CN114609298A - 一种茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法及应用，属于中药质量分析与控制领域。该测定方法包括以下步骤：S1、取供试品溶液，通过液相色谱法进行检测；S2、以茯苓酸为参照物，计算供试品溶液中茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸、松苓新酸的含量；本发明建立了适宜的茯苓三萜酸类化合物的HPLC分析方法，选用茯苓酸为内参物，建立了同时测定茯苓中6种茯苓三萜酸含量的一测多评方法，节约检测成本和时间，为茯苓的质量控制提供了参考。
Description
技术领域
本发明属于中药质量分析与控制技术领域，具体涉及一种茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法及应用。
背景技术
茯苓系多孔菌科真菌茯苓(学名：Poria cocos(Schw.)Wolf Ryvarden&Gilb.)的干燥菌核，产于四川、安徽、云南、河南、河北等地，多于秋季采挖，有利水渗湿、健脾、健胃、宁心安神的功效，临床上用于治疗水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、便溏泄泻等症状。茯苓的主要活性成分为茯苓三萜类化合物和茯苓多糖类化合物。目前，从茯苓中分离出的三萜类化合物有80多种，茯苓三萜亦被证实有健脾、利尿、抗炎、抗肿瘤等药理作用。
中药多成分、多功效的作用特点使得单一成分的含量测定难以评价药材质量的优劣，即由于中药成分的复杂性，单一成分的测定并不能全面反应药材质量；因此，多成分、多指标的含量测定已经成为当前普遍认可的质量评价方式。相关技术中通过一测多评法测定多个三萜类化合物含量，来评价茯苓质量，但采用方法所需对照品量大且对照品不易获得(导致方法的成本较高)。即相关技术中茯苓质量的评价方法，面临着对照品不易获得、货源紧缺、价格昂贵等问题，限制了这些方法在实际生产等中的应用。且中国药典中也暂无茯苓[含量测定]项控制标准。
因此，需要构建一种茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，该方法实现了茯苓中多种三萜酸类化合物的同时测定且大幅降低了分析成本、提高了操作效率。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，该方法实现了茯苓中多种三萜酸类化合物的同时测定且成本低、效率高。
本发明还提供了上述方法在茯苓质量控制中的应用。
为解决上述第一个技术问题，本发明提供的技术方案为：一种茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，包括以下步骤：
S1、取供试品溶液，通过液相色谱法进行检测；
所述三萜酸类化合物包括茯苓新酸B(CAS号为：137551-39-4)、去氢土莫酸(CAS号为：6754-16-1)、茯苓新酸A(CAS号为：137551-38-3)、去氢茯苓酸(CAS号为：77012-31-8)、茯苓酸(CAS号：29070-92-6)、松苓新酸(CAS号：29220-16-4)；
S2、以所述茯苓酸为参照物，计算供试品溶液中茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸、松苓新酸的含量；
计算公式如下：
Wm＝fkm×Wk×Am/Ak；
Ak为参照物峰面积；Wk为参照物质量，单位为mg或μg；
Am为目标物m的峰面积，Wm为目标物m的质量，单位为mg或μg；
fkm为校正因子；
所述液相色谱法包括如下条件：
流动相A：质量分数为0.05％～0.4％的磷酸水溶液；
流动相B：乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱；
所述梯度洗脱的条件为：
0min～18min，所述流动相B的体积分数由48％～52％升高至58％～62％；
18min～28min，所述流动相B的体积分数保持为58％～62％；
28min～58min，所述流动相B的体积分数保持由58％～62％升高至90％～94％；
58min～68min，所述流动相B的体积分数保持为90％～94％。
根据本发明测定方法的一种技术方案，至少具备如下有益效果：
本发明的测定方法，本发明通过对梯度洗脱的条件进行控制，从而实现了对茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸的分离。
