CN103115985A - Hplc-dad法同时测定苦碟子注射液中六种黄酮类成分的方法 - Google Patents
Hplc-dad法同时测定苦碟子注射液中六种黄酮类成分的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中六种黄酮类成分的方法。其步骤如下：（1）对照品溶液的制备。（2）供试品溶液的制备。取苦碟子注射液，用0.45μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液，待测。（3）测定法:采用HPLC-DAD法分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入检测器，测定，即得。色谱条件：色谱柱：DiamonsilC18；甲酸-水（A）甲酸-乙腈（B）；0-10min：90%A-81%A；10-26min：81%A-80%A；26-36min：80%A-72%A；36-40min：72%A-70%A；40-50min：70%A-70%A；检测波长：330nm；流速：1mL/min；柱温：35℃；进样量10μL。该方法简便、快速，结果可靠，重现性好，可应用于测定苦碟子注射液中的多种黄酮类成分。
Description
技术领域
本发明涉及一种HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中六种黄酮类成分的方法。属于中药成分分析领域。
背景技术
在现有技术中，苦碟子别名满天星，苦荬菜，主要分布于我国东北及内蒙古等地，为菊科植物抱茎苦荬菜(Ixeris sonchifolia(Bge.)Hance)的当年生干燥全草，性寒，味苦、辛，具有清热解毒、排脓止痛之功效[1]。苦碟子(碟脉灵)注射液是以苦碟子为原料提取精制而成的静脉注射液, 具有活血化瘀，改善微循环的作用[2]。该注射液已上市多年，疗效确切。实验研究表明，苦碟子注射液化学成分比较复杂，而与其临床疗效相关的主要活性成分为有机酸类、黄酮类和核苷类成分。
苦碟子注射液（曾用名：碟脉灵注射液）列入国家药品标准产品（国药准字Z20025450），由通化华夏药业有限责任公司生产。
处方：抱茎苦荬菜1000g，制成1000ml。
制法：取抱茎苦荬菜，加水煎煮二次，第一次1小时，第二次0.5小时，合并煎液，浓缩至每1ml相当于原生药0.5g，放冷至40℃以下，在搅拌下加10%氧化钙乳调节pH值至10，放置12小时，离心，离心沉淀物称重，悬浮于5.3倍量95%乙醇中（使含醇量达80%），加50%硫酸溶液调节pH值至3－4，充分搅拌使反应完全，离心，离心液加40%氢氧化钠溶液中和pH值至7.0，滤过，滤液回收乙醇，并挥尽乙醇，用注射用水稀释至每1ml相当于原生药4g，置-5℃以下放置12小时以上，滤过，滤液加0.1－0.2%药用活性炭粉末，煮沸15分钟，置-5℃以下放置24小时以上，滤过，滤液加注射用水稀释至规定量，调节pH值至7.0－7.5，滤过，灌封，灭菌，即得。性状：本品为浅黄棕色至黄棕色的澄明液体。
含量测定：本品每10ml含总黄酮以无水芦丁（C27H30O16）计，不得少于4.0mg。含抱茎苦荬菜以腺苷（C10H12N5O4）计，不得少于0.025mg。
功能主治：活血止痛，清热祛瘀。用于瘀血闭阻的胸痹，证见：胸闷、心痛，口苦，舌暗红或存瘀斑等。适用于冠心病、心绞痛见上述病状者。亦可用于脑梗塞者。
用法用量：静脉滴注，一次10－40ml，一日1次；用5%葡萄糖或0.9%氯化钠注射液稀释至250－500ml后应用；14天为一疗程；或遵医嘱。
规格：每支装（1）10ml，（2）20ml，（3）40ml。
实验研究表明，苦碟子注射液化学成分比较复杂，而与其临床疗效相关的主要活性成分为有机酸类、黄酮类和核苷类成分。
黄酮类成分在此注射液中含量丰富，且有研究表明，苦碟子总黄酮可明显缩小心肌梗死面积，降低心肌缺血程度及缺血范围；通过提高内源性抗氧化酶活性，减轻氧自由基的损伤，降低血小板粘附功能和聚集功能，纠正心肌缺血时FFA代谢紊乱，减少缩血管物质生成，保持PGI2/TXA2生理平衡，改善心肌代谢和血流动力学，平衡心肌供氧与需氧，改善心肌舒缩功能等多种途径发挥抗心肌缺血作用是其主要活性成分。
因此，《国家中成药标准汇编》以总黄酮含量作为苦碟子注射液质量控制的指标，规定总黄酮以芦丁为对照，按分光光度法测定。由于紫外分光光度法专属性不强，且芦丁也并非注射剂中所含有的黄酮，测定结果不能准确反映注射剂中真实的黄酮类成分含量，所以此法存在一定的缺陷。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足而提供一种HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中六种黄酮类成分的方法，该方法简便、结果可靠、重现性好，可应用于测定苦碟子注射液中的多种黄酮类成分。
本发明的技术解决方案是：一种HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中六种黄酮类成分的方法，其苦碟子注射液由抱茎苦荬菜1000g制成1000ml，其特征在于步骤如下：
（1）对照品溶液的制备：
分别精密称取木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷LGCRP、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷AGCRP；木犀草素LI、芹菜素AGI、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷LGCOP、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷AGCOP对照品，加甲醇溶解并稀释成质量浓度分别为140.0、160.0、16.00、120.0、16.00、10.00 μg·mL-1的混合溶液，超声溶解，即得混合对照品储备液，待用。
（2）供试品溶液的制备：
取苦碟子注射液（药品成品），用0.45 μ m微孔滤膜过滤，作为供试品溶液，待测。
（3）测定法: 采用HPLC-DAD法分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入检测器，测定，即得。
