CN104931594B - 一种五味子中5-羟甲基糠醛的含量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种五味子中5‑羟甲基糠醛的含量检测方法，采用高效液相法测定五味子中5‑羟甲基糠醛，色谱条件，采用C18柱或C8，流动相为5‑15∶95‑85的甲醇‑0.5%醋酸水溶液或体积比为10‑15:90‑85乙腈‑水溶液，等度洗脱，检测波长为280‑284nm。该方法操作简便、灵敏度高，重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及中药材化学成分的检测，特别涉及五味子中的检测方法。
背景技术
五味子[Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.]为木兰科五味子属（Schisandra）多年生左旋落叶木质藤本植物，其成熟果实干燥后作药用，因其果实甘、酸、辛、苦、咸五味俱全，故名五味子，主产于黑龙江、吉林、辽宁等地，习称“北五味子”。具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功能。用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗、盗汗、津伤口渴、短气脉虚、内热消渴、心悸失眠等症。五味子多为9月前后成熟，为浆果，果实含水量较高，采收后需及时加工干燥以利于贮存保证药材品质。传统多采用阴干、晒干等方式，因其需要大量劳动力且受天气情况影响干燥过程不易控制，现多采用烘干的方式进行干燥。但是不同的干燥时间和干燥温度对药材品质具有重要影响。
5-羟甲基糠醛（5-HMF），又称5-羟甲基-2-糠醛，是由葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下产生的一个醛类化合物，是Maillard反应的典型产物之一。文献中表述该化合物对人体横纹肌和内脏有损害，具有神经毒性，能与人体蛋白质结合产生积蓄中毒，2010年版中国药典二部中明确规定了它在含葡萄糖注射液中的限量。此外，近年来也有研究表明，它具有抗氧化、抗心肌缺血、改变血液流变学等对人体有益的作用。目前5-HMF测定主要为UV法和HPLC法，五味子应用广泛，在加工干制的过程中会产生5-HMF，但是五味子药材中5-HMF的含量测定未见文献报道，因此本实验采用HPLC-UV建立五味子药材中5-HMF的含量测定方法，对于研究炮制作用机理，规范炮制工艺，控制饮片炮制质量具有一定意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便、快速、准确、重复性好的五味子中5-羟甲基糠醛的含量检测方法。
本发明提供的五味子中5-羟甲基糠醛含量的检测方法，包括以下步骤
(A)供试品溶液的制备；
(B)对照品溶液的制备；
(C)高效液相色谱法测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，按照一定的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
上述步骤（A）为取过60目筛的五味子药材粉末，冰浴超声或冰浴振摇提取，将得到提取离心，过滤，定容，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
进一步的，上述步骤（A）为取过60目筛的五味子药材粉末0.5-1.5g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声或冰浴振摇提取，每次20-30min，共提取3-4次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
更进一步的，上述步骤（A）为取过60目筛的五味子药材粉末约1.00g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次25min，共提取3次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
上述步骤（B）为精密称取5-HMF对照品，加甲醇溶解，定容，摇匀即得。
进一步的，取5-HMF对照品5.00-8.00mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
更进一步的，精密称取5-HMF对照品6.00mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
上述的步骤(C)中的色谱条件可以采用下述的色谱条件：
色谱柱：选自C18或C8柱；
流动相：选自体积比为5-15∶95-85的甲醇-0.5%醋酸水溶液或体积比为10-15:90-85乙腈-水溶液，等度洗脱；
流速：0.8-1.2mL·min-1；
检测波长：280-284nm；
柱温：25-35℃；
进样量：10-20μL；
更进一步的，上述的步骤(C)中的色谱条件为
色谱柱：C18；
流动相：选自体积比为15∶85的甲醇-0.5%醋酸水溶液
流速：1mL·min-1；
检测波长：284nm；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
本发明采用的方法和实验条件是经过筛选获得的，能够达到精确测定的目的，以下为本发明的筛选过程：
检测波长的筛选
5-HMF紫外吸收波长有280nm，282nm，284nm等多个，经过200～400nm全波长扫描，说明本实验5-HMF在284nm下有最大吸收，优选284nm作为测定波长。本试验采用PDA检测器对样品和对照品进行了峰纯度验证，结果表明在本试验所确定的检测条件下，5-HMF峰不含其他干扰成分。
提取方法的筛选
5-HMF的生成与温度密切相关，温度较高可能导致或加速美拉德反应的发生，所以没有考虑热提取的方法以避免加热过程产生影响。本试验考察了冰浴超声提取法与冰浴振摇提取取法，结果表明两种方法相差不大。因超声提取法操作简单，优选超声提取法。具体筛选如下：