再采用一测多评(QAMS)技术，选取相对易得的茯苓酸作为内参物，建立了内参物茯苓酸与其余5种待测三萜化合物茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸、松苓新酸的相对校正因子，实现通过只测定茯苓酸的含量，用校正因子计算出另外5种三萜成分的含量，节约检测成本和时间，为茯苓多成分质量控制提供参考。
根据本发明的一些实施方式，所述供试品溶液的制备方法，包括以下步骤：
将茯苓样品与甲醇混合后，固液分离，收集滤液即得；所述茯苓样品和甲醇的质量体积比为1g：20mL～30mL。
经上述方法处理所得样品可直接用于HPLC分析，目标成分含量均在线性范围内。
采用甲醇为提取剂，实现了茯苓样品中三萜类化合物的高效提取。
根据本发明的一些实施方式，所述茯苓样品包括人工培育得到的茯苓样品。
根据本发明的一些实施方式，所述茯苓样品包括茯苓皮或白茯苓。
根据本发明的一些实施方式，所述茯苓样品包括人工培育得到的茯苓皮或人工培育得到的白茯苓。
根据本发明的一些实施方式，所述茯苓样品包括茯苓皮及其衍生产品。
根据本发明的一些实施方式，所述茯苓样品包括白茯苓及其衍生产品。
根据本发明的一些实施方式，所述茯苓样品包括茯苓菌发酵培养所得产品。
根据本发明的一些实施方式，所述流动相A为质量分数为0.2％～0.4％的磷酸水溶液。
根据本发明的一些实施方式，所述供试品溶液的制备方法，包括以下步骤：
将茯苓样品过筛后与甲醇混合，超声处理，固液分离即得。
根据本发明的一些实施方式，所述超声处理的功率为200W～250W。
根据本发明的一些实施方式，所述超声处理的频率为38kHz～42kHz。
根据本发明的一些实施方式，所述超声处理的时间为30min～40min。
根据本发明的一些实施方式，所述固液分离的方法为微孔滤膜过滤。
根据本发明的一些实施方式，所述微孔滤膜的孔径为0.2μm～0.25μm。
根据本发明的一些实施方式，当所述茯苓样品为茯苓皮时，所述供试品溶液的制备方法，包括以下步骤：
将所述茯苓样品粉碎后过60目筛，过筛后与甲醇混合，超声处理后，采用0.22μm的微孔滤膜过滤，即得。
根据本发明的一些实施方式，当所述茯苓样品为白茯苓时，所述供试品溶液的制备方法，包括以下步骤：
将所述茯苓样品粉碎后过60目筛，过筛后与甲醇混合，超声处理后，旋蒸后再次溶解，采用0.22μm的微孔滤膜过滤，即得。
根据本发明的一些实施方式，所述梯度洗脱的程序为：
0min～18min，所述流动相B的体积分数由50％升高至60％；
18min～28min，所述流动相B的体积分数保持为60％；
28min～58min，所述流动相B的体积分数保持由60％升高至92％；
58min～68min，所述流动相B的体积分数保持为92％。
根据本发明的一些实施方式，所述液相色谱法的检测波长为200nm～245nm。
根据本发明的一些实施方式，所述液相色谱法采用变波长程序检测。
根据本发明的一些实施方式，所述变波长程序为：
0min～45.0min，检测波长为240nm～245nm；
45.0min～46.8min，检测波长为200nm～205nm；
46.8min～48.8min，检测波长为240nm～245nm；
48.8min～54.0min，检测波长为200nm～205nm；
54.0min～57.0min，检测波长为240nm～245nm；
57.0min～64.0min，检测波长为200nm～205nm；
64.0min～68.0min，检测波长为240nm～245nm。
采用变波长检测程序使得仪器波长设置在待检成分的最大吸收波长附近，提高信号灵敏度，并减少干扰。
在上述区间的公共点，则为转换波长的时刻。例如，在45.0min将检测波长从240nm～245nm调整为200nm～205nm；依此类推。
根据本发明的一些实施方式，在检测时间为0min～45.0min时，检测波长为242nm。
根据本发明的一些实施方式，在检测时间为45.0min～46.8min时，检测波长为203nm。
根据本发明的一些实施方式，在检测时间为46.8min～48.8min时，检测波长为242nm。
根据本发明的一些实施方式，在检测时间为48.8min～54.0min时，检测波长为203nm。
根据本发明的一些实施方式，在检测时间为54.0min～57.0min时，检测波长为242nm。
根据本发明的一些实施方式，在检测时间为57.0min～64.0min时，检测波长为203nm。
根据本发明的一些实施方式，在检测时间为64.0min～68.0min时，检测波长为242nm。
保留时间在48.8～54.0min时出峰成分为茯苓酸，茯苓酸的最大吸收波长为203nm，保留时间在45.0min～46.8min和57.0min～64.0min时有其它色谱峰在203nm有吸收，故变波长设置既能提高信号灵敏度，减少干扰，还能同时检测多种物质，使谱图更加完整美观。