色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18；甲酸-水（A）甲酸-乙腈（B）；0-10 min：90% A-81% A；10-26 min：81% A-80% A；26-36 min：80% A-72% A；36-40 min：72% A-70% A；40-50 min：70% A-70% A；检测波长：330 nm；流速：1 mL / min；柱温：35 ℃；进样量10 μL。
上述步骤（3）测定法中包括线性关系测定；即精密量取混合对照品储备液5mL置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为70.00、80.00、8.000、60.00、8.000、5.000 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为35.00、40.00、4.000、30.00、4.000、2.500 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为17.50、20.00、2.000、15.00、2.000、1.250 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为8.750、10.00、1.000、7.500、1.000、0.625 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为4.375、5.000、0.500、3.750、0.500、0.313 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为2.188、2.500、0.250、1.875、0.250、0.156 μg·mL-1的混合溶液；此为系列标准溶液；取系列标准溶液10 mL，将得到的7不同浓度的混合对照品溶液按色谱条件下进行分析并记录峰面积。
上述步骤（3）测定法中包括精密度测定；即精密吸取低、中、高三种浓度的混合标准品溶液：低浓度 木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素的浓度分别为 8.750、10.00、1.000、7.500、1.000、0.625 μg·mL-1的混合溶液；中浓度分别为 17.50、20.00、2.000、15.00、2.000、1.250 μg·mL-1的混合溶液；高浓度分别为35.00、40.00、4.000、30.00、4.000、2.500 μg·mL-1的混合溶液，在色谱条件下，每种浓度重复进样6次，每次10 μL，计算各对照品色谱峰面积以及相对标准偏差。
上述步骤（3）测定法中包括重复性实验；即取供试品溶液，在色谱条件下，分别进样分析6次，每次10 μL，计算各对照品色谱峰面积和相对标准偏差。
上述步骤（3）测定法中包括稳定性实验；即取供试苦碟子注射液 ，室温放置，于0、2、4、6、8、12 h进样，在色谱条件下进样分析，记录峰面积。
上述步骤（3）测定法中包括回收率实验；即精密量取苦碟子注射液 5.0 mL，平行6份，分别置于10 mL量瓶中，分别精密加入混合对照品储备液5.0 mL，其中木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷 70.00 μg·mL-1、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷 77.00 μg·mL-1、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷 0.56 μg·mL-1、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷 18.00 μg·mL-1、木犀草素0.40 μg·mL-1、芹菜素 0.24 μg·mL-1摇匀，在色谱条件下进样分析，记录峰面积，计算加样回收率。
本发明的优点是：本发明建立了HPLC-DAD同时测定注射液中6种黄酮类成分的方法并且测定了苦碟子注射液种的黄酮类成分的含量。6种黄酮类成分含量范围是0.12-93.42 μg·mL-1，约占苦碟子注射液总固体含量的8.25 %(注射液总固体含量为20.96 mg/支10 mL)。该方法简便、快速，结果可靠，重现性好，可应用于测定苦碟子注射液中的多种黄酮类成分。
下面将结合附图、实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。
附图说明
图1是本发明对照溶液的高效液相色谱图。
图2是本发明供试溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例
HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中六种黄酮类成分的方法：
1.仪器与试药
1.1仪器 Waters 2695 HPLC系统，包括四元梯度泵，在线真空脱气机，自动进样器，恒温柱箱，2998 DAD检测器，Empower 2 工作站；色谱柱Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）迪马科技有限公司；Satorius BT 125D型十万分之一电子分析天平(北京赛多利斯公司)；KH 2200B型超声波清洗器 (昆山禾创超声仪器有限公司)。
1.2 材料 对照品木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷 (由通化华夏药业有限公司提供，含量> 98.00%)；芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷 (批号120229，购自成都瑞芬思生物科技有限公司，含量> 98.00%)；木犀草素 (含量> 99.2%)、芹菜素(含量> 99.2%)、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷（含量> 98.00%)；芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷(含量> 98.00%) 均购自天津一方科技有限公司；苦碟子注射液(通化华夏药业有限责任公司，批号为120311T、120312T、120314T、120315T、120316T、120317T、129318T、120319T)。甲醇(天津市康科德科技有限公司)为色谱纯，乙腈(Sigma公司)为色谱纯，水为超纯水(杭州娃哈哈集团公司)，其他试剂均为分析纯。
