CN107966518B - 一种无烟气烟草制品的处理方法及无烟气烟草制品中小分子醛的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种无烟气烟草制品的处理方法及无烟气烟草制品中小分子醛的测定方法，属于无烟气烟草制品的理化检验技术领域。本发明的无烟气烟草制品的处理方法，包括以下步骤：将无烟气烟草制品与溶剂混合，再与衍生化试剂混合进行衍生化反应，用萃取剂萃取衍生化反应的产物；所述萃取剂为正己烷或异己烷。本发明的无烟气烟草制品的处理方法，简单可行，采用2,4‑二硝基苯肼对无烟气烟草制品中的醛类物质进行定向选择，排除其它物质的干扰，再用萃取剂进行萃取，无需过滤即可直接进行UPLC‑HRMS检测，简单可行，便于操作。

Description

一种无烟气烟草制品的处理方法及无烟气烟草制品中小分子 醛的测定方法
技术领域
本发明涉及一种无烟气烟草制品的处理方法及无烟气烟草制品中小分子醛的测定方法，属于无烟气烟草制品的理化检验技术领域。
背景技术
卷烟烟气中的小分子醛类化合物是烟气中重要的一类有害物质。其中的甲醛、乙醛、丙醛、丙烯醛、丁醛和巴豆醛被列入1998年加拿大卫生部公布的卷烟烟气有害成分名单。由于小分子醛挥发性和亲水性强，在反相色谱柱中几乎无保留，离子化困难，一般通过柱前衍生化方法将其转变为较大分子量的物质后进行定量分析，以增强检测的灵敏度和结果的可靠性。目前常用的衍生化试剂是2,4-二硝基苯肼(DNPH)，检测方式主要是液相色谱，这是CORESTA推荐的检测主流烟气中羰基化合物的方法(CRM No.74Determination ofSelected Carbonyls in Mainstream Cigarette Smoke by High Performance LiquidChromatography)和我国烟草行业发布的标准方法(YC/T 254–2008卷烟主流烟气中主要羰基化合物的测定高效液相色谱法；YC/T 378-2010卷烟测流烟气中羰基化合物的测定高效液相色谱法)。
近些年受世界控烟运动的影响和烟草监管立法的愈加严格，无烟气烟草制品作为一种非燃烧途径的烟草消费品，相对于传统卷烟有较低的安全风险，并在一定程度上消除了二手烟的危害，因此在许多国家的销量和消费比例持续上升。但是这并不能因此说明无烟气烟草制品是绝对安全的，FDA于2012年将甲醛、乙醛、丙醛、丙烯醛和巴豆醛列入烟草制品和烟气中有害或有潜在危害成分(HPHCs)，其中无烟气烟草制品中主要关注甲醛、乙醛和巴豆醛。考虑到无烟气烟草制品的样品形态、成分和消费方式与传统卷烟均有较大差异，不能直接采用烟气中羰基化合物的检测方法。另一方面，传统的液相色谱方法中为避免丙酮、丁酮对丙醛、丁醛的干扰，往往采用常规色谱柱进行长时间的分离，不利于样品的高通量和快速分析。
无烟气烟草制品的种类很多。根据消费方式可分为口用型、鼻用型和口鼻两用型，其中口用型又分为瑞典含烟(snus)、美式含烟(moist snuff)、嚼烟(chewingtobacco)、烟草膏(paste)、牙粉(tooth powder)、可溶烟草片(dissolvable tobacco)等，鼻用型即通常说的鼻烟，口鼻两用型主要为干鼻烟(dry snuff)。这些产品的形态也各不相同。因此开发无烟气烟草制品中小分子醛的分析方法，针对性的样品处理方法是不可缺少的部分。
申请公布号为CN 104950064A的中国发明专利公开了一种使用UPLC-IE法测定无烟气烟草制品中主要羰基化合物的方法，所述主要羰基化合物为甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛，该方法是利用乙酸水溶液萃取无烟气烟草制品中的主要羰基化合物并通过衍生化处理后，再利用超高效液相色谱等度洗脱法分析无烟气烟草制品中的主要羰基化合物，但是所需分析时间较长，检测限高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无烟气烟草制品的处理方法，同步实现无烟气烟草样品中小分子醛的提取与衍生化，处理后无需过滤即可直接进行后续检测。
