CN106093261A - 一种鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法，属于食品安全领域。针对目前造假蜂蜜中的普遍使用的淀粉类糖浆，公开了一种蜂蜜中掺入淀粉糖浆的快速检测方法，包括样品前处理、液相分离、质谱检测三个步骤。根据麦芽七糖的保留时间和离子对的相对丰度比定性判断蜂蜜中是否掺有淀粉糖浆，并通过标准曲线法定量测定样液中的淀粉类糖浆的含量。该方法完整性强、专属性好、可控性强、准确性高，本发明的实施可以极大的解决目前我国蜂蜜分析检测中的掺假淀粉糖浆问题，保护了消费者合法权益，对于规范蜂产品市场及推动我国蜂产品事业的健康发展有着十分重要的意义。

Description

一种鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法，属于食品安全领域。

背景技术

蜂蜜掺假问题由来已久，但一直没有受到普通消费者的警惕。一方面，掺假蜂蜜本身对人体危害程度不及其它一些掺假食品；另一方面，检测方法的滞后，导致假蜂蜜横行泛滥。纯天然蜂蜜中掺入价格低廉的淀粉类糖浆（大米、玉米糖浆）是蜂蜜掺假中普遍存在的一种现象。淀粉糖浆是红薯、玉米等植物淀粉通过水解、脱色等工业手段加工而成的粘稠液体，其糖分组成为葡萄糖、低聚糖等。淀粉的水解在工业上称为转化，淀粉糖浆转化过程中通过采用不同的酸、酶或酸酶合并的工艺控制转化的葡萄糖和果糖的比例，因此与蜂蜜极为相似，从而达到以假乱真的程度。

目前鉴定蜂蜜中是否掺有淀粉类糖浆的方法包括稳定碳同位素法、薄层色谱法和离子色谱法。但是这些方法或多或少都有一定的缺陷。譬如，稳定碳同位素法无法检测出大米糖浆等C3植物糖浆；薄层色谱法测试周期长，同时由于薄层色谱法是以比对颜色深浅来判断是否含有淀粉类糖浆，因而主观性较大，容易产生较大偏差；采用离子色谱法分析，不仅前处理过程复杂，需要除去蜂蜜中的单糖，并富集寡糖，同时分析时间长、分离度和灵敏度低，结果由于受到蜂蜜中杂质干扰，检测结果不准确。

因而，本领域的技术人员一直在寻找一种灵敏、简便、准确的鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法。

南京工业大学的熊晓辉等人在CN104749290A中公开了一种鉴别蜂蜜中淀粉糖浆掺假的高效液相色谱测定方法，其通过掺入淀粉糖浆的蜂蜜存在特征的低聚寡糖“指纹区”(DP6～13)及在麦芽六糖至麦芽七糖之间存在典型的“指纹峰”M，将其作为蜂蜜中掺入淀粉糖浆的判定指标。但是很快他们发现用于判定的“指纹峰” M 在处理低浓度掺假样品时保留时间易受到柱温、样品基质等影响发生漂移，不能准确的判定低掺假量的样品。于是，作为改进他们在CN104977369A公开了一种鉴别蜂蜜中淀粉糖浆掺假的液质联用（HPLC-MS/MS）测定方法。其中具体公开了以麦芽六糖至麦芽七糖之间存在的“指纹峰”M中两个特征子离子671m/z和689m/z为特征检测峰的液质联用测定方法。

但是，其始终没有在寡糖类物质中找到一种特定的标记物。我们知道，由于受到分离度和检测环境等因素的影响，即使采用相同的检测条件得到的液相图、质谱图也存在一定的差异。因而，熊晓辉等人公开的测定方法可能存在准确度不高、重现性不佳等问题。然而，如果能够以某一寡糖作为鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的检测标记物，则可以根据不同的检测环境等利用标记物校正标准谱图、标准曲线，从而使得以这一标记物为基础的检测方法准确度更高、重现性更好。

那么，为什么在熊晓辉等人公开的基础上，本领域一直未有以某一特定寡糖为标记物的检测方法公开呢？

这是因为在寡糖测定中存在以下问题，一是寡糖在淀粉糖浆中含量较低，二是存在结构相似的碳水化合物和其它大量单糖的干扰。因此，现有技术一直无法实现淀粉类糖浆中五种寡糖（包括麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖）的有效分离和测定。因而，也就不存在可能，去考察单纯采用某一寡糖，是否能够准确判断蜂蜜中掺入淀粉糖浆。

发明内容

本发明的目的是找到一种简单、快速且具有高灵敏度的鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法。

具体地，本发明公开了一种鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法，该方法以高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱高分辨质谱为检测手段，以麦芽七糖为特征检测标志物。