根据本发明的一些实施方式，所述液相色谱法的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
根据本发明的一些实施方式，所述液相色谱法的色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)色谱柱、Welch Ultimate XB-C18色谱柱和Agilent Eclipse Plus C18色谱柱中的一种。
Agilent TC-C18(2)以中等密度键合，能够使极性和非极性混合样品获得优异的分离度，从而实现供试品溶液中三萜酸化合物的有效分离。
根据本发明的一些实施方式，所述液相色谱法的柱温为20℃～30℃。
根据本发明的一些实施方式，所述液相色谱法的柱温为22℃～30℃。
根据本发明的一些实施方式，所述流动相B的流速为0.8mL/min～1.2mL/min。
根据本发明的一些实施方式，所述流动相B的流速为1.0mL/min～1.2mL/min。
柱温、体积流量都会影响各茯苓三萜酸出峰时间，在此温度和体积流量条件下得到的HPLC色谱图上各待测成分色谱峰分离度较好，基线平稳。
根据本发明的一些实施方式，所述茯苓新酸B的相对校正因子为2.87～2.91。
根据本发明的一些实施方式，所述土氢土莫酸的相对校正因子为1.08～1.11。
根据本发明的一些实施方式，所述茯苓新酸A的相对校正因子为11.15～11.50。
根据本发明的一些实施方式，所述去氢茯苓酸的相对校正因子为0.90～0.92。
根据本发明的一些实施方式，所述松苓新酸的相对校正因子为4.15～4.21。
通过将相对校正因子控制在上述范围，实现了对茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸、松苓新酸的有效检测。
本发明第二方面提供了上述茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法在茯苓及其衍生产品质量控制中的应用。
根据本发明的一些实施方式，所述衍生产品包括茯苓膏、茯苓饼干、茯苓酥中的至少一种。
附图说明
图1为本发明实施例1中混合对照品溶液的高效液相色谱图。
图2为本发明实施例1中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱图。
图3为本发明实施例1中白茯苓供试品溶液的高效液相色谱图。
图4为本发明对比例1中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱图(242nm)。
图5为本发明对比例1中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱图(203nm)。
图6为本发明对比例2中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱图(242nm)。
图7为本发明对比例2中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱图(203nm)。
图8为本发明对比例3中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱图(242nm)。
图9为本发明对比例3中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱图(203nm)。
图10为本发明对比例4中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱图(242nm)。
图11为本发明对比例4中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱图(203nm)。
图12为本发明对比例5中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱图(242nm)。
图13为本发明对比例5中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱图(203nm)。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其它实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面详细描述本发明的具体实施例。
本发明实施方式中所选用的仪器和试剂如下：
本发明实施方式中选用的色谱仪为Agilent1200高效液相色谱仪、Waters E2695高效液相色谱仪和Agilent1260高效液相色谱仪中的一种。