本发明的第二个目的在于提供一种无烟气烟草制品中小分子醛的测定方法，该测定方法分析时间短且检测限低。
为实现上述目的，本发明一种无烟气烟草制品的处理方法的技术方案是：
一种无烟气烟草制品的处理方法，包括以下步骤：将无烟气烟草制品与溶剂混合，再与衍生化试剂混合进行衍生化反应，用萃取剂萃取衍生化反应的产物；所述萃取剂为正己烷或异己烷。
所述溶剂为甲酸铵缓冲液。甲酸铵缓冲液为衍生化反应提供弱酸性环境，稳定pH，保证衍生反应环境的一致，提高结果的可靠性。
所述无烟气烟草制品为口用型、鼻用型或口鼻两用型。
所述无烟气烟草制品在与溶剂混合前研磨成粉。对于粉末细小颗粒状的无烟气烟草制品无需进行研磨预处理。
所述衍生化试剂为DNPH的乙腈溶液。无烟气烟草制品中的小分子醛与DNPH反应生成相应的腙。
上述萃取剂正己烷或异己烷不与水混溶，密度低于水，易于溶解小分子醛衍生化反应得到的腙，能溶于流动相，利于后续测定中的快速洗脱。
上述萃取剂优选为异己烷。异己烷毒性小，对小分子醛衍生化反应得到的腙具有良好的萃取效果，萃取后无需过滤即可直接进行后续测定。
所述DNPH的乙腈溶液的配制方法包括以下步骤：取0.3g 2,4-二硝基苯肼用乙腈溶解并定容至100mL，即得。所述2,4-二硝基苯肼的乙腈溶液室温避光保存。有效期为3个月。
上述每0.5g无烟气烟草样品对应加入20mL甲酸铵缓冲液。所述甲酸铵缓冲液、DNPH的乙腈溶液、萃取剂的体积比为20:1:5。
所述甲酸铵缓冲液由包括以下步骤的制备方法制得：将6.3g甲酸铵用900mL水溶解，用甲酸调pH至3.0，然后用水定容至1L，即得。所述甲酸铵缓冲液室温保存。有效期为1个月。
上述萃取为超声萃取10～20min。超声波萃取利用超声波产生的空化作用和成穴现象、机械振动、扰动效应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行。因此超声波提取的耗时短，效率高，简单易行。
本发明一种无烟气烟草制品中小分子醛的测定方法的技术方案是：
一种无烟气烟草制品中小分子醛的测定方法，包括以下步骤：
1)将无烟气烟草制品与溶剂、内标溶液混合，再与衍生化试剂混合进行衍生化反应，用萃取剂萃取衍生化反应的产物，然后静置分层；所述萃取剂为正己烷或异己烷；
2)取步骤1)中静置分层所得的上层液进行UPLC-HRMS测定，内标法定量，即得。
所述小分子醛为碳原子数≤4的醛。
所述小分子醛为甲醛、乙醛、丙醛、丙烯醛、丁醛、巴豆醛中的任意一种或几种。
步骤1)中的萃取剂优选为异己烷。
步骤1)中的溶剂为甲酸铵缓冲液。所述甲酸铵缓冲液由包括以下步骤的制备方法制得：将6.3g甲酸铵用900mL水溶解，用甲酸调pH至3.0，然后用水定容至1L，即得。所述甲酸铵缓冲液室温保存。有效期为1个月。
步骤1)中的萃取为超声萃取10～20min。
所述无烟气烟草制品为口用型、鼻用型或口鼻两用型。所述口用型包括瑞典含烟(snus)、美式含烟(moist snuff)、嚼烟(chewing tobacco)、烟草膏(paste)、牙粉(toothpowder)、可溶烟草片(dissolvable tobacco)等。所述鼻用型即通常说的鼻烟。所述口鼻两用型主要为干鼻烟(dry snuff)。
对于粉末细小颗粒状的无烟气烟草制品在与溶剂混合前无需进行预处理。例如散装瑞典含烟、美式含烟和干鼻烟。
对于袋装含烟、松散嚼烟、块状嚼烟等含水量和尺寸均比较大的样品，在与溶剂混合前用液氮快速冻干后磨成粉末。
对于可溶性烟草含片等含水量小、硬度低的块状样品，可直接磨成粉末。