本发明以蜂蜜中的寡糖类物质作为靶标分析。通过对大量纯天然蜂蜜和糖浆样品的麦芽类寡糖物质分析，包括麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖共五种寡糖，发现淀粉类糖浆中含有的不被酶解完全的微量麦芽七糖,可以作为蜂蜜中是否掺入淀粉类糖浆的标识物，可有效解决蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的鉴别检测问题。

进一步地，本发明公开了以麦芽七糖为标记物鉴别蜂蜜中掺入淀粉糖浆的具体方法，包括样品前处理、高效液相分离和质谱检测三个步骤。

具体的，在本发明中我们进一步公开：

（1）高效液相色谱分离条件如下，

色谱柱：Carbohydrate色谱柱；

流动相：A为0.1 %（v/v）甲酸水溶液，B为乙腈；

流速：1.2 mL/min；

梯度洗脱程序：0 -2 min 35% A, 2 -2.5 min 35-50% A, 2.5-8.0 min 50% A, 8.0-9.0 min 50-35% A，9.0-12.0min 35%A；

柱温：25℃；

进样量：25 µL。

（2）质谱检测选用可加热的电喷雾离子源为检测离子源，采用正离子扫描模式，毛细管温度350℃；

鞘气（N₂）流速50 L/min；

辅助气（N₂）流速6 L/min；

吹扫气（N₂）流速3 L/min；

喷雾电压为3 KV，透镜电压为50V；

Target-MS²扫描中分辨率R=17500；最大驻留时间：100 ms；

分离窗口：2.0 m/z；强度阈值：4×10⁴。

（3）样品前处理中，蜂蜜样品完全溶化后，溶解于水中，并取上层清夜与等体积乙腈混合均匀，过滤膜，作为进样样品；

其中蜂蜜样品的溶化方式有两种，第一种，对无结晶的蜂蜜和糖浆样品，将其搅拌均匀；第二种，对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热、振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。

同时，我们进一步限定溶解于水的具体方法是：准确称取溶化后的样品1.00 g（精确到0.01 g）于适当的刻度容器中，用水定容至10.0 mL，涡旋震荡至溶解，取适量上层清液与等体积乙腈混合均匀后，过滤膜，准备进样分析。

采用前述的高效液相色谱分离条件，所得谱图中麦芽七糖色谱峰的保留时间为3.92min左右。

采用前述的质谱检测条件，所得谱图中，麦芽七糖的特征离子对为1013.30795m/z和851.24950m/z。

进一步地，我们还公开了定性鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法，包括以下步骤：

（1）以麦芽七糖标准品建立标准液相色谱图和标准质谱图；

（2）以步骤（1）中的条件对待检测样品进行检测，得到待检测样品的液相色谱图和质谱图；

（3）将步骤（1）和（2）获得的谱图进行对比，如果待检测样品的液相色谱图中其出峰保留时间与标准品出峰时间相差在±2.5%，同时在质谱图中，在扣除背景后，麦芽七糖的特征离子对的相对丰度与浓度相当标准品的相对丰度相比，其偏差在下表允许相对误差内，

则判定待检测样品中含有麦芽七糖，即蜂蜜中掺有淀粉类糖浆。

更进一步地，我们还公开了定量检测蜂蜜中掺入淀粉类糖浆含量的方法，包括以下步骤：

（1）制备已知浓度含量的淀粉类糖浆标准溶液，并以麦芽七糖的特征离子的准确质量色谱峰峰面积为纵坐标，浓度含量为横坐标，绘制标准曲线；

（2）以步骤（1）中的条件对待检测样品进行检测，计算待检测样品中麦芽七糖的准确质量色谱峰峰面积；

（3）利用步骤（1）的标准曲线，以步骤（2）得到的准确质量色谱峰峰面积计算得到待测样品中淀粉类糖浆的浓度含量。

在定量测定中，我们还需要注意，样品中被测物量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围，应适当稀释至标准曲线范围之内进行检测。即可以判断出蜂蜜中掺有的麦芽七糖的含量。

本发明具有以下优点： 样品前处理简单，蜂蜜样品只需要溶于水即可进行色谱质谱分析，无需对样品中的寡糖进行富集；分析时间短，整个样品的分析时间只需要10分钟，对于高通量的分析检测，大大缩短了检测周期；灵敏度和准确性高，相对于其他检测蜂蜜中淀粉糖浆，本发明方法所采用的仪器为高分辨质谱，可以达到较高的灵敏度，通过比对母离子和碎片离子的丰度比，提高检测的准确性，避免假阳性的检测结果。该发明的方法可以弥补目前蜂蜜中掺入淀粉糖浆鉴别方法存在的缺陷。