2. 方法与结果
2.1色谱条件及系统适用性试验
色谱柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；甲酸-水（A）甲酸-乙腈（B）。0-10 min：90% A-81% A；10-26 min：81% A-80% A；26-36 min：80% A-72% A；36-40 min：72% A-70% A；40-50 min：70% A-70% A；检测波长：330 nm；流速：1 mL / min；柱温：35 ℃；进样量10 μL。
在上述色谱条件下木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素的对照溶液和苦碟子注射液供试溶液的色谱图见图1、2，各色谱峰与相邻色谱峰能达到基线分离。参见图1、2，1 木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷，2 木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷，3芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷，4 芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷，5 木犀草素，6 芹菜素。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
分别精密称取木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷对照品2mg至5mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，得400μg·mL-1储备液；精密称取木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷对照品4mg至5mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，得800μg·mL-1储备液；精密称取芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷对照品2mg至10mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，得200μg·mL-1储备液；精密称取芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷对照品2mg至5mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，得400μg·mL-1储备液；精密称取木犀草素对照品2mg至5mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，得400μg·mL-1储备液；精密称取芹菜素对照品2mg至10mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，得200μg·mL-1储备液；分别量取上述木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷储备液3.5 mL，木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷储备液2.0 mL，芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷储备液0.5mL，芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷 储备液3.0mL，木犀草素储备液0.4 mL，芹菜素储备液0.5mL至同一10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素质量浓度分别为140.0、160.0、16.00、120.0、16.00、10.00 μg·mL-1的混合溶液，超声溶解，即得混合对照品储备液，待用。
2.2.2供试品溶液的制备 取苦碟子注射液，用0.45 μ m微孔滤膜过滤，作为供试品溶液，待测。
2.3 线性关系考察
精密量取混合对照储备液（木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素分别为140.0、160.0、16.00、120.0、16.00、10.00 μg·mL-1的混合溶液）5mL置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为70.00、80.00、8.000、60.00、8.000、5.000 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为35.00、40.00、4.000、30.00、4.000、2.500 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为17.50、20.00、2.000、15.00、2.000、1.250 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为8.750、10.00、1.000、7.500、1.000、0.625 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为4.375、5.000、0.500、3.750、0.500、0.313 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为2.188、2.500、0.250、1.875、0.250、0.156 μg·mL-1的混合溶液；此为系列标准溶液。取系列标准溶液10 mL，将得到的7不同浓度的混合对照品溶液按“2.1”项下色谱条件进行分析并记录峰面积。以对照品质量浓度( μg·mL-1)为横坐标，峰面积( A) 为纵坐标，以最小二乘法求得回归方程，见表1。
