CN106841444A - 一种量化分析细支卷烟主流逐口烟气中主要微量生物碱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种量化分析细支卷烟主流逐口烟气中主要微量生物碱的方法，包括以下步骤：（1）内标溶液的制备；（2）标准工作溶液的制备；（3）样品溶液的制备；（4）气相色谱‑串联质谱仪分析；（5）标准工作曲线的绘制及样品结果的计算。本发明具有如下优良效果：（1）本发明方法创新使用气相色谱‑串联质谱仪测定细支卷烟主流逐口烟气中麦司明、假木贼碱、新烟草碱等3种主要微量生物碱的方法，解决了细支卷烟逐口烟气该类化合物水平低，以及烟气复杂基质对目标物的分析干扰严重等因素的影响。（2）本发明方法针对细支卷烟逐口烟气中目标物含量低的特征，创新采用“脉冲不分流”的分析模式，大为提高了目标物的响应灵敏度。

Description

一种量化分析细支卷烟主流逐口烟气中主要微量生物碱的 方法

技术领域

本发明公开了一种量化分析细支卷烟主流逐口烟气中主要微量生物碱的方法，具体来说是涉及一种基于气相色谱—串联质谱仪测定细支卷烟主流逐口烟气中主要微量生物碱的方法，属于卷烟理化指标检测技术领域。

背景技术

近年来，随着人们健康意识的不断提高，消费者对卷烟产品的选择也逐渐向高品质低危害转变，细支卷烟的低焦油特点更是迎合了这一趋势，使其逐步得到消费者认可和青睐。作为快速增长的中式卷烟新品类，细支卷烟在减害降焦、降本增效等领域有着天然的优势。但是，其在抽吸过程中存在劲头满足感方面一定程度上弱于同档次常规卷烟。为探明原因，必须剖析细支卷烟抽吸过程中内在化学成分的递送规律，深入了解相关物质释放量的规律特性，为掌控细支卷烟的品质定位提供科学依据和理论支撑。

对于细支卷烟而言，较小的横截面积和较大的烟支长度均导致其吸阻明显大于常规卷烟。而卷烟吸阻对感官质量特性起到重要作用，过大的卷烟吸阻容易影响消费者抽吸时的轻松感、满足感等体验。研究表明，烟草中生物碱是提供烟气满足感的内在物质基础，这其中最主要的生物碱是烟碱，其约占了烟草生物碱总量的95％以上，其次是降烟碱、去甲基去氢烟碱(麦司明)、新烟草碱、假木贼碱。准确测定卷烟主流烟气中生物碱对卷烟的吸食品质评价有重要作用。

文献调研表明，通常烟草和烟气中的生物碱可采用薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)等方法分离，再结合氮磷检测器(NPD)或质谱(MS)进行鉴定。常用的提取方法有蒸馏萃取法、超临界流体萃取、液膜萃取和离子交换法等。1967年，Kossey使用二维薄层色谱(TLC)同时分离了10种烟草生物碱。1980年，Plade等使用HPLC分离测定了烟草提取液中的4种生物碱。1981年，Severson等使用快速玻璃毛细管GC-NPD定性定量地测定了烟草中的烟碱、降烟碱、麦斯明、新烟碱、假木贼碱和2’3-联吡啶。2004年，苏明亮等采用溶剂超声提取烟草生物碱，并结合GC-NPD分析技术系统分析了烟丝、烟气和滤嘴样品中的烟碱、降烟碱、假木贼碱、新烟草碱、麦斯明和可替宁等6种生物碱。2006年，许燕娟等将烟草样品经二氯甲烷/甲醇萃取和DB-5MS毛细管柱分离，采用GC-FID法进行了定量分析。2016年，姬厚伟等人建立了超声萃取-气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)同时测定卷烟主流烟气中8种生物碱(烟碱、降烟碱、麦斯明、二烯烟碱、假木贼碱、新烟草碱、2’3-联吡啶和可替宁)的分析方法。捕集了卷烟主流烟气总粒相物的剑桥滤片经8％的NaOH溶液浸泡后，用乙酸乙酯超声萃取，在多反应监测(MRM)模式下进行GC-MS/MS分析，内标法定量。