取五味子干燥果实，粉碎，过60目筛，精密称取1.0000g于锥形瓶中，加入10ml甲醇，分别采用冰浴超声提取和振摇提取两次，每次提取15min，平行2次，提取时用锡箔纸包住锥形瓶。取提取液过滤，定容至25ml容量瓶中，摇匀，过0.45um滤膜，进高效液相测定。记录峰面积，峰面积高的为最佳提取方式，见表1.
表1 不同提取方式的5-HMF峰面积
| 提取方式 | 峰面积1 | 峰面积2 | 平均峰面积 |
| 冰浴超声提取 | 365.7611 | 366.6766 | 366.2189 |
| 振摇提取 | 358.3383 | 360.4204 | 360.4204 |
由以上数据可以看出冰浴超声提取5-羟甲基糠醛效果相差不大，由于超声提取方便，所以选择冰浴超声提取五味子干燥果实中的5-羟甲基糠醛。
提取溶剂用量筛选
取五味子干燥果实，粉碎，过60目筛。精密称取五味子粉末1.0000g于锥形瓶中，分别加入药材量5、10、15、20、25倍体积的甲醇溶液，所述的倍数是指水的体积和五味子的质量倍数（v/w），通常是L/kg、mL/g，以此类推；冰浴超声提取15min，提取一次，平行2次，提取时用锡箔纸包住锥形瓶。取提取液过滤，定容至25ml容量瓶中，过0.45um滤膜，进高效液相测定。记录峰面积，峰面积最高的为最佳溶剂用量，见表2和图3
表2 不同溶剂用量的5-HMF峰面积
| 料液比 | 峰面积1 | 峰面积2 | 平均峰面积 |
| 1：5 | 322.7899 | 333.2336 | 328.0117 |
| 1：10 | 343.1734 | 352.3022 | 347.7378 |
| 1：15 | 350.5925 | 340.6626 | 345.6275 |
| 1：20 | 347.2749 | 343.3940 | 345.3344 |
| 1：25 | 333.6001 | 336.0680 | 334.8341 |
由以上数据可以看出随着料液比的增加，5-HMF的含量先增加后减小，当料液比为1：10时糠醛含量最高，料液比为1:15和1：20比1:10略微降低相差不多，当料液比增加为1:25时峰面积下降。
提取时间的筛选
取五味子干燥果实，粉碎，过60目筛。精密称取五味子粉末1.0000g于锥形瓶中，加入10ml甲醇溶液，分别冰浴超声提取5min，15min，25min，35min，提取一次，平行2次，提取时用锡箔纸包住锥形瓶。取提取液过滤，定容至25ml容量瓶中，过0.45um滤膜，进高效液相测定。记录峰面积，峰面积最高的为最佳提取时间，见表3和图4
表3 不同提取时间的5-HMF峰面积
| 时间 | 峰面积1 | 峰面积2 | 平均峰面积 |
| 5min | 359.3268 | 358.8641 | 359.0954 |
| 15min | 368.5100 | 370.0646 | 369.2873 |
| 25min | 369.6801 | 369.7060 | 369.6930 |
| 35min | 371.3658 | 369.7236 | 370.5447 |
由以上数据可以看出随着提取时间的增加，糠醛的含量增加，最后趋于平稳。提取时间为15min,25min,35min时5-HMF含量相差不多。
提取次数的筛选
五味子粉碎，过60目筛。精密称取五味子粉末1.0000g于锥形瓶中，加入10ml甲醇溶液，冰浴超声提取15min，提取时用锡箔纸包住锥形瓶。每提取一次都取提取液过滤，定容至25ml容量瓶中，过0.45um滤膜，进高效液相测定，记录峰面积，见表4和图5
表4 不同提取次数的峰面积和提取率
| 提取次数 | 峰面积1 | 峰面积2 | 平均峰面积 | 提取率（%） |
| 第一次 | 338.4938 | 338.7242 | 338.6090 | 89.3308 |
| 第二次 | 27.2673 | 27.9525 | 27.6099 | 7.2840 |
| 第三次 | 9.5885 | 7.8866 | 8.7375 | 2.3051 |
| 第四次 | 3.9952 | 4.1929 | 4.0940 | 1.0801 |
由以上数据可以看出提取到第四次时已经提取出将近99%的糠醛，且第四次已经很难积分，继续增加提取次数不仅增加实验误差，而且延长时间，提高成本，实际意义不大，所以最多提取四次。
作为进一步筛选，本发明还进行了正交试验，见表5、表6
表5 因素水平表
| 水平 | 料液比 | 提取时间（min） | 提取次数（次） |
| 1 | 1：8 | 15 | 2 |
| 2 | 1：10 | 25 | 3 |
| 3 | 1：12 | 35 | 4 |
表6 正交表
| 编号 | A | B | C | D | 5-羟甲基糠醛含量（mg/g） |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0.1716 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 0.1842 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 0.1837 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 0.1755 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 0.1847 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 0.1776 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 0.1796 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 0.1779 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 0.1830 |