表1 6个化合物的线性回归方程及相关系数
| 成分 | 回归方程 | r | 线性范围(μg·mL-1) |
| 木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷 | Y= 2.185×104X + 9.962×103 | 0.999 | 2.188~140.0 |
| 木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷 | Y = 2.119×104X +5.759×103 | 0.999 | 2.500~160.0 |
| 芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷 | Y= 2.965×104X -1.176×103 | 0.999 | 0.250~16.00 |
| 芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷 | Y = 2.322×104X +4.754×103 | 0.999 | 1.875~120.0 |
| 木犀草素 | Y = 2.975×104X -2.347×103 | 0.999 | 0.250~16.00 |
| 芹菜素 | Y= 3.549×104X + 2.449×102 | 0.998 | 0.156~10.00 |
由表1可知，木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素分别在2.188-140.0 μg·mL-1，2.500-160.0 μg·mL-1，0.250-16.00 μg·mL-1，1.875-120.0 μg·mL-1，0.250-16.00 μg·mL-1和0.156-10.00 μg·mL-1内的线性关系良好。
2.4精密度实验
精密吸取低、中、高三种浓度的混合标准品溶液：低浓度 木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素的浓度分别为 8.750、10.00、1.000、7.500、1.000、0.625 μg·mL-1的混合溶液；中浓度分别为 17.50、20.00、2.000、15.00、2.000、1.250 μg·mL-1的混合溶液；高浓度分别为35.00、40.00、4.000、30.00、4.000、2.500 μg·mL-1的混合溶液，在“2.1”项下色谱条件下，每种浓度重复进样6次，每次10 μL，计算各对照品色谱峰面积以及相对标准偏差( RSD)，六种黄酮类物质的精密度数据见表2。结果表明相对误差（RSD）均小于3.5 %，表明仪器精密度良好，可以满足实验的要求。
表2 方法的精密度(n=6)
2.5 重复性实验
取同一批苦碟子注射液(批号120317T) 样品6只，按“2.2.2”项下方法制成供试溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样分析（n=6），每次10 μL，计算各对照品色谱峰面积和相对标准偏差( RSD)。测得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素的平均含量分别为75.85 μg·mL-1、82.21 μg·mL-1、0.671 μg·mL-1、18.46 μg·mL-1、0.472 μg·mL-1、0.193 μg·mL-1。RSD分别为3.96 %、3.39 %、2.81 %、 2.42 %、3.24 %、3.47 % (n=6)，表明方法重复性良好。
2.6 稳定性实验
取供试苦碟子注射液 (批号120317T)，室温放置，于0、2、4、6、8、12 h进样，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素峰面积的RSD值分别为3.76 %、3.53 %、3.30 %、2.95 %、4.36 %、3.88 %。说明供试品溶液在12 h内稳定性良好。
2.7回收率实验精密量取已知含量的苦碟子注射液 (批号：120317T) 5.0 mL，平行6份，分别置于10 mL量瓶中，分别精密加入一定质量浓度的混合对照品溶液5.0 mL，其中木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷 70.00 μg·mL-1、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷 77.00 μg·mL-1、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷 0.56 μg·mL-1、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷 18.00 μg·mL-1、木犀草素0.40 μg·mL-1、芹菜素 0.24 μg·mL-1摇匀，按“2.1”项下的色谱条件进样分析，记录峰面积，计算加样回收率，结果见表3。
表3 回收率试验结果 (n=6)
2.8 样品含量测定
取苦碟子注射液批号为（120311T、120312T、120314T、120315T、120316T、120317T、129318T、120319T）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，结果见表4。
表4 不同批次样品中六种黄酮类化合物的含量测定
3. 结论
本文建立了HPLC-DAD同时测定注射液中6种黄酮类成分的方法并且测定了苦碟子注射液种的黄酮类成分的含量。6种黄酮类成分含量范围是0.12-93.42 μg·mL-1，约占苦碟子注射液总固体含量的8.25 %(注射液总固体含量为20.96 mg/支10 mL)。该方法简便、快速，结果可靠，重现性好，可应用于测定苦碟子注射液中的多种黄酮类成分。
Claims (6)