以上相关文献对生物碱的定量分析主要是针对烟草或整个卷烟主流烟气进行，并没有对卷烟主流烟气逐口中的释放量进行分析。唯一关联文献是，2011年丁超等人为测定卷烟烟气总粒相物中5种生物碱(烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱和新烟草碱)，采用经改造的吸烟机对卷烟进行抽吸，用剑桥滤片捕集20支卷烟的每口烟气总粒相物，滤片经超声波萃取、离心后，取上层清液用GC/MS进行测定分析。但该方法是针对常规粗支卷烟进行研究的，对于细支卷烟而言，除了适合检测释放量最大的烟碱外，其余微量的主要生物碱因其释放量较低，并不适合采用该方法进行分析。为此，本专利采用GC-MS/MS的分析手段，首次测定细支卷烟主流烟气逐口烟气中麦司明、假木贼碱、新烟草碱等3种主要微量生物碱的释放量。

发明内容

本发明旨在克服现有的技术缺陷，提供一种采用气相色谱-串联质谱仪测定细支卷烟主流逐口烟气中麦司明、假木贼碱、新烟草碱等3种主要微量生物碱的方法，该方法能准确量化分析卷烟主流烟气中微量的主要生物碱含量，测定结果准确、灵敏度高，基质干扰少。

本发明的技术方案如下：

一种量化分析细支卷烟主流逐口烟气中主要微量生物碱的方法，包括以下步骤：

(1)内标溶液的制备：以正十七碳烷为内标物，使用甲醇为溶剂，制备内标溶液。

(2)标准工作溶液的制备：以麦司明、假木贼碱、新烟草碱等物质的标准品为目标物，使用甲醇为溶剂，经逐级稀释制备成标准储备溶液，然后分别加入一定量的内标溶液，制备成标准工作溶液。

(3)样品溶液的制备：按照标准方法对细支卷烟进行抽吸，固定抽吸口数，用剑桥滤片收集每口烟气的粒相物。然后对每个捕有粒相物的剑桥滤片分别加入一定量的内标溶液、一定体积的稀氢氧化钠溶液和一定体积的萃取溶剂，超声提取，再将提取液离心，取上清液过装有无水硫酸钠的微孔过滤器后，得样品溶液。

(4)气相色谱-串联质谱仪分析：用气相色谱-串联质谱仪(GC-MS/MS)对标准工作溶液和样品溶液进行检测分析。

(5)标准工作曲线的绘制及样品结果的计算。

所述的内标溶液的制备，具体过程为：准确称取0.2g正十七碳烷，精确至0.1mg，于100mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。

所述的标准工作溶液的制备具体包括以下步骤：

(1)单标储备液：准确称取10mg麦司明、10mg假木贼碱、5mg新烟草碱标准样品，精确至0.1mg，各移置于50mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。

(2)混合标准储备液：分别准确移取1mL麦司明单标储备液、0.5mL假木贼碱单标储备液以及1mL新烟草碱单标储备液，混合于50mL的容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度。

(3)标准工作溶液：分别量取混合标准物质储备液0.05mL、0.1mL、0.5mL、1mL、2.5mL和5mL，再分别加入内标溶液25μL，于10mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得到6级系列标准工作溶液。

所述的样品溶液的制备具体包括以下步骤：

(1)卷烟抽吸：按照GB/T 19609标准的要求抽吸20支细支卷烟，固定抽吸口数为5口/支，用44mm剑桥滤片捕集细支卷烟主流烟气中的粒相物。

(2)粒相物萃取：对每个捕有粒相物的剑桥滤片分别加入25μL内标溶液、2.5mL浓度为8％的氢氧化钠溶液，以及10mL萃取溶剂乙酸乙酯，超声提取30min，再将提取液于3000r/min条件下离心5min，取上清液1.5mL装有2g无水硫酸钠的微孔过滤器，分别得到第1口至第5口逐口烟气对应的样品溶液。

