CN105158352B

CN105158352B - 一种冠心宁片的指纹图谱的建立方法及其应用

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Publication number: CN105158352B
Application number: CN201510406716.6A
Authority: CN
Inventors: 林徐剑; 柴建国; 戴金明; 施晓萍; 沈莹; 张文杰
Original assignee: ZHENGDA QINGCHUNBAO PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: ZHENGDA QINGCHUNBAO PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2035-07-10
Also published as: CN105158352A

Abstract

本发明公开了一种冠心宁片的指纹图谱的建立方法，取10个批次以上的冠心宁片研细后混匀，加入蒸馏水或体积浓度0～100％的甲醇水溶液，超声处理，放冷，过滤，取滤液，得供试品溶液，然后进行高效液相色谱分析，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积浓度0.1％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，得到不同批次冠心宁片的液相色谱图，导入国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，设置多点校正，自动匹配，软件自动生成冠心宁片的标准指纹图谱。本发明获得的冠心宁片的标准指纹图谱可用于冠心宁片生产工艺监控、质量评价或者真伪鉴别中的检测。

Description

一种冠心宁片的指纹图谱的建立方法及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种中药制剂的指纹图谱的建立方法，具体涉及一种冠心宁片的指纹图谱的建立方法及其应用。

(二)背景技术

冠心宁片为正大青春宝药业有限公司研发的中药新产品，于2015年4月获得国家食品药品监督管理总局颁发的生产批件。它是丹参和川芎两味中药组成的复方制剂，系部颁中药17册收载的“冠心宁注射液”经改变给药途径研制而成的中药制剂。冠心宁片具有活血化瘀、通脉养心的功效，用于冠心病稳定型劳累性心绞痛Ⅰ、Ⅱ级中医辩证属心血瘀阻证，症见胸痛、唇舌紫暗。

冠心宁片质量标准中的含量测定成分为丹参中的丹酚酸B和川芎中的阿魏酸，且这两个成分在治疗心血管疾病方面具有较强的药理作用。对于目前的中药复方制剂来说，能够做到对处方中的每一味药物都有一个含量测定的成分，已经是一个比较高的水平。但是如果要比较全面地对一个中药制剂进行质量控制，中药指纹图谱技术是一个可行且有效的手段。指纹图谱能够比较全面地反映产品中各物质的种类和含量，使得对产品的质量控制更加精准，更能准确和真实地反映出产品的质量。

(三)发明内容

本发明提供了一种冠心宁片的指纹图谱的测定方法，该方法精密度、重复性、稳定性良好，获得的色谱峰较多且分离度较好，指纹图谱的相似度高，能更加全面反应出冠心宁片的产品质量。

本发明采用的技术方案是：

一种冠心宁片的指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：将冠心宁片研细后混匀，精密称取0.05～0.50g，加入25～100mL的蒸馏水或体积浓度0～100％的甲醇水溶液，超声处理10～30分钟，放冷，过滤，取滤液，即得供试品溶液；

(2)色谱分析：取10个以上批次的冠心宁片按照步骤(1)方法制备供试品溶液，然后按照以下条件进行高效液相色谱分析，得到不同批次冠心宁片的液相色谱图；

色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积浓度0.1％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～10min时流动相A的体积分数为97％，10～30min时流动相A的体积分数为97～87％，30～35min时流动相A的体积分数为87～86％，35～60min时流动相A的体积分数为86～80％，60～90min时流动相A的体积分数为80～77％，90～100min时流动相A的体积分数为77～75％，检测波长为250～330nm，柱温为20～30℃；

(3)步骤(2)获得的不同批次冠心宁片的液相色谱图导入国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，设置多点校正，自动匹配，软件自动生成冠心宁片的标准指纹图谱。

所述步骤(1)中，所述超声处理的条件为：超声频率25KHz、超声功率80～100W。

所述步骤(1)中，所述体积浓度0～100％的甲醇水溶液，其中的0代表无限接近于0但不为0。

优选步骤(1)中加入蒸馏水或体积浓度50％的甲醇水溶液，更优选蒸馏水。

进一步，优选步骤(1)按以下操作：将冠心宁片研细后混匀，精密称取0.10g，加入50mL的蒸馏水或体积浓度50％的甲醇水溶液，在超声频率25KHz、超声功率100W的条件下超声处理20分钟，放冷，过滤，取滤液，即得供试品溶液。

所述步骤(2)中，优选色谱柱为ZORBAX SB-C18柱，柱长250mm，内径4.6mm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，填充剂粒径5μm，流速：1.0ml/min，柱温：25℃；DAD紫外检测器检测波长：285nm。

所述步骤(2)中，以体积浓度0.1％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流动相A的体积分数是指流动相A的体积与流动相A和B的体积总和之比，流动相A和流动相B的体积分数之和为100％。这是本领域技术人员公知的。