| k1 | 0.1798 | 0.1756 | 0.1757 | 0.1797 | |
| k2 | 0.1793 | 0.1823 | 0.1809 | 0.1804 | |
| k3 | 0.1801 | 0.1814 | 0.1827 | 0.1791 | |
| R | 0.0009 | 0.0067 | 0.0070 | 0.0014 |
以5-羟甲基糠醛含量为评价指标,由直观分析可知,影响五味子干燥果实中5-羟甲基糠醛提取效果的因素顺序为C>B>A,提取次数>提取时间>料液比；由此可得最佳提取工艺为A3B2C3，即用12倍量甲醇，超声提取4次，每次25min。
本发明超声提取时间较长，为了验证5-HMF在提取条件下是否发生变化，将定容摇匀后的提取液，分别超声0，30，60，90，120，150min，测定其含量RSD为0.54%，说明在本实验超声提取过程中5-HMF未发生变化，见表7
表7 超声时间与含量关系
| 超声时间 | 含量 |
| 提取完样品不超声 | 0.1823 |
| 超声30min | 0.1826 |
| 超声60min | 0.1836 |
| 超声90min | 0.1809 |
| 超声120min | 0.1812 |
| 超声150min | 0.1821 |
| RSD | 0.54% |
色谱条件的筛选
选用了不同比例的乙腈-水溶液，结果发现比例为15:85，10:90和5:95时5-HMF的分离效果和峰形区别不明显。还选用了不同比例的甲醇-0.5%醋酸水，结果发现比例为15:85，10:90和5:95时5-HMF的分离效果和峰形没有明显区别。甲醇-0.5%醋酸水、乙腈-水溶剂系统中，优选选择甲醇-0.5%醋酸水（15:85）为流动相。
选择C18及C8色谱柱，均能实现本发明的目的，发现Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5um)峰形最好，优选Diamonsil C18（2）(5um，4.6mm×250mm)色谱柱。
五味子新鲜果实分别用水，甲醇，95%乙醇，85%乙醇，75%乙醇，乙酸乙酯冰浴超声提取1h，均未检出5-HMF。用水冷浸24h以及冷浸24h后再冰浴超声提取1h也未检出5-HMF，说明5-HMF并不是五味子在生长过程中产生的。
有益效果
本发明所提供的五味子中5-羟甲基糠醛的含量检测方法，是通过大量具体创造性试验筛选后得到的，通过对样品、供试品处理方法的筛选，流动相的选择，建立了五味子中5-羟甲基糠醛的含量检测方法HPLC分析方法，尤其是该方法供试品处理方法简单不需要过色谱柱、也不需要用毒有机溶剂反复萃取。该方法操作简便，重复性和稳定性好，结果准确可靠。
为了进一步说明本发明方法的有益效果，将方法学验证举例如下：
1.仪器和试药
1.1仪器与试剂Agilent1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，万分之一天平（AL204梅特勒-托利多仪器有限公司），十万分之一天平（XS105梅特勒-托利多仪器有限公司），Milli-Q超纯水机，电热鼓风干燥箱（天津市天宇实验仪器有限公司制造），超声波清洗器（KQ5200型，昆山市超声波仪器有限公司），L-550低速自动平衡离心机(长沙湘仪离心仪器有限公司)，WK-200B高速药物粉碎机(青州市精诚机械有限公司)。
5-HMF对照品（批号111626-201308，中国食品药品检定研究院），甲醇(色谱纯)，醋酸（色谱纯），水为实验室自制超纯水，其他试剂均为分析纯。
1.2药材五味子鲜果于2013年9月15日采自辽宁省新宾县，五味子干燥果实、种子和果肉由鲜果在相同的条件下烘干而成，20081001等12批五味子药材由天津天士力之骄药业有限公司提供（产地辽宁），以上药材经中国药科大学余伯阳教授鉴定。
2.方法与结果
2.1色谱条件色谱柱：Diamonsil C18（2）（4.6mm×250mm,5μm）；流动相：甲醇-0.5%醋酸水(15∶85)等度洗脱；流速1mL·min-1；检测波长284nm；柱温30℃；进样量10μL；
2.2供试品溶液的制备取五味子药材粉末（过60目筛）约1.00g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次25min，共提取4次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
2.3对照品溶液的制备精密称取5-HMF对照品6.07mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
2.4线性关系的考察精密量取对照品储备液，分别稀释2，4，8，10，16，32倍，分别进样10uL，按照上述色谱条件测定，记录峰面积。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得对照品的标准曲线见图2所示，线性回归方程为A=55810C+1.0921，r=0.9999，浓度在1.14～18.21μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.5精密度实验精密吸取对照品溶液按上述色谱条件连续进样6次，进样量10μL，测定5-HMF的峰面积。测得5-HMF峰面积的RSD为0.21%。结果表明仪器的精密度良好。
2.6稳定性实验取新制的供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10h按上述色谱条件进行色谱分析。测得5-HMF峰面积的RSD为0.98%。结果表明样品在10h内稳定性良好。
2.7重复性实验分别精密称取样品(批号20081001)6份，分别按给定供试品制备方法和色谱条件进行测定，记录峰面积。测得5-HMF平均含量为0.1618mg·g-1，RSD为2.0%，表明该方法重复性良好。
2.8加样回收率实验精密称取9份已知含量的五味子药材(批号20081001)，每份0.50g，精密称定，根据其含量的80%，100%，120%分别加入对照品储备溶液1.8，2.2，2.7mL，平行3份，按照“2.2供试品的制备”方法制备，在上述色谱条件下进行测定，计算回收率和RSD值。结果表明其平均加样回收率为100.06%，RSD1.0%。具体结果见表8。