所述的GC-MS/MS分析，其仪器分析条件为：采用DB-17MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管色谱柱；载气为氦气，恒流速度为1.0mL/min；进样方式：进样量为1μL，脉冲不分流进样，进样脉冲压力为25psi，时间为0.75min；进样口温度为250℃；传输线温度为280℃；升温程序为初始温度为60℃，保持1min，以5℃/min的速率升高至200℃，再以10℃/min的速率升高至280℃，保持10min。其质谱分析条件为：电离方式为EI源，正离子模式；离子源温度：230℃；四极杆温度：均为150℃；碰撞气：氮气，流速1.5mL/min，载气(氦气)流速为2.25mL/min；多反应监测(MRM)模式，详细参数列于下表。

目标物的MRM参数情况

所述的标准曲线绘制及结果计算如下：以标准工作溶液中目标物与内标的浓度之比为横坐标，以色谱图中目标物与内标的峰面积之比为纵坐标，进行线性回归分析，得到标准工作曲线。将相同条件下测得的样品溶液中目标物与内标的色谱峰面积比，代入标准工作曲线，根据下列公式求得卷烟样品中目标物的含量。

式中：

W——细支卷烟主流逐口烟气中3种主要微量生物碱的含量，单位为微克每支(μg/支)；

A——3种主要微量生物碱的峰面积；

As——对应内标的峰面积；

b——标准工作曲线的截距；

Ms——添加内标的质量，单位为微克(μg)；

a——标准工作曲线的斜率；

M——烟支的数量，单位为支。

有益效果：本发明的检测方法对样品处理方法及色谱质谱分析条件进行了优化确认。与现有技术相比，本发明具有如下优良效果：

(1)本发明方法创新使用气相色谱-串联质谱仪测定细支卷烟主流逐口烟气中麦司明、假木贼碱、新烟草碱等3种主要微量生物碱的方法，解决了细支卷烟逐口烟气该类化合物水平低，以及烟气复杂基质对目标物的分析干扰严重等因素的影响。

(2)本发明方法针对细支卷烟逐口烟气中目标物含量低的特征，创新采用“脉冲不分流”的分析模式，大为提高了目标物的响应灵敏度。同时，本发明方法利用内标法定量，可以不用精准定容，且可以减少由前处理方法重现性和仪器精密度问题带来的误差。

附图说明

图1为本发明测定方法的流程图；

图2为标准工作溶液中内标正十七碳烷和3种微量生物碱的离子对色谱图；

图3为细支卷烟主流逐口烟气中内标正十七碳烷和3种微量生物碱的离子对色谱图。

具体实施方式

实施例1

本实施例对量化分析细支卷烟主流逐口烟气中麦司明、假木贼碱、新烟草碱等3种主要微量生物碱的检测方法如下(所述检测方法的流程图如图1所示)：

(1)内标溶液的制备

准确称取0.2020g正十七碳烷，于100mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度为2020μg/mL的内标溶液。

(2)标准工作溶液的制备

①单标储备液：准确称取10.24mg麦司明、10.05mg假木贼碱、5.01mg新烟草碱标准样品，各移置于50mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度分别为204.8μg/mL、201μg/mL和100.2μg/mL的单标溶液。

②混合标准储备液：分别准确移取1mL麦司明单标储备液、0.5mL假木贼碱单标储备液以及1mL新烟草碱单标储备液，混合于50mL的容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度。

③标准工作溶液：分别量取混合标准物质储备液0.05mL、0.1mL、0.5mL、1mL、2.5mL和5mL，再分别加入内标溶液25μL，于10mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得到6级系列标准工作溶液。其中麦司明的浓度范围为0.1024～10.24μg/mL、假木贼碱的浓度范围为0.1005～10.05μg/mL以及新烟草碱的浓度范围为0.0501～5.01μg/mL，其中内标物的浓度为5.05μg/mL。

(3)样品溶液的制备

①卷烟抽吸：以一市销细支卷烟为对象，按照GB/T 19609标准的要求抽吸20支细支卷烟，固定抽吸口数为5口/支，用44mm剑桥滤片捕集细支卷烟主流烟气中的粒相物。

②粒相物萃取：对每个捕有粒相物的剑桥滤片分别加入25μL内标溶液、2.5mL浓度为8％的氢氧化钠溶液，以及10mL萃取溶剂乙酸乙酯，超声提取30min，再将提取液于3000r/min条件下离心5min，取上清液1.5mL装有2g无水硫酸钠的微孔过滤器，分别得到第1口至第5口逐口烟气对应的样品溶液，即为1#、2#、3#、4#和5#。