本发明实施方式中选用的超声仪为JS-40型超声波清洗仪(常州鸿泽实验科技有限公司)。
本发明实施方式中选用的色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)色谱柱(长250mm，内径4.6mm，粒度5μm)、Welch Ultimate XB-C18色谱柱(长250mm，内径4.6mm，粒度5μm)和Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(长250mm，内径4.6mm，粒度5μm)中的一种。
本发明实施方式中选用的电子天平为EX224ZH型电子分析天平(OHAUS公司)。
本发明实施方式中对照品茯苓新酸B(批号140723)、茯苓新酸A(批号140314)、茯苓新酸AM(批号140906)、去氢茯苓酸(批号140903)、松苓新酸(批号140902)、茯苓酸(批号140212)均购自成都克洛玛生物科技有限公司，质量分数均≧98％。去氢土莫酸(批号AF21032，质量分数≧98％)购自成都埃法生物科技有限公司。该方法建立后只需购买一种对照品(即茯苓酸)，即可同时检测6种茯苓三萜的含量，显著降低了对照品消耗，节约了试剂和分析时间，并克服了茯苓三萜最大吸收波长不一致导致难以在同一色谱条件下出峰的难题。
乙腈为色谱纯，水为怡宝纯净水，其余试剂为分析纯。茯苓药材样品来源见表1。
表1茯苓药材样品来源
实施例1
本实施例1为一种茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，由以下步骤组成：
S1、溶液配制：
制备供试品溶液：
将取茯苓皮样品(S1～S9中任一种)粉末2.0g(过60目筛)，精密称定，置100mL干燥具塞锥形瓶中，加甲醇50mL，密塞，称定质量为m，超声处理(功率240W，频率40kHz)30min，放冷，用甲醇补足减失质量(即将质量调整为m)，滤过，茯苓皮样品滤液经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得茯苓皮供试品溶液；
将取白茯苓样品(S10～S14中任一种)粉末2.0g(过60目筛)，精密称定，置100mL干燥具塞锥形瓶中，加甲醇50mL，密塞，称定质量为m，超声处理(功率240W，频率40kHz)30min，放冷，用甲醇补足减失质量(即将质量调整为m)，滤过，白茯苓样品滤液先旋转蒸干后采用甲醇定容至2mL，再经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得白茯苓供试品溶液。
混合对照品溶液的制备：
精密称取茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、茯苓新酸AM(CAS号为：CAS号为：151200-92-9)，去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸对照品适量，加甲醇溶解制成含茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、茯苓新酸AM，去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸对照品质量浓度分别为0.0207mg/mL、0.0714mg/mL、0.0064mg/mL、0.0150mg/mL、0.0386mg/mL、0.0371mg/mL、0.0171mg/mL的混合对照品溶液。放于冰箱(4℃)保存，备用。
S2、液相色谱法检测：
采用液相色谱法对步骤S1中制得的茯苓皮供试品溶液、白茯苓供试品溶液和混合对照品溶液进行检测。
色谱条件如下：
色谱仪为：Agilent1200高效液相色谱仪。
色谱柱为：Agilent 5TC-C18(2)(长度为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)色谱柱。
流动相A为：质量分数为0.3％磷酸水溶液；
流动相B为：乙腈；
梯度洗脱程序为：
0min～18min，流动相B的体积分数由50％升高至60％；
18min～28min，流动相B的体积分数保持为60％；
28min～58min，流动相B的体积分数保持由60％升高至92％；
58min～68min，流动相B的体积分数保持为92％。
变波长程序检测程序为：
0min～45.0min，检测波长为242nm；
45.0min～46.8min，检测波长为203nm；
46.8min～48.8min，检测波长为242nm；
48.8min～54.0min，检测波长为203nm；
54.0min～57.0min，检测波长为242nm；