对于胶基型烟草制品等含水量小、粘度大的样品，需剪成小块。将处理好的样品放入-20℃环境进行储存。测定前将无烟气烟草制品于-20℃的存储条件下取出，于4℃环境下放置1-2天，再在室温下平衡1-2h。称取样品后，将剩余的样品再次密封包装后放入-20℃的低温环境中。
所述内标溶液为甲醛-d2和乙醛-d4的混合溶液。
所述甲醛-d2和乙醛-d4的浓度均为0.01mg/mL。所述甲醛-d2为甲醛的内标。所述乙醛-d4为乙醛、丙醛、丙烯醛、丁醛和巴豆醛的内标。
上述以甲醛-d2和乙醛-d4为内标，如此设置，无烟气烟草制品中的小分子醛与甲醛-d2和乙醛-d4在相同的体系中同时进行衍生化反应，与现有技术中以甲醛-d2-2,4-二硝基苯腙及乙醛-d4-2,4-二硝基苯腙为内标相比，由于小分子醛与内标物发生衍生化反应的环境和历程相同，能够排除体系环境的干扰，使后续测定更为准确。
所述内标溶液可以仅为甲醛-d2溶液。甲醛、乙醛、丙醛、丙烯醛、丁醛和巴豆醛均以甲醛-d2溶液为内标进行定量。
所述内标溶液可以仅为乙醛-d4溶液。甲醛、乙醛、丙醛、丙烯醛、丁醛和巴豆醛均以乙醛-d4溶液为内标进行定量。
所述衍生化试剂为DNPH的乙腈溶液。所述DNPH的乙腈溶液的配制方法包括以下步骤：0.3g 2,4-二硝基苯肼用乙腈溶解并定容至100mL，即得。所述DNPH的乙腈溶液室温避光保存。有效期为3个月。
步骤1)中每0.5g无烟气烟草制品对应加入4～6mL萃取剂。
所述甲酸铵缓冲液、内标溶液、衍生化试剂、萃取剂的体积比为20:0.1:1:5。
所述UPLC-HRMS测定中色谱柱为ACQUITY UPLC@BEH C18，流动相A：超纯水，流动相B：乙腈，进行梯度洗脱，所述洗脱梯度为：0min A55％，B 45％；1min A55％，B 45％；6min A45％，B 55％。
所述流动相A超纯水的电阻率为18.20MΩ·cm。
所述流动相B乙腈为色谱纯。
上述ACQUITY UPLC@BEH C18色谱柱的柱温为25℃。上述ACQUITY UPLC@BEH C18色谱柱的规格为2.1×50mm，1.7μm。所述ACQUITY UPLC@BEH C18色谱柱稳定性好，适用pH范围宽，保留时间短。
上述UPLC-HRMS测定中UPLC分析的样品室温度为4℃；进样体积5μL；流速0.3mL/min。
所述UPLC-HRMS测定中高分辨质谱的测定条件为：电加热喷雾离子源；离子源加热温度300℃；负离子模式；鞘气、辅助气、吹扫气的流速分别为30arb、10arb和0arb；喷雾电压2.5kV；离子传输毛细管加热温度320℃；扫描模式target-MS2；分辨率35000。
步骤2)中的内标法定量为：以小分子醛对应的衍生化产物的特征二级离子峰面积与相应内标的衍生化产物的特征二级离子的峰面积之比为信号强度(y)，对小分子醛对应的衍生化产物在异己烷中的浓度(x，权重为1/x)进行线性拟合，拟合过程中舍弃相对偏差超过20％的数据点。根据标准曲线对样品中小分子醛的含量进行计算。采用加权最小二乘法进行线性拟合，由于x不是线性分布的，而低浓度的点比较密集，加权1/x能够保证拟合曲线在低浓度区域的偏差更小。
上述标准曲线的制作包括以下步骤：
向9个50mL锥形瓶中分别加入20mL甲酸铵缓冲液、2mL各标准工作溶液、0.1mL内标溶液、1mL DNPH的乙腈溶液、5mL异己烷，封口后超声20min，然后静置分层，取1mL上层有机相转移至棕色样品瓶中，在24h内进行UPLC-HRMS分析检测，以小分子醛对应的衍生化产物的特征二级离子峰面积与其相应的内标衍生化产物的二级离子的峰面积之比为纵坐标，以小分子醛对应的衍生化产物在上层有机相中的对应浓度为横坐标，作曲线即得。
上述标准工作溶液的配制，包括以下步骤：