表 85-HM F加样回收率试验结果(n=9)
2.9检测限与定量限在选定的色谱条件下，精密量取5-HMF对照品溶液适量，逐级稀释。最终确定检测限为0.04ng(S/N=3)，定量限为2.85ng(S/N≥10)。
附图说明
图1 5-HMF对照和五味子样品、溶剂空白HPLC图
其中A.为对照；B为.样品；C.为空白；1为5-HMF
图2 5-HMF线性关系曲线
图3不同溶剂用量的5-HMF峰面积
图4不同提取时间的5-HMF峰面积
图5不同提取次数的提取率
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
供试品溶液的制备过60目筛的取五味子药材粉末约1.00g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次25min，共提取4次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备精密称取5-HMF对照品6.07mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
高效液相色谱法测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以C18色谱柱、甲醇-0.5%醋酸水(15∶85)溶液的流动相等度洗脱、流速1mL·min-1、检测波长284nm、柱温30℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
实施例2
供试品溶液的制备过60目筛的取五味子药材粉末约0.50g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次20min，共提取3次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取5-HMF对照品5.00mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
高效液相色谱法测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以C18色谱柱；流动相：甲醇-0.5%醋酸水(15∶85)溶液的流动相等度洗脱；流速0.8mL·min-1；检测波长280nm；柱温25℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
实施例3
供试品溶液的制备过60目筛的取五味子药材粉末约1.50g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次35min，共提取4次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取5-HMF对照品8.00mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
高效液相色谱法测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，以C8色谱柱；流动相：甲醇-0.5%醋酸水(10∶85)溶液的流动相等度洗脱；流速1.2mL·min-1；检测波长282nm；柱温35℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
实施例4
供试品溶液的制备过60目筛的取五味子药材粉末约1.00g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次35min，共提取4次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取5-HMF对照品8.00mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
高效液相色谱法测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，以C18色谱柱；流动相：甲醇-0.5%醋酸水(5∶85)溶液的流动相等度洗脱；流速1mL·min-1；检测波长282nm；柱温30℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
实施例5
供试品溶液的制备过60目筛的取五味子药材粉末约1.00g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次25min，共提取4次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备精密称取5-HMF对照品6.00mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
高效液相色谱法测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以C18色谱柱；流动相：乙腈-水(15∶85)溶液的流动相等度洗脱；流速1mL·min-1；检测波长284nm；柱温30℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
实施例6
供试品溶液的制备过60目筛的取五味子药材粉末约0.5g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次20min，共提取3次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取5-HMF对照品5.00mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