1.一种HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中六种黄酮类成分的方法，其特征在于步骤如下：
（1）对照品溶液的制备：
分别精密称取木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷；木犀草素、芹菜素、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷对照品，加甲醇溶解并稀释成质量浓度分别为140.0、160.0、16.00、120.0、16.00、10.00 μg·mL-1的混合溶液，超声溶解，即得混合对照品储备液，待用；
（2）供试品溶液的制备：
取苦碟子注射液，用0.45 μ m微孔滤膜过滤，作为供试品溶液，待测；
（3）测定法: 采用HPLC-DAD法分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入检测器，测定，即得；
色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18；甲酸-水（A）甲酸-乙腈（B）；0-10 min：90% A-81% A；10-26 min：81% A-80% A；26-36 min：80% A-72% A；36-40 min：72% A-70% A；40-50 min：70% A-70% A；检测波长：330 nm；流速：1 mL / min；柱温：35 ℃；进样量10 μL。
2.按照权利要求1所述的HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中六种黄酮类成分的方法，其特征在于步骤（3）测定法中包括线性关系测定；即精密量取混合对照品储备液5mL置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为70.00、80.00、8.000、60.00、8.000、5.000 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为35.00、40.00、4.000、30.00、4.000、2.500 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为17.50、20.00、2.000、15.00、2.000、1.250 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为8.750、10.00、1.000、7.500、1.000、0.625 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为4.375、5.000、0.500、3.750、0.500、0.313 μg·mL-1的混合溶液；再取出5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 即得木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素浓度分别为2.188、2.500、0.250、1.875、0.250、0.156 μg·mL-1的混合溶液；此为系列标准溶液；取系列标准溶液10 mL，将得到的7不同浓度的混合对照品溶液按色谱条件下进行分析并记录峰面积。
3.按照权利要求1所述的HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中六种黄酮类成分的方法，其特征在于步骤（3）测定法中包括精密度测定；即精密吸取低、中、高三种浓度的混合标准品溶液：低浓度 木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷、木犀草素、芹菜素的浓度分别为 8.750、10.00、1.000、7.500、1.000、0.625 μg·mL-1的混合溶液；中浓度分别为 17.50、20.00、2.000、15.00、2.000、1.250 μg·mL-1的混合溶液；高浓度分别为35.00、40.00、4.000、30.00、4.000、2.500 μg·mL-1的混合溶液，在色谱条件下，每种浓度重复进样6次，每次10 μL，计算各对照品色谱峰面积以及相对标准偏差。
4.按照权利要求1所述的HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中六种黄酮类成分的方法，其特征在于步骤（3）测定法中包括重复性实验；即取供试品溶液，在色谱条件下，分别进样分析6次，每次10 μL，计算各对照品色谱峰面积和相对标准偏差。
5.按照权利要求1所述的HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中六种黄酮类成分的方法，其特征在于步骤（3）测定法中包括稳定性实验；即取供试苦碟子注射液 ，室温放置，于0、2、4、6、8、12 h进样，在色谱条件下进样分析，记录峰面积。
6.按照权利要求1所述的HPLC-DAD法同时测定苦碟子注射液中六种黄酮类成分的方法，其特征在于步骤（3）测定法中包括回收率实验；即精密量取苦碟子注射液 5.0 mL，平行6份，分别置于10 mL量瓶中，分别精密加入混合对照品储备液5.0 mL，其中木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷 70.00 μg·mL-1、木犀草素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷 77.00 μg·mL-1、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖苷 0.56 μg·mL-1、芹菜素7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷 18.00 μg·mL-1、木犀草素0.40 μg·mL-1、芹菜素 0.24 μg·mL-1摇匀，在色谱条件下进样分析，记录峰面积，计算加样回收率。
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