向6个不同的50mL容量瓶中分别加入约25mL去离子水，再分别加入0.5g甲醛、0.5g乙醛、0.5g丙醛、0.5g丙烯醛、0.5g丁醛、0.5g巴豆醛，混匀后用去离子水定容，得到浓度为10mg/mL的6种储备液；分别移取5mL的上述6种标准储备液于同一个500mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，得6种小分子醛浓度均为0.1mg/mL的标准储备液；准确移取1mL标准储备液至10mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，得浓度为0.01mg/mL的一级标准溶液；准确移取1mL一级标准溶液至10mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，得浓度为0.001mg/mL的二级标准溶液；分别准确移取0.1mL、0.5mL、1mL二级标准溶液，0.3mL、0.6mL、1mL一级标准溶液，0.3mL、0.5mL、0.8mL标准储备液至9个不同的10mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，得系列标准工作溶液。所述系列标准工作溶液现配现用。所述标准储备液、一级标准溶液、二级标准溶液于4℃保存，有效期为1个月。
本发明的无烟气烟草制品中小分子醛的测定方法，采用本发明的无烟气烟草制品的处理方法进行处理后，还可以采用现有技术中的超高效合相色谱、UPLC-IE法进行测定。
本发明的有益效果是：
本发明的无烟气烟草制品的处理方法，简单可行，能够同步实现无烟气烟草制品中小分子醛的提取和DNPH衍生化，排除其它物质的干扰，无需过滤即可直接进行后续检测，简单可行，便于操作。
本发明的无烟气烟草制品中小分子醛的测定方法，可简单、快速地提取各种无烟气烟草制品的分析物并实现灵敏、准确地测定，为无烟气烟草制品质量控制提供技术支持。
本发明的无烟气烟草制品中小分子醛的测定方法，采用水-异己烷/正己烷双相体系同步实现甲醛、乙醛、丙醛、丙烯醛、丁醛和巴豆醛的提取和DNPH衍生化，然后通过超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-HRMS)以缩短分析时间，选择特征二级离子进行质谱定量以降低同分异构体的干扰，丙醛、丁醛的特征二级离子是丙醛和丁醛特有的，可以排除丙酮和丁酮的干扰，提高测定的效率和结果的准确度。
本发明的无烟气烟草制品中小分子醛的测定方法，分析时间短，5min即可完成分析检测，且检测限低、灵敏度高，检测限为0.02-0.27ng/mL。
附图说明
图1为实施例1标准工作溶液制备的样品中小分子醛和内标的衍生化产物的特征二级离子色谱图；
图2为实施例1待测液中小分子醛和内标的衍生化产物的特征二级离子色谱图。
具体实施方式
下述实施例中所需溶液的配制：
内标溶液：甲醛-d2和乙醛-d4的浓度均为0.01mg/mL的甲醛-d2、乙醛-d4混合溶液。
DNPH的乙腈溶液：称取0.3g DNPH(2,4-二硝基苯肼)，用乙腈溶解并定容至100mL。室温避光保存，有效期为3个月。
甲酸铵缓冲液：称取6.3g甲酸铵，用900mL去离子水溶解，加入甲酸调节pH至3.0，随后用去离子水定容至1L。室温保存，有效期为1个月。
系列标准工作溶液的配制：