高效液相色谱法测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以C18色谱柱；流动相：乙腈-水(15∶85)溶液的流动相等度洗脱；流速0.8mL·min-1；检测波长280nm；柱温25℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
实施例7
供试品溶液的制备过60目筛的取五味子药材粉末约1.50g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴振摇提取，每次25min，共提取4次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取5-HMF对照品8.00mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
高效液相色谱法测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μL，注入液相色谱仪，以C8色谱柱；流动相：乙腈-水(10∶85)溶液的流动相等度洗脱；流速1.2mL·min-1；检测波长282nm；柱温35℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
实施例8
供试品溶液的制备过60目筛的取五味子药材粉末约1.00g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴振摇提取，每次35min，共提取3次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取5-HMF对照品8.00mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
高效液相色谱法测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，以C18色谱柱；流动相：乙腈-水(5∶85)溶液的流动相等度洗脱；流速1mL·min-1；检测波长282nm；柱温30℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
实施例9
供试品溶液的制备过60目筛的取五味子药材粉末约1.00g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次25min，共提取4次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备精密称取5-HMF对照品6.07mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
高效液相色谱法测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以C18色谱柱；流动相：甲醇-0.5%醋酸水(15∶85)溶液的流动相等度洗脱；流速1mL·min-1；检测波长284nm；柱温30℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
实施例10
供试品溶液的制备过60目筛的取五味子药材粉末约1.20g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次25min，共提取4次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备精密称取5-HMF对照品6.07mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
高效液相色谱法测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以C18色谱柱、甲醇-0.5%醋酸水(15∶85)溶液的流动相等度洗脱、流速1mL·min-1、检测波长284nm、柱温30℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
实施例11
供试品溶液的制备过60目筛的取五味子药材粉末约1.20g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次15min，共提取4次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备精密称取5-HMF对照品6.07mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
高效液相色谱法测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以C18色谱柱、甲醇-0.5%醋酸水(15∶85)溶液的流动相等度洗脱、流速1mL·min-1、检测波长284nm、柱温30℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
实施例12
供试品溶液的制备过60目筛的取五味子药材粉末约0.80g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次25min，共提取4次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备精密称取5-HMF对照品6.07mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
高效液相色谱法测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以C18色谱柱、甲醇-0.5%醋酸水(15∶85)溶液的流动相等度洗脱、流速1mL·min-1、检测波长284nm、柱温30℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
实施例13