所述步骤(2)中，梯度洗脱程序中，10～30min时流动相A的体积分数为97～87％，是指设定10～30min内，流动相A的体积分数从97％线性下降至87％，这是本领域技术人员在设定高效液相色谱仪的梯度洗脱程序时的通用表示方法。

即梯度洗脱程序为：0～10min时流动相A的体积分数为97％，10～30min时流动相A的体积分数从97％线性下降至87％，30～35min时流动相A的体积分数从87％线性下降至86％，35～60min时流动相A的体积分数从86％线性下降至80％，60～90min时流动相A的体积分数从80％线性下降至77％，90～100min时流动相A的体积分数从77％线性下降至75％。

本发明还提供按上述方法获得的标准指纹图谱，如图4所示，有6个已定性的色谱特征峰，分别为：丹参素对应的4号色谱峰，原儿茶醛对应的6号色谱峰，咖啡酸对应的10号色谱峰，阿魏酸对应的11号色谱峰，迷迭香酸对应的15号色谱峰，丹酚酸B对应的17号色谱峰。

定性色谱特征通过将供试品溶液的液相色谱图与对照品溶液的液相色谱图比对获得。

以丹酚酸B对应的17号峰为参照峰，标准指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积如下表1：

表1

共有峰编号	相对保留时间	相对峰面积
			1	0.08～0.09	0.02～0.03
2	0.10～0.11	0.02～0.03
			3	0.16～0.17	0.03～0.04
4	0.22～0.23	0.12～0.13
			5	0.29～0.30	0.01～0.02
6	0.31～0.32	0.09～0.10
			8	0.37～0.38	0.02～0.03
10	0.40～0.41	0.03～0.04
			11	0.57～0.58	0.07～0.08
12	0.73～0.74	0.04～0.05
			13	0.74～0.75	0.38～0.39
14	0.80～0.81	0.07～0.08
			15	0.82～0.83	0.06～0.07
16	0.88～0.89	0.07～0.08
			17	1.00	1.00
18	1.10～1.11	0.19～0.21

本发明获得的冠心宁片的标准指纹图谱可用于冠心宁片生产工艺监控、质量评价或者真伪鉴别中。

进一步，所述应用的方法为：将待测冠心宁片样品按照步骤(1)、(2)的方法获得待测样品的液相色谱图，与标准指纹图谱进行比对，相似度在0.95以上判定为合格产品，相似度低于0.95判定为不合格产品。

与现有技术相比，本发明的优势体现在：该方法精密度、重复性、稳定性良好；获得的色谱峰较多且分离度较好，指纹图谱的相似度高。能更加全面反应出冠心宁片的产品质量，能够应用于冠心宁片的生产过程控制和成品的质量评价。

(四)附图说明

图1为混合对照品溶液的色谱图，色谱峰a为丹参素钠对照品、色谱峰b为原儿茶醛对照品、色谱峰c为咖啡酸对照品、色谱峰d为阿魏酸对照品、色谱峰e为迷迭香酸对照品、色谱峰f为丹酚酸B对照品。

图2为批号S1的冠心宁片样品的供试品溶液的高效液相色谱图。

图3为11个不同批次样品的液相色谱图；图3中的R曲线为软件自动生成的标准指纹图谱。

图4为标准指纹图谱。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：冠心宁片的指纹图谱建立

(1)高效液相色谱条件

仪器名称：安捷伦1100高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱：ZORBAX SB-C18(柱长250mm，内径4.6mm)，填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶(粒径5μm)，流速：1.0ml/min，柱温：25℃

DAD紫外检测器检测波长：285nm

以体积浓度0.1％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱条件为0～10min时流动相A为97％，10～30min时流动相A为97～87％，30～35min时流动相A为87～86％，35～60min时流动相A为86～80％，60～90min时流动相A为80～77％，90～100min时流动相A为77～75％。

(2)对照品溶液的制备：

a、丹参素钠对照品溶液：精密称取减压干燥12小时的丹参素钠对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110855-200506)8.7mg，置25ml量瓶中，用水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取4ml，置25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀即得(每1ml中含丹参素钠55.68μg，含丹参素49.83μg)。

b、原儿茶醛对照品溶液：精密称取减压干燥12小时的原儿茶醛对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110810-200506)8.4mg，置25ml量瓶中，用水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取4ml，置25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀即得(每1ml中含原儿茶醛53.76μg)。

c、咖啡酸对照品溶液：精密称取减压干燥12小时的咖啡酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110885-200102)4.7mg，置50ml量瓶中，用水超声溶解并稀释至刻度，摇匀即得(每1ml中含咖啡酸94μg)。