向6个不同的50mL容量瓶中分别加入约25mL去离子水，再分别加入0.5g甲醛、0.5g乙醛、0.5g丙醛、0.5g丙烯醛、0.5g丁醛、0.5g巴豆醛，混匀后用去离子水定容，得到浓度为10mg/mL的6种储备液；分别移取5mL的上述6种标准储备液于同一个500mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，得6种小分子醛浓度均为0.1mg/mL的标准储备液；准确移取1mL标准储备液至10mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，得浓度为0.01mg/mL的一级标准溶液；准确移取1mL一级标准溶液至10mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，得浓度为0.001mg/mL的二级标准溶液；分别准确移取0.1mL、0.5mL、1mL二级标准溶液，0.3mL、0.6mL、1mL一级标准溶液，0.3mL、0.5mL、0.8mL标准储备液至9个不同的10mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，得9级系列标准工作溶液，具体浓度见表1所示。
表1 9级系列标准工作溶液的浓度(mg/L)
Figure BDA0001498990260000071
Figure BDA0001498990260000081
实施例1
本实施例的无烟气烟草样品的处理方法，包括以下步骤：
称取0.5g某散装瑞典含烟样品，依次加入20mL甲酸铵缓冲液、1mLDNPH的乙腈溶液、5mL异己烷，封口后超声20min，然后静置分层，取1mL上层有机相转移至棕色样品瓶中，备用。
本实施例的无烟气烟草制品中小分子醛的测定方法，包括以下步骤：
1)称取0.5g某散装瑞典含烟样品，依次加入20mL甲酸铵缓冲液、0.1mL内标溶液、1mL DNPH的乙腈溶液、5mL异己烷，封口后超声20min，然后静置分层，取1mL上层有机相转移至棕色样品瓶中，得待测液，备用；
2)标准工作曲线的制作
向9个50mL锥形瓶中加入20mL甲酸铵缓冲液、2mL各标准工作溶液、0.1mL内标溶液、1mL DNPH的乙腈溶液、5mL异己烷，封口后超声20min，然后静置分层，取1mL上层有机相转移至棕色样品瓶中，在24h内进行UPLC-HRMS分析检测，以小分子醛对应的腙的特征二级离子峰面积与相应内标对应的腙的二级离子的峰面积之比为信号强度(y)，对小分子醛对应的腙在上层有机相中的浓度(x，权重为1/x)进行线性拟合。甲醛的对应的标准曲线为Y＝0.265489+0.00615067*X，乙醛对应的标准曲线为Y＝1.17925+0.0336209*X，丙烯醛对应的标准曲线为Y＝-0.230033+0.0190991*X，丙醛对应的标准曲线为Y＝0.133116+0.0241859*X，巴豆醛对应的标准曲线为Y＝0.172078+0.017316*X，丁醛对应的标准曲线为Y＝0.0229607+0.0166096*X。所测得的第9级标准工作溶液对应的有机相中小分子醛和内标的特征二级离子色谱图如图1所示。
上述UPLC仪器参数：Ultimate 3000液相色谱仪；ACQUITY UPLC@BEH C18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm,Waters公司)；柱温25℃；样品室温度4℃；进样体积5μL；流速0.3mL/min；流动相A：超纯水(18.20MΩ·cm)，流动相B：乙腈(色谱纯)；洗脱梯度见表2。
表2洗脱梯度
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 梯度曲线
0 55 45 线性
1 55 45 线性
6 45 55 线性
上述HRMS仪器参数(具有二级质谱扫描功能的高分辨质谱仪均可，以Q-Exactive型高分辨质谱仪为例说明)：电加热喷雾离子源(HESI)；离子源加热温度300℃；负离子模式；鞘气(Sheath gas)、辅助气(Aux gas)和吹扫气(Sweep gas)的流速分别为30arb、10arb和0arb；喷雾电压2.5kV；离子传输毛细管加热温度320℃；扫描模式target-MS2；分辨率35000。