(4)气相色谱-串联质谱分析

分别取6个不同浓度的标准工作溶液和5个样品待测溶液进行气相色谱-串联质谱分析(所述标准工作溶液、典型样品溶液中内标物和目标物的色谱图如图2～图3所示)。

其仪器分析条件为：采用DB-17MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管色谱柱；载气为氦气，恒流速度为1.0mL/min；进样方式：进样量为1μL，脉冲不分流进样，进样脉冲压力为25psi，时间为0.75min；进样口温度为250℃；传输线温度为280℃；升温程序为初始温度为60℃，保持1min，以5℃/min的速率升高至200℃，再以10℃/min的速率升高至280℃，保持10min。其质谱分析条件为：电离方式为EI源，正离子模式；离子源温度：230℃；四极杆温度：均为150℃；碰撞气：氮气，流速1.5mL/min，载气(氦气)流速为2.25mL/min；多反应监测(MRM)模式，详细参数列于下表。

目标物的MRM参数情况

(5)标准曲线绘制及结果计算

首先，以标准工作溶液中目标物与内标的浓度之比为横坐标，以色谱图中目标物与内标的峰面积之比为纵坐标，进行线性回归分析，得到标准工作曲线。取最低浓度的标准工作溶液，做9次平行检测分析，计算其标准偏差，以3倍的标准偏差对应的浓度，换算得出方法的检出限。与标准工作曲线相对应的回归方程、相关系数、检出限等数据见下表。

分析方法的工作曲线和检出限

将相同条件下测得的样品溶液中目标物与内标的色谱峰面积比，代入标准工作曲线，根据下列公式求得卷烟样品中目标物的含量。

式中：

W——细支卷烟主流逐口烟气中3种主要微量生物碱的含量，单位为微克每支(μg/支)；

A——3种主要微量生物碱的峰面积；

As——对应内标的峰面积；

b——标准工作曲线的截距；

Ms——添加内标的质量，单位为微克(μg)；

a——标准工作曲线的斜率；

M——烟支的数量，单位为支。

本实施例中细支卷烟主流逐口烟气中3种主要微量生物碱检测结果见下表：

实施例2

本实施例对本发明的精密度和加标回收率的检测方法如下：

以实施例1中所用的细支卷烟样品为样品，针对其中的第3口卷烟烟气，分别进行了日内精密度实验，日内精密度实验为相同样品在同一条件下平行测定6次(同一批次处理)，分别计算6次平行测定结果的相对标准偏差(RSD)，测定结果见下表。表中结果显示，本实验方法的日内重复性的RSD<10％，对于痕量物质的定量分析来说，表明方法具有良好的精密度。

以重复性试验所用细支卷烟样品为分析对象，针对其中的第3口卷烟烟气，按照上述样品前处理方法进行处理，加入其释放量相当的含量的标样，进行基质加标试验，结果见下表。从表中可以看出，样品的加标回收率在80.41％～91.54％之间，说明方法具有较好的准确性。

本发明采用正十七碳烷为内标物进行定量，经优化后的检测方法目标物提取完善，响应灵敏、定量分析准确，有效地减少了因样品基质复杂带来的干扰，所采用的分析仪器条件使得目标物具有较好的信号响应，并且具有较好的线性相关性，3种主要微量生物碱的检出限分别为17.60ng/支、16.59ng/支和10.10ng/支，重复性(RSD)分别为4.27％、7.82％和8.15％，加标回收率分别为91.54％、83.10％和80.41％。说明本方法的灵敏度高，重复性和回收率较好，适合于细支卷烟逐口烟气复杂基质中微量目标物的定量分析。

本实施例所用到的标准溶液仅以其中的一个浓度为例进行说明的，其它浓度值所制备的标准溶液经气相色谱-串联质谱仪分析所获得的标准曲线及回归方程与上述实施例相同，在此不在一一列举。所举实施例只是为了更好的理解本发明方法，并不具有任何限制作用，即上述方法或者等同上述情况的方法均包含在本发明的技术方案的保护范围中。