本发明的实施可以极大的解决目前我国蜂蜜分析检测中的掺假淀粉糖浆问题，保护了消费者合法权益，对于规范蜂产品市场及推动我国蜂产品事业的健康发展有着十分重要的意义。

附图说明

图1是寡糖标准溶液的提取离子流色谱图；

图2是实际待检测样品中麦芽七糖的提取离子流色谱图；

图3是实际待检测样品中麦芽七糖的质谱图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。

实施例1 寡糖的液相色谱、质谱方法的建立

该实施例中所用标准品和试剂为：麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖纯度均大于99.9%，购于Aldich-Sigma公司；实验用乙腈 (色谱纯)购自德国Merck公司；甲酸（色谱纯）来自美国TEDIA公司。

准确称取适量的寡糖标准物质，用水配成1.0 mg/mL的标准储备液，冰箱中4 ℃贮存。用乙腈水（1+1 v/v）稀释成浓度为100μg/ml的工作溶液。

1.液相色谱条件的建立

液相分析过程中，少量甲酸的加入，在正离子质谱分析模式下，有利于目标化合物的离子化，其灵敏度可提高约20 %，且使色谱峰峰形更对称。

为了将麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖有效分离，确定的高效液相色谱条件如下：

色谱柱：Carbohydrate色谱柱（150 mm×4.6mm，5 μm）

流动相：A为0.1 %（v/v）甲酸水溶液，B为乙腈；

流速：1.2 mL/min；

梯度洗脱程序：0 -2 min 35% A, 2 -2.5 min 35-50% A, 2.5-8.0 min 50% A, 8.0-9.0 min 50-35% A，9.0-12.0min 35%A；

柱温：25℃；

进样量：25 µL。

2.质谱条件:

用流动注射方式（FIA）将目标化合物标准溶液直接注入质谱仪，进行全扫描检测，得到一级质谱图和准分子离子峰[M+H]⁺和[M+Na]⁺，质谱分析中采用最为常用的电喷雾电离源（ESI）对寡糖进行喷雾电压、碰撞能量、喷雾气流量的优化，结果发现[M+Na]⁺的信号响应高于[M+H]⁺峰，最终选择[M+Na]⁺作为目标化合物进行测定。同时分别选取信号强度最强的两个离子碎片作为定性和定量离子，最终优化后的麦芽三、四、五、六和七糖母离子、定性和定量离子见表1，标准溶液的提取离子流图如图1所示。

表1 麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖的质谱信息

实施例2 寡糖在糖浆和蜂蜜中含量的测定

1.糖浆中寡糖的含量分析

纯天然蜂蜜中主要成份为葡萄糖和果糖和少量的蔗糖，而掺假使用的大米糖浆和玉米糖浆由于生产工艺的问题，会存在没有水解完全的寡糖，因此当天然蜂蜜中掺入淀粉类糖浆，会有痕量的寡糖存在。

对无结晶的蜂蜜和糖浆样品，将其搅拌均匀，对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。准确称取融化后的样品1.0 g（精确到0.01 g）到适当刻度容器中，用水定容至10.0 mL，涡旋至溶解，取适量上层清液与等体积乙腈混合均匀后，过滤膜，准备进样分析。

应用实施例1中的检测方法对纯天然蜂蜜、大米糖浆及玉米糖浆中的寡糖进行检测，其结果如表2所示。

表2 大米糖浆和玉米糖浆中寡糖含量分布（mg/kg）

从结果中可以看出，大米糖浆和玉米糖浆中麦芽三、四、五、六和七糖均有检出，其含量约在900~8000mg/kg之间，由于工艺中酶解温度、时间都会对淀粉糖浆生产过程中残留的麦芽寡糖含量产生影响，因此其含量在不同生产工艺和不同类型的淀粉类糖浆中没有发现有规律的趋势和变化。

2. 纯天然蜂蜜中寡糖含量的分析

对来自新疆、内蒙、河南、江苏、山东、辽宁、四川、吉林、陕西、湖北和河北等地的油菜、洋槐、椴树、荆条和葵花共计93个天然蜂蜜样本进行了检测。3.结论

结果发现上述天然蜂蜜中存在一些糖类的干扰物质，对麦芽三糖、四糖、五糖和六糖的定性和定量存在干扰，因此麦芽三糖、四糖、五糖和六糖无法作为是否掺入淀粉类糖浆的标志性物质进行定性和定量，而麦芽七糖在所有检测蜂蜜样本中干扰小，对结果的定量基本没有影响，因此最终选择麦芽七糖作为蜂蜜中外源性淀粉糖浆掺假鉴别的指标。