供试品溶液的制备过60目筛的取五味子药材粉末约0.60g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次20min，共提取3次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取5-HMF对照品5.00mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
高效液相色谱法测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以C18色谱柱；流动相：甲醇-0.5%醋酸水(15∶85)溶液的流动相等度洗脱；流速0.8mL·min-1；检测波长280nm；柱温25℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
实施例14
供试品溶液的制备过60目筛的取五味子药材粉末约0.48g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次15min，共提取4次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取5-HMF对照品8.00mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
高效液相色谱法测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，以C8色谱柱；流动相：甲醇-0.5%醋酸水(10∶85)溶液的流动相等度洗脱；流速1.2mL·min-1；检测波长282nm；柱温35℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
Claims (7)
1.一种五味子中5-羟甲基糠醛含量的检测方法，包括以下步骤
(A)供试品溶液的制备：取过60目筛的五味子药材粉末0.5-1.5g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声或冰浴振摇提取，每次20-35min，共提取3-4次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液；
(B)对照品溶液的制备
(C)高效液相色谱法测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，按照如下色谱条件测定，外标法定量，计算，即得：
色谱柱：选自C18或C8柱；
流动相：选自体积比为5-15∶95-85的甲醇-0.5％醋酸水溶液或体积比为10-15:90-85乙腈-水溶液，等度洗脱；
流速：0.8-1.2mL·min-1；
检测波长：280-284nm；
柱温：25-35℃；
进样量：10-20μL。
2.根据权利要求1所述的一种五味子中5-羟甲基糠醛含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(B)为精密称取5-HMF对照品，加甲醇溶解，定容，摇匀即得。
3.根据权利要求1所述的一种五味子中5-羟甲基糠醛含量的检测方法，其特征在于，
所述步骤(A)为取过60目筛的五味子药材粉末约1.00-1.50g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次25min，共提取3次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
4.根据权利要求1所述的一种五味子中5-羟甲基糠醛含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(B)为取5-HMF对照品5.00-8.00mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀；从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。
5.根据权利要求1所述的一种五味子中5-羟甲基糠醛含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(C)中的色谱条件为
色谱柱：C18；
流动相：选自体积比为15∶85的甲醇-0.5％醋酸水溶液
流速：1mL·min-1；
检测波长：284nm；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
6.根据权利要求5所述的一种五味子中5-羟甲基糠醛含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(C)中色谱柱是规格为4.6×250mm，粒径为5μm。
7.根据权利要求5所述的一种五味子中5-羟甲基糠醛含量的检测方法，其特征在于，所述骤(A)为
取过60目筛的五味子药材粉末约1.00g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12mL，冰浴超声提取，每次25min，共提取4次，合并提取液，离心，过滤，至50mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液，
所述步骤(B)为
精密称取5-HMF对照品6.00mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀，从中精密吸取3mL置50mL量瓶中,加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用，
所述步骤(C)为
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，以C18色谱柱、甲醇和0.5％的醋酸水溶液的体积比为15∶85的流动相等度洗脱、流速1mL·min-1、检测波长284nm、柱温30℃的色谱条件测定，外标法定量，计算，即得。
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