놀의 디-글루쿠로니드-콘쥬게이트가 거의 검출이 안 되거나 흔적 정도의 매우 낮은 함량을 보였다. 각 시료들의 HPLC 크로마토그램 상의 피크들 중에서, 글루쿠로니드 컨쥬게이트들의 함량 또는 조성비(%)를 표 3에 나타내었다.
표 3
5) 결론
본 발명자는, 기존에 밝혀진 것과는 달리 폴리페놀의 글루쿠로니드-콘쥬게이트, 특히 디글루쿠로니드-콘쥬게이트가 국내산 금전초들의 품질을 평가하는 데 있어 핵심적인 화합물이라는 것을 입증하였다. 이는 금전초의 품질평가 뿐 아니라 표준화를 위한 핵심기술이 될 수 있다. 더하여, 많은 in vitro 연구에서 폴리페놀의 이로운 효과에 대한 많은 연구의 해석은 본 발명에서 검출된 폴리페놀 클리쿠로니드 같은 활성 대사물보다는 폴리페놀 아글리콘이나 폴리페놀 글리코사드-콘쥬게이트에 기반하고 있다. 따라서, 본 발명에서 규명된 금전초 추출물 유래 글루쿠로니드 콘쥬게이트 지표물질들은 분취용 대용량 HPLC 방법에 의하여 분리정제 됨으로써, 다양한 폴리페놀 유도체들의 이로운 효과를 연구하기 위한 표준물질로 제조 활용될 수 있다.
폴리페놀 글루쿠로니드-콘쥬게이트는 창자세포에서의 생체내이용률 및 식이 폴리페놀의 생체적 활성에 영향을 주는 활성 대사물로 알려져 있다. 많은 in vitro 연구에서 폴리페놀의 이로운 효과에 대한 많은 정보만 제공함에도 불구하고 그러한 연구의 해석은 본 발명에서 검출된 폴리페놀 클리쿠로니드 같은 활성 대사물보다는 폴리페놀 아글리콘이나 폴리페놀 글리코사드-콘쥬게이트에 기반하고 있다.
In vitro 및 in vivo 연구에서 폴리페놀 물질의 생체내이용률의 중요성을 생각할 때, 생리학적인 단계에서 어떤 타입의 폴리페놀이 실질적인 역할을 하는지에 대해 정확하게 이해하는 것에 대하여 방대한 관심이 요구되는 실정이다. 그러므로, 풀리페놀 글루쿠로니드-콘쥬게이트의 정확한 동정 방법은 금전초 물질의 품질을 평가하는 데 매우 유용하고, 또한 폴리페놀의 이로운 효과를 제공하는데 관련된 생체내이용률 및 생리학적 단계를 연구하는 데 매우 유용하게 적용될 수 있다.
Claims (11)
- (a) 금전초 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석/탠덤(tandem) 질량 분석기 (HPLC-MS/MS)로 분석하여 크로마토그램을 얻는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 크로마토그램에서 하기 폴리페놀-글루쿠로니드 콘쥬게이트(conjugate)인 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드, 아피제닌-7-O-디-글루쿠로니드, 루테올린-7-O-글루쿠로니드 및 아피제닌-7-O-글루쿠로니드로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 지표물질로 하여 품질을 평가하는 단계를 포함하는, 금전초의 품질평가 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 금전초 추출물은 절단된 금전초를 90~100℃의 열수로 10분~2시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는, 금전초의 품질평가 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드의 분석은 HPLC-MS/MS 상 m/z 637.1의 값을 갖는 전구체 및 m/z 351, 285, 193, 175, 113 으로 구성되는 조각이온들을 동시에 확인하는 것을 특징으로 하는, 금전초의 품질평가 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 아피제닌-7-O-디-글루쿠로니드의 분석은 HPLC-MS/MS 상 m/z 621.1의 값을 갖는 전구체 및 m/z 351, 269, 193, 175, 113 으로 구성되는 조각이온들을 동시에 확인하는 것을 특징으로 하는, 금전초의 품질평가 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 루테올린-7-O-글루쿠로니드의 분석은 HPLC-MS/MS 상 m/z 461.1 의 값을 갖는 전구체 및 m/z 285, 175, 137, 113 으로 구성되는 조각이온들을 동시에 확인하는 것을 특징으로 하는, 금전초의 품질평가 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 아피제닌-7-O-글루쿠로니드의 분석은 HPLC-MS/MS 상 m/z 445.1의 값을 갖는 전구체 및 m/z 269, 175, 137, 113 으로 구성되는 조각이온들을 동시에 확인하는 것을 특징으로 하는, 금전초의 품질평가 방법.
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- 제1항에 있어서, 상기 금전초 추출물은 원산지가 한국인 것을 특징으로 하는, 금전초의 품질평가 방법.
- 제1항 내지 제6항 및 제10항 중 어느 한 항의 금전초 추출물 중, 루테올린-7-O-디-글루쿠로니드, 아피제닌-7-O-디-글루쿠로니드, 루테올린-7-O-글루쿠로니드 또는 아피제닌-7-O-글루쿠로니드를 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 순수한 상태로 분리정제하여 분취하는 방법.
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