57.0min～64.0min，检测波长为203nm；
64.0min～68.0min，检测波长为242nm。
进样量为：10μL。
柱温为：25℃。
体积流量为：1.0mL/min。
本实施例中混合对照品溶液的高效液相色谱检测图见图1，其中峰1为茯苓新酸B，峰2为去氢土莫酸，峰3为茯苓新酸A，峰4为茯苓新酸AM，峰5为去氢茯苓酸，峰6为茯苓酸，峰7为松苓新酸；从图1中得知：采用本实施例的检测方法，实现了上述物种的有效分离。
本实施例中茯苓皮(S1)供试品溶液的高效液相色谱检测图见图2，本实施例中白茯苓(S10)供试品溶液的高效液相色谱检测图见图3，从图2和图3中得知，本实施例的液相色谱检测方法能够实现对供试品溶液中待测物种成分的分离，且得到了完整美观，谱图基线平稳和各成分峰形对称的液相色谱图。
实施例2
本实施例为对实施例1中测定方法进行考察：
标准曲线的绘制：
分别精密吸取实施例中制得的混合对照品溶液1μL、5μL、10μL、20μL、30μL、40μL，注入Agilent 1200高效液相色谱仪，按照实施例1中色谱条件，记录各对照品的色谱峰面积。以各对照品进样量(X)对相应峰面积(Y)进行回归处理，得6个成分的回归方程及线性范围。结果表明6个成分的线性关系良好，如表2所示。
表2 6种茯苓三萜酸类成分的线性回归方程
精密度实验：
分别取实施例1中制得的混合对照品溶液和编号为S8的供试品溶液(参照实施例1中茯苓皮供试品溶液的制备方法制备得到)连续进样6次，计算的6种有效成分的峰面积RSD。结果茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸的峰面积的RSD值均小于2％，表明仪器的精密度良好，结果见表3。
表3精密度实验中各成分峰面积
重复性实验：
取编号为S8的茯苓药材平行制备6份供试品溶液(参照实施例1中茯苓皮供试品溶液制备方法制得)，测定峰面积，计算6种成分的质量分数和峰面积RSD。计算得茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸的平均质量分数分别为0.506mg/g、0.698mg/g、0.504mg/g、0.431mg/g、0.690mg/g、1.003mg/g，相应峰面积RSD分别为0.86％、1.26％、1.94％、1.36％、1.87％、2.75％，均小于3％，表明该方法重复性良好。
稳定性实验：
取编号为S8的供试品溶液(参照实施例1中茯苓皮供试品溶液制备方法制得)分别于制好后的0h、2h、4h、8h、12h、24h测定峰面积，得供试品6种有效成分的峰面积RSD。计算得，茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸的峰面积RSD分别为0.78％、0.31％、0.72％、0.48％、0.31％、0.24％，均小于3％，表明供试品溶液在24h内稳定。
加样回收实验：
取编号为S8的药材，以质量比为1：1的比例分别加入一定量的6种对照品，测定6种有效成分的峰面积，根据标准曲线计算加样回收率，见表4。计算得到茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸的平均加样回收率分别为101.50％、102.76％、99.92％、102.89％、102.06％、100.49％，平均加样回收率在95％～105％之间；RSD分别为1.75％、1.98％、3.09％、1.76％、2.84％、2.66％，均小于3.0％，表明方法的准确度良好。
表4 6个成分加样回收率试验(n＝6)
相对校正因子(f)的建立：
在实施例1的色谱条件下，取实施例1制得的混合对照品溶液分别进样1μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、40μL，记录6种有效成分的峰面积，以茯苓酸为内参物，计算待测成分与内参物的f。f＝fi/fs＝(Ai/Wi)/(As/Ws)(Ai为待测成分峰面积，Wi为待测成分量，As为内参物峰面积，Ws为内参物量)结果表明，茯苓酸作为内参物时其他成分茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸、松苓新酸的f的RSD均小于3％，见表5。
表5 5种成分的相对校正因子f
f的耐用性评价：
不同色谱柱对f的影响：