d、阿魏酸对照品溶液：精密称取减压干燥12小时的阿魏酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110773-201313，含量以99.6％计算)8.0mg，置25ml量瓶中，用水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀即得(每1ml中含阿魏酸12.75μg)。

e、迷迭香酸对照品溶液：精密称取迷迭香酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111871-201203，含量以98.8％计)2.2mg，置50ml量瓶中，用水超声溶解并稀释至刻度，摇匀即得(每1ml中含迷迭香酸43.47μg)。

f、丹酚酸B对照品溶液：精密称取丹酚酸B对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111562-201212，含量以95.4％计算)12.0mg，置50ml量瓶中，用水超声溶解并稀释至刻度，摇匀即得(每1ml中含丹酚酸B22.90μg)。

g、混合对照品溶液：取上述对照品溶液各1ml，混合，摇匀，即得。混合对照品溶液按照步骤(1)色谱条件进样测定，得混合对照品溶液的色谱图，如图1所示。

(3)供试品溶液的制备：

取11个批次的冠心宁片，分别研细混匀，各精密称取0.10g，加入50mL的蒸馏水，在超声频率25KHz、超声功率100W的条件下超声处理20分钟，放冷，过滤，取滤液，即得供试品溶液。

(4)指纹图谱的建立：

将11个批次的冠心宁片按照步骤(1)的色谱条件进样测定，获得11个样品的液相色谱图，如图3所示，其中S1批号样品的液相色谱图如图2所示。将11个样品的液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，采用多点校正，自动匹配，产生标准指纹图谱，如图4所示，各样品图谱与标准指纹图谱比对，相似度较高，如表2所示，均在0.95以上。

表2

批号	数据文件	相似度(对照)
			S1	15050411.cdf	0.999
S2	15050401.cdf	0.992
			S3	15050402.cdf	0.960
S4	15050403.cdf	0.960
			S5	15050404.cdf	0.959
S6	15050405.cdf	0.998
			S7	15050406.cdf	0.998
S8	15050407.cdf	0.998
			S9	15050408.cdf	0.996
S10	15050409.cdf	0.996
			S11	15050410.cdf	0.996

实施例2测定方法学考察如下：

精密度实验：取同一批次的冠心宁片，按照实施例1的供试品处理方法和色谱条件下，重复进样6次，以丹酚酸B为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD均小于3％。结果如下表3和表4：

表4

重复性实验：取同一批次的冠心宁片，按照实施例1的供试品处理方法和色谱条件下，配置6份进样，以丹酚酸B为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD均小于3％。结果如下表表5和表6：

表5

表6

稳定性实验：取同一批次的冠心宁片，按照实施例1的供试品处理方法和色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、10、24h进样，以丹酚酸B为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD均小于3％。结果如下表7和表8：

表7

表8

Claims

1.一种冠心宁片的标准指纹图谱在冠心宁片生产工艺监控、质量评价或者真伪鉴别中的应用；

所述的标准指纹图谱的建立方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：将冠心宁片研细后混匀，精密称取0.05～0.50g，加入25～100mL的蒸馏水或体积浓度0～100％的甲醇水溶液，其中的0代表无限接近于0但不为0，超声处理10～30分钟，放冷，过滤，取滤液，即得供试品溶液；

(3)步骤(2)获得的不同批次冠心宁片的液相色谱图导入国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，设置多点校正，自动匹配，软件自动生成冠心宁片的标准指纹图谱;

所述标准指纹图谱，有6个已定性的色谱特征峰，分别为：丹参素对应的4号色谱峰，原儿茶醛对应的6号色谱峰，咖啡酸对应的10号色谱峰，阿魏酸对应的11号色谱峰，迷迭香酸对应的15号色谱峰，丹酚酸B对应的17号色谱峰；

以丹酚酸B对应的17号峰为参照峰，标准指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积如下表：

共有峰编号相对保留时间相对峰面积 1 0.08～0.09 0.02～0.03 2 0.10～0.11 0.02～0.03 3 0.16～0.17 0.03～0.04 4 0.22～0.23 0.12～0.13 5 0.29～0.30 0.01～0.02 6 0.31～0.32 0.09～0.10 8 0.37～0.38 0.02～0.03 10 0.40～0.41 0.03～0.04 11 0.57～0.58 0.07～0.08 12 0.73～0.74 0.04～0.05 13 0.74～0.75 0.38～0.39 14 0.80～0.81 0.07～0.08 15 0.82～0.83 0.06～0.07 16 0.88～0.89 0.07～0.08 17 1.00 1.00 18 1.10～1.11 0.19～0.21

。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：将待测冠心宁片样品按照权利要求1的步骤(1)、(2)的方法获得待测样品的液相色谱图，与标准指纹图谱进行比对，相似度在0.95以上判定为合格产品，相似度低于0.95判定为不合格产品。