麦芽七糖作为重点关注的寡糖，在我们收集的大米糖浆和玉米糖浆之中，其含量在1044.9~5864.6mg/kg之间。

实施例3 麦芽七糖作为淀粉糖浆特征标志物的方法学考察

麦芽七糖的标准储备液用水稀释成标准工作液，依次得到含量为0.5、1.0、2.0、5.0、10和20 μg/mL的标准溶液，按优化后的仪器条件测定，外标法定量。以麦芽七糖特征离子的准确质量色谱峰面积为纵坐标、含量为横坐标，绘制标准曲线，相关系数（r）大于0.99，表明在0.5 ~ 10.0 μg/mL范围内线性关系良好。在油菜蜜、洋槐蜜和椴树蜜等3种蜂蜜样品中添加20、50和100 mg/kg 3个不同加标水平的，每个水平重复测定6次。平均回收率范围在75-82%之间，相对标准偏差范围在3.1-6.7%之间，具体见表3。

表3三种蜂蜜中麦芽七糖添加回收数据

实施例4 样品的定性和定量检测

1.定性测试

将待检测的蜂蜜样品按照实施例1和实施例2中的处理及检测方法，得到如图2 所示的质谱图，与图1 中的标准谱图对比，以相对保留时间和精确质量数为定性依据。

图1中麦芽七糖的保留时间约为3.92 min，图2中样品中检测的色谱峰保留时间为3.94 min，与麦芽七糖标准品相差在±2.5%以内，因此，我们进一步考察在上述色谱-质谱条件下，在扣除背景后所选择的两对离子对与浓度相当标准溶液的相对丰度的一致性。标准质谱图中麦芽七糖的母离子质荷比为1175.36955，子离子为1013.30795和851.24950，且1013.30795子离子相对丰度为50%，851.24950子离子的相对丰度为35%，如图3所公开的质谱结果，并结合下表：

我们看到待测样品的相对丰度其在允许的相对误差内，因此，我们判断本实例中待测样品中掺有淀粉糖浆。

2.定量测试

标准曲线的制定

用去离子水配制浓度范围为0.05mg/mL- 1mg/mL 的大米糖浆参照物溶液，按本专利实施例1中的方法进样，以峰面积对浓度作线性回归，其浓度与响应值有良好的线性关系，线性方程为y=7.98×10⁴x+2.67×10²，相关性R² 为0.999 以上。

计算图2中麦芽七糖的峰面积，利用线性回归方程，得到蜂蜜中淀粉糖浆的掺入量为10.4%。

Claims (8)

1.一种鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法，其特征是，该方法以高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱高分辨质谱为检测手段，以麦芽七糖为特征检测标志物。

2.根据权利要求1所述的鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法，其特征是，高效液相色谱分离条件如下：

色谱柱：Carbohydrate色谱柱；

流动相：A为0.1 %（v/v）甲酸水溶液，B为乙腈；

流速：1.2 mL/min；

梯度洗脱程序：0 -2 min 35% A, 2 -2.5 min 35-50% A, 2.5-8.0 min 50% A, 8.0-9.0 min 50-35% A，9.0-12.0min 35%A；

柱温：25℃。

3.根据权利要求1所述的鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法，其特征是，质谱检测选用可加热的电喷雾离子源为检测离子源，采用正离子扫描模式，毛细管温度350℃。

4.根据权利要求1所述的鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法，其特征是，蜂蜜样品完全溶化后，溶解于水中，并取上层清夜与等体积乙腈混合均匀，过滤膜，作为进样样品。

5.根据权利要求2所述的鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法，其特征是，麦芽七糖色谱峰的保留时间为3.92min左右。

6.根据权利要求3所述的鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法，其特征是，麦芽七糖的特征离子对为1013.30795 m/z和851.24950 m/z。

7.根据权利要求1至6中任意一项所述的鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）以麦芽七糖标准品建立标准液相色谱图和标准质谱图；

（2）以步骤（1）中的条件对待检测样品进行检测，得到待检测样品的液相色谱图和质谱图；

（3）将步骤（1）和（2）获得的谱图进行对比，如果待检测样品的液相色谱图中其出峰保留时间与标准品出峰时间相差在±2.5%，同时在质谱图中，在扣除背景后，麦芽七糖的特征离子对的相对丰度与浓度相当标准品的相对丰度相比，其偏差在下表允许相对误差内，

相对离子丰度（％基峰） >50% >20%- 50% >10% -20% ≦10% 允许的相对误差 ±20% ±25% ±30% ±50%

则判定待检测样品中含有麦芽七糖，即蜂蜜中掺有淀粉类糖浆。

8.根据权利要求1至6中任意一项所述的鉴别蜂蜜中掺入淀粉类糖浆的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）制备已知浓度含量的淀粉类糖浆的标准溶液，并以麦芽七糖的特征离子的准确质量色谱峰峰面积为纵坐标，浓度含量为横坐标，绘制标准曲线；

（2）以步骤（1）中的条件对待检测样品进行检测，计算待检测样品中麦芽七糖的准确质量色谱峰峰面积；

（3）利用步骤（1）的标准曲线，以步骤（2）得到的准确质量色谱峰峰面积计算得到待测样品中淀粉类糖浆的浓度含量。