取实施例1中制得的混合对照品溶液，进样量10μL，采用Agilent 1200高效液相色谱仪，分别考察Agilent 5TC-C18(2)(250mm×4.6mm,5μm)、Welch Ultimate XB-C18(250mm×4.6mm,5μm)、Agilent Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm,5μm)共3根色谱柱对各茯苓三萜酸f的影响(除色谱柱外，其他未列举参数参照实施例1中色谱检测条件)，结果茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸、松苓新酸的f的RSD依次为0.85％、2.64％、2.49％、0.39％、0.48％、0.23％，表明色谱柱的更换对各成分f无显著性影响。结果见表6。
表6不同色谱柱对f的影响
不同柱温对f的影响：
实验采用Agilent 1200高效液相色谱仪系统，Agilent 5TC-C18(2)柱，分别在不同柱温(22℃、25℃、28℃、30℃，其他未列举参数参照实施例1中色谱条件，进样溶液为实施例1制得的混合对照品溶液)条件下测定5种茯苓三萜酸的f，结果显示各成分之间f的RSD依次为1.09％、0.57％、0.32％、0.53％、0.54％，均小于2％，表明柱温对各成分的f无显著性影响。结果见表7。
表7不同柱温对f的影响
不同流动相体积流量对f的影响：
实验采用Agilent 1200高效液相色谱仪系统，Agilent 5TC-C18(2)柱，考察不同体积流量(1.0mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min、1.3mL/min；其他未列举参数参照实施例1中色谱条件，进样溶液为实施例1制得的混合对照品溶液)对5种茯苓三萜酸f的影响，各成分之间f重复性良好，RSD依次为0.1％、0.17％、0.17％、0.09％、0.15％，均小于2％，表明不同体积流量对各成分f无显著性影响。结果见表8。
表8不同体积流量对f的影响
不同仪器对f的影响
实验分别采用Agilent 1200、Waters E2695、Agilent 1260高效液相色谱仪系统，Agilent 5TC-C18(2)柱(其他未列举参数参照实施例1中色谱条件，进样溶液为实施例1制得的混合对照品溶液)，考察不同仪器对6种茯苓三萜酸f的影响，结果各成分f的RSD均小于5％，见表9。
表9不同仪器对f的影响
色谱峰定位参数考察：
分别考察了相对保留值或保留时间差2种参数在不同仪器(Agilent 1200(仪器1)、Waters E2695(仪器2)、Agilent 1260(仪器3))、不同色谱柱(Agilent 5TC-C18(2)(柱1)、Welch Ultimate XB-C18(柱2)、Agilent Eclipse Plus C18(柱3))和不同操作人员(A、B、C)的重现性，计算后以RSD值小的参数作为峰定位依据(相对保留值指各待测成分与内参物s间保留时间的比值。保留时间差指各待测成分与内参物s间保留时间的差值；其他未列举参数参照实施例1中色谱条件，进样溶液为实施例1制得的混合对照品溶液)。考察结果表明，5种茯苓三萜酸成分(茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸和松苓新酸)和内参物茯苓酸之间的保留时间差值波动较大，而相对保留时间值波动较小，RSD均小于5％(表10、11)。故采用相对保留时间值对色谱峰定位。
表10保留时间差值
表11相对保留时间
QAMS法与外标法(ESM)测定结果比较：
取表1中购买的各批次茯苓药材，按照实施例1中供试品溶液制备方法制备供试品溶液，根据实施例1中色谱条件进样测定，记录6个有效成分的峰面积，首先根据标准曲线分别计算出各成分的含量(外标法)，然后以茯苓酸为QAMS方法的参照物，并通过测得的各待测成分与内参物的f平均值，根据QAMS定量计算公式分别计算出待测成分的含量。将外标法实测值与QAMS计算值进行配对t检验，结果P值均>0.05，表明2种方法测定结果之间无显著差异，本申请建立的QAMS法有较好的准确性和可行性。见表12。
QAMS定量计算公式：Wi＝(Ws*Ai)/(f*As)(Wi为待测成分量，Ai为待测成分峰面积，Ws为内参物量，As为内参物峰面积，f为待测成分与参照物f)。
表12ESM和QAMS测定14批茯苓样品中6种三萜酸类化合物的含量
本发明中分析茯苓三萜酸的方法(主要为色谱条件)与相关技术不同，包括采用的色谱柱、流动相、梯度洗脱程序、变波长检测程序、流速、柱温、进样量，采用此色谱条件分析的茯苓三萜酸成分类型也与相关技术不同，得到的茯苓样品高效液相色谱图在实现含量测定要求的同时更完整美观，谱图基线平稳、各成分峰形对称。本发明中建立同时测定茯苓中6种三萜酸含量的一测多评方法时选用茯苓的代表性成分茯苓酸作为内参物，与现有技术选用熊果酸作内参物有一定的区别，同时测定的6种茯苓三萜酸的成分分别为茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸，与相关技术不同。