Claims (4)

1.一种量化分析细支卷烟主流逐口烟气中主要微量生物碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)内标溶液的制备：以正十七碳烷为内标物，使用甲醇为溶剂，制备内标溶液；

(2)标准工作溶液的制备：以麦司明、假木贼碱、新烟草碱等物质的标准品为目标物，使用甲醇为溶剂，经逐级稀释制备成标准储备溶液，然后分别加入一定量的内标溶液，制备成标准工作溶液；

(3)样品溶液的制备：按照标准方法对细支卷烟进行抽吸，固定抽吸口数，用剑桥滤片收集每口烟气的粒相物；然后对每个捕有粒相物的剑桥滤片分别加入一定量的内标溶液、一定体积的稀氢氧化钠溶液和一定体积的萃取溶剂，超声提取，再将提取液离心，取上清液过装有无水硫酸钠的微孔过滤器后，得样品溶液；

(4)气相色谱-串联质谱仪分析：用气相色谱-串联质谱仪(GC-MS/MS)对标准工作溶液和样品溶液进行检测分析；

(5)标准工作曲线的绘制及样品结果的计算；

所述的GC-MS/MS分析，其仪器分析条件为：采用DB-17MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管色谱柱；载气为氦气，恒流速度为1.0mL/min；进样方式：进样量为1μL，脉冲不分流进样，进样脉冲压力为25psi，时间为0.75min；进样口温度为250℃；传输线温度为280℃；升温程序为初始温度为60℃，保持1min，以5℃/min的速率升高至200℃，再以10℃/min的速率升高至280℃，保持10min；其质谱分析条件为：电离方式为EI源，正离子模式；离子源温度：230℃；四极杆温度：均为150℃；碰撞气：氮气，流速1.5mL/min，载气(氦气)流速为2.25mL/min；多反应监测(MRM)模式，详细参数列于下表：

目标物的MRM参数情况

所述的标准曲线绘制及结果计算如下：以标准工作溶液中目标物与内标的浓度之比为横坐标，以色谱图中目标物与内标的峰面积之比为纵坐标，进行线性回归分析，得到标准工作曲线；将相同条件下测得的样品溶液中目标物与内标的色谱峰面积比，代入标准工作曲线，根据下列公式求得卷烟样品中目标物的含量：

$W=\frac{(\frac{A}{As}-b)\&times;Ms}{a\&times;M}$

式中：

W——细支卷烟主流逐口烟气中3种主要微量生物碱的含量，单位为微克每支(μg/支)；

A——3种主要微量生物碱的峰面积；

As——对应内标的峰面积；

b——标准工作曲线的截距；

Ms——添加内标的质量，单位为微克(μg)；

a——标准工作曲线的斜率；

M——烟支的数量，单位为支。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的内标溶液的制备，具体过程为：准确称取0.2g正十七碳烷，精确至0.1mg，于100mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的标准工作溶液的制备具体包括以下步骤：

(1)单标储备液：准确称取10mg麦司明、10mg假木贼碱、5mg新烟草碱标准样品，精确至0.1mg，各移置于50mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度；

(2)混合标准储备液：分别准确移取1mL麦司明单标储备液、0.5mL假木贼碱单标储备液以及1mL新烟草碱单标储备液，混合于50mL的容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度；

(3)标准工作溶液：分别量取混合标准物质储备液0.05mL、0.1mL、0.5mL、1mL、2.5mL和5mL，再分别加入内标溶液25μL，于10mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得到6级系列标准工作溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的样品溶液的制备具体包括以下步骤：

(1)卷烟抽吸：按照GB/T 19609标准的要求抽吸20支细支卷烟，固定抽吸口数为5口/支，用44mm剑桥滤片捕集细支卷烟主流烟气中的粒相物；

(2)粒相物萃取：对每个捕有粒相物的剑桥滤片分别加入25μL内标溶液、2.5mL浓度为8％的氢氧化钠溶液，以及10mL萃取溶剂乙酸乙酯，超声提取30min，再将提取液于3000r/min条件下离心5min，取上清液1.5mL装有2g无水硫酸钠的微孔过滤器，分别得到第1口至第5口逐口烟气对应的样品溶液。