3)待测液的测定
将步骤1)所得待测液进行UPLC-HRMS测定，测定条件同上述标准工作曲线制作的UPLC-HRMS分析条件，所得离子色谱图如图2所示。将待测液测得的小分子醛与其内标对应的腙的特征二级离子峰面积之比代入步骤2)所得的标准工作曲线，计算出各小分子醛的含量。由图2可知，巴豆醛的色谱峰强度很弱，其含量很低，低于检测限，表3中标记为ND(未检出)。
按照上述方法重复测定5次，计算相对标准偏差，得到方法精密度，结果见表3。
表3测定结果及方法精密度
Figure BDA0001498990260000091
注：N.D.为未检出。
实施例2
分别对搜集到的袋装瑞典含烟(1号)、散装瑞典含烟(2号)、美式含烟(3号)、散装嚼烟(4号)、块状嚼烟(5号)、干鼻烟(6号)、烟草含片(7号)、胶基型烟草糖(8号)各一种，将其用实施例1的方法进行处理和测定，结果如表4所示。
表4无烟气烟草产品中6种小分子醛含量的测定值
Figure BDA0001498990260000101
注：N.D.为未检出。
在本发明其它实施例中，测定方法中的内标溶液可以是单一的甲醛-d2溶液，标准工作溶液为不同浓度梯度的甲醛溶液，甲醛、乙醛、丙醛、丙烯醛、丁醛和巴豆醛均以甲醛-d2为内标进行定量，其它测定步骤同实施例1。
在本发明其它实施例中，无烟气烟草样品的处理方法及小分子醛的测定方法中的萃取剂为正己烷，其它步骤同实施例1。
实验例
将浓度最低的标准工作溶液样品进行UPLC-HRMS分析，以三倍信噪比(S/N＝3)计算检测限(LOD)，检测限在0.02～0.27ng/mL。进行加标回收率实验，平行测定5次，结果取平均值见表5。结果表明，6种醛的回收率范围在81.1％～107.6％之间，平均相对标准偏差(RSD)小于13％。
表5小分子醛的分析性能参数
Figure BDA0001498990260000102
Figure BDA0001498990260000111

Claims (3)

1.一种无烟气烟草制品中小分子醛的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将无烟气烟草制品与溶剂、内标溶液、衍生化试剂、萃取剂混合，超声处理10~20min，然后静置分层；所述溶剂为甲酸铵缓冲液；所述萃取剂为正己烷或异己烷；所述衍生化试剂为2,4-二硝基苯肼的乙腈溶液；每0.5g无烟气烟草制品对应加入4~6mL萃取剂；所述甲酸铵缓冲液、内标溶液、衍生化试剂、萃取剂的体积比为20:0.1:1:5；
2）取步骤1）中静置分层所得的上层液进行UPLC-HRMS测定，内标法定量，即得；
所述UPLC-HRMS测定中色谱柱为ACQUITY UPLC@BEH C18，流动相A：超纯水，流动相B：乙腈，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0min A 55%，B 45%；1min A 55%，B 45%；6min A 45%，B55%；
所述UPLC-HRMS测定中高分辨质谱的测定条件为：电加热喷雾离子源；离子源加热温度300℃；负离子模式；鞘气、辅助气、吹扫气的流速分别为30arb、10arb和0arb；喷雾电压2.5kV；离子传输毛细管加热温度320℃；扫描模式target-MS2；分辨率35000；
所述小分子醛为甲醛、乙醛、丙醛、丙烯醛、丁醛、巴豆醛中的任意一种或几种。
2.根据权利要求1所述的无烟气烟草制品中小分子醛的测定方法，其特征在于，所述内标溶液为甲醛-d2和乙醛-d4的混合溶液。
3.根据权利要求2所述的无烟气烟草制品中小分子醛的测定方法，其特征在于，所述甲醛-d2和乙醛-d4的浓度均为0.01mg/mL。
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