对比例1
本对比例为一种茯苓中三萜酸类化合物分离方法，由以下步骤组成：
S1、制备供试品溶液：
将取茯苓皮样品(S6)粉末2.0g(过60目筛)，精密称定，置100mL干燥具塞锥形瓶中，加甲醇50mL，密塞，称定质量为m，超声处理(功率240W，频率40kHz)30min，放冷，用甲醇补足减失质量(即将质量调整为m)，滤过，茯苓皮样品滤液经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得茯苓皮供试品溶液；
S2、液相色谱法检测：
采用液相色谱法对步骤S1中制得的茯苓皮供试品溶液进行检测。
色谱条件如下：
色谱仪为：Agilent1200高效液相色谱仪。
色谱柱为：Agilent 5TC-C18(2)(长度为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)色谱柱。
流动相A为：质量分数为0.3％磷酸水溶液；
流动相B为：乙腈；
梯度洗脱程序为：
0min～50min，流动相B的体积分数保持为50％；
50min～53min，流动相B的体积分数由50％升高至60％；
53min～92min，流动相B的体积分数由60％升高至92％；
92min～96min，流动相B的体积分数保持为92％；
96min～101min，流动相B的体积分数由92％降低至50％。
波长程序检测程序为：选择242nm波长和203nm波长分别检测。
进样量为：10μL。
柱温为：25℃。
体积流量为：1.0mL/min。
本对比例中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱检测图见图4～5，由图4～5中得知，该方法制得的图谱，基线不平，待测成分整体保留时间偏高，洗脱时间较长。
对比例2
本对比例为一种茯苓中三萜酸类化合物分离方法，与对比例1的差异在于：茯苓皮样品选自S4。
梯度洗脱程序为：
0min～28min，流动相B的体积分数由50％升高至62％；
28min～35min，流动相B的体积分数由62％升高至73％；
35min～55min，流动相B的体积分数由73％降低至60％；
55min～60min，流动相B的体积分数由60％升高至92％；
60min～65min，流动相B的体积分数由92％降低至50％。
本对比例中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱检测图见图6～7，由图6～7中得知，该方法制得的图谱，各待测成分峰的分离度值均大于2.91，但是对称因子普遍不高，只有峰7的对称因子达到0.96。
对比例3
本对比例为一种茯苓中三萜酸类化合物分离方法，与对比例2的差异在于：
梯度洗脱程序为：
0min～18min，流动相B的体积分数由50％升高至62％；
18min～28min，流动相B的体积分数保持为62％；
28min～58min，流动相B的体积分数由62％升高至92％；
58min～66min，流动相B的体积分数保持为92％；
66min～68min，流动相B的体积分数由92％降低至50％。
本对比例中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱检测图见图8～9，由图8～9中得知，该方法制得的图谱，各待测成分峰的分离度值均大于2.85，各峰对称因子较对比例2有所改进，其中峰3、峰6和峰7的对称因子均大于0.96，但该方法仍需优化。
对比例4
本对比例为一种茯苓中三萜酸类化合物分离方法，与对比例2的差异在于：
梯度洗脱程序为：
0min～18min，流动相B的体积分数由50％升高至61％；
18min～28min，流动相B的体积分数保持为61％；
28min～58min，流动相B的体积分数由61％升高至92％；
58min～66min，流动相B的体积分数保持为92％；
66min～68min，流动相B的体积分数由92％降低至50％。
本对比例中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱检测图见图10～11，由图10～11中得知，该方法制得的图谱，各待测成分峰的分离度值均大于2.91，峰3、峰6和峰7的对称因子分别为0.97、0.99、0.96，其余各峰对称因子较对比例3都有所改进，但该方法仍需优化。
对比例5
本对比例为一种茯苓中三萜酸类化合物分离方法，与对比例2的差异在于：
梯度洗脱程序为：
0min～18min，流动相B的体积分数由50％升高至60％；
18min～28min，流动相B的体积分数保持为60％；
28min～58min，流动相B的体积分数由60％升高至92％；
58min～68min，流动相B的体积分数保持为92％。
本对比例中茯苓皮供试品溶液的高效液相色谱检测图见图12～13，由图12～13中得知，该方法制得的图谱，各待测成分峰的分离度值均大于2.91，峰3、峰6和峰7的对称因子分别为1.01、1.01、0.97，其余各峰对称因子较对比例4都有所改进，但是采集波长为双波长，待测成分峰1～峰5，峰7无法在一张色谱图上呈现。
综上所述，本发明中以价格相对适中、易得的茯苓酸为内参物，在建立的HPLC条件基础上建立了同时测定茯苓中6种三萜酸含量的一测多评方法，很好的解决的除茯苓酸外，其余5个对照品难求、价格昂贵的问题，为茯苓中三萜成分的定量评价研究提供参考，节约了检测成本和时间，该方法的线性关系良好、精密度高、重复性好、稳定性好。
上面结合具体实施方式对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、取供试品溶液，通过液相色谱法进行检测；
所述三萜酸类化合物包括茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸；
S2、以茯苓酸为参照物，计算供试品溶液中茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、去氢茯苓酸、松苓新酸的含量；
计算公式如下：
Wm＝fkm×Wk×Am/Ak；
Ak为参照物峰面积；Wk为参照物质量，单位为mg或μg；
Am为目标物m的峰面积，Wm为目标物m的质量，单位为mg或μg；
fkm为校正因子；
所述液相色谱法包括如下条件：
流动相A：质量分数为0.05％～0.4％的磷酸水溶液；
流动相B：乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱；
所述梯度洗脱的条件为：
0min～18min，所述流动相B的体积分数由48％～52％升高至58％～62％；
18min～28min，所述流动相B的体积分数保持为58％～62％；
28min～58min，所述流动相B的体积分数保持由58％～62％升高至90％～94％；
58min～68min，所述流动相B的体积分数保持为90％～94％。
2.根据权利要求1所述的茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，其特征在于：所述供试品溶液的制备方法，包括以下步骤：
将茯苓样品与甲醇混合后，固液分离，收集滤液即得；所述茯苓和甲醇的质量体积比为1g：20mL～30mL。
3.根据权利要求1所述的茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，其特征在于：所述液相色谱法的检测波长为200nm～245nm。
4.根据权利要求1所述的茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，其特征在于：所述液相色谱法的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
5.根据权利要求1所述的茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，其特征在于：所述液相色谱法的柱温为20℃～30℃。
6.根据权利要求1所述的茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，其特征在于：所述流动相B的流速为0.8mL/min～1.2mL/min。
7.根据权利要求1所述的茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，其特征在于：所述茯苓新酸B的相对校正因子为2.87～2.91；优选地，所述去氢土莫酸的相对校正因子为1.08～1.11。
8.根据权利要求1所述的茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，其特征在于：所述茯苓新酸A的相对校正因子为11.15～11.50；优选地，所述去氢茯苓酸的相对校正因子为0.90～0.92。
9.根据权利要求1所述的茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法，其特征在于：所述松苓新酸的相对校正因子为4.15～4.21。
10.一种如权利要求1至9任一项所述的茯苓中三萜酸类化合物含量的测定方法在茯苓及其衍生产品质量控制中的应用。
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