CN104833761B - 一种快速分析样品中的糖类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速分析样品中的糖类化合物的方法，所述方法使用依次串联的离子色谱、实时直接分析离子源与质谱仪对样品中的糖类化合物进行检测。本申请的方法可以简单、快速地定性及定量检测糖类化合物，检测结果的可靠性和准确性高。
Description
技术领域
本申请涉及物质的分析检测领域，具体涉及一种快速定性和定量分析样品中的糖类化合物的方法，所述方法采用依次串联的离子色谱仪、实时直接分析离子源与三级四极杆质谱仪(IC-DART-MS/MS)进行分析检测。
背景技术
碳水化合物是一类非常重要的物质，通常在食物中以单分子或者与其他大分子物质结合的形式存在，其最主要的功能是在生物体内被代谢而给机体提供能量[1]。诸多食品中均含有单糖或双糖，食物的质量好坏也与各种糖的含量密切相关，如乳糖含量是牛奶质量的重要指标、麦芽糖含量是饮料质量好坏的指标[2]。血液中葡萄糖的含量高低能表征人体健康状况，尿液中葡萄糖的含量指示糖尿病人的病情状况。因此，对糖的准确定性和定量分析是十分重要的研究领域。
目前，常用于分析检测糖的分析方法有离子色谱法(IC)、高效液相色谱法(HPLC)、电化学法等，其采用的检测器大多为示差折光检测器、蒸发光散射检测器、紫外检测器、电化学检测器等[3-6]。示差折光检测可以实现初步定性，但是效果较差并且该检测器灵敏度较差、易受到淋洗液的影响。蒸发光散射检测器可以较好地避免淋洗液的影响，但选择性差。鉴于糖类化合物具有较弱的紫外吸收，紫外检测器不能直接采用，通常需要将糖类化合物衍生化后再使用该检测器。电化学检测器应用于糖类的检测在离子色谱方法中得到广泛的应用[6,7]，其灵敏度高，线性范围宽，操作简便，但是电化学检测器前处理要求高，在前处理过程中要尽可能除去易于氧化还原的杂质，进而避免干扰。对质谱检测器而言，该检测器具有得天独厚的优势，不仅灵敏度高，而且能够能对目标物进行定性与定量分析。但是质谱要求检测样品中不能含有非挥发性盐成分，由于非挥发性的盐类对ESI电离有较严重的离子抑制作用。通常情况下，色谱与质谱联用(GC-MS/MS和LC-MS/MS)较为广泛，由于结合了色谱分离使得该分析方法具有较高的分离能力、准确定量和定性等优点。同样，该方法需要大量的样本制备，包括液液萃取、固相萃取等，成本高，操作繁琐耗时[8]。电化学检测具有快速、高灵敏度的特点，但由于固体电极表面差异性较大，导致电化学检测的重现性较差。因此建立一种快速、高灵敏、简单甚至无需样品前处理的分析方法迫在眉睫。
近年来，离子色谱(Ion Chromatography，IC)在糖的分离方面得到了广泛的应用，其原理通常是采用NaOH、KOH、Na2CO3等水溶液作为流动相，在离子交换色谱柱上，对容易离子化的目标物进行分析的过程。由于IC流动相中常含有非挥发性的Na+、K+等离子，IC与MS联用技术受到很大的技术障碍。将IC流动相通过离子色谱抑制器后再接入质谱可除去非挥发性的阳离子，但是操作过程非常繁琐。
因此，存在对一种快速、准确地定性和定量分析糖类化合物的检测方法的需求。
所引用的参考文献：
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[3]A.Cáceres,S.Cárdenas,M.Gallego,A.Rodríguez,M.Valcárcel,Chromatographia 52(2000)314.
[4]W.L.Qian,Z.Khan,D.G.Watson,J.Fearnley,J.Food Comp.Anal.21(1)(2008)78.
[5]J.Kuligowski,G.Quintás,S.Garrigues,M.de la Guardia.Talanta 77(2008)779–785
[6]Kelsey R.Brereton,David B.Green.Talanta 100(2012)384–390
[7]Zuoyi Zhu,Lingling Xi,Qamar Subhani,Zhongping Huang,YanZhu.Talanta 113(2013)113–117
[8]Mohammad A.Kamal,Peter Klein.Talanta 115(2013)200–207。
发明内容
本申请的目的是提供一种使用依次串联的离子色谱仪、实时直接分析离子源与质谱仪对样品中的糖类化合物比如L-山梨糖进行检测的方法。
其中，快速分析包括快速的定性分析和定量分析。
在一个实施方案中，质谱可以是本领域常用的质谱，比如三级四极杆、QTOF、QTRAP等。
在一个实施方案中，所述糖类化合物可以选自L-山梨糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖、木糖或果糖。
具体地，在一个方面，本申请提供一种用于快速分析样品中的糖类化合物的方法，所述方法使用依次串联的离子色谱仪、实时直接分析离子源与质谱仪对样品中的糖类化合物进行检测。
在以上或其他实施方式中，所述方法可以采用依次串联的离子色谱仪、实时直接分析离子源与三级四极杆质谱仪(IC-DART-MS/MS)在正离子模式下，优选地在正离子多级反应监测扫描模式下，对样品中的糖类化合物进行检测。
在以上或其他实施方式中，所述方法采用依次串联的离子色谱仪、实时直接分析离子源与三级四极杆质谱仪在正离子多级反应监测扫描模式下对样品中的L-山梨糖进行检测，得到包括各种碎片离子的信号的质谱图，以质谱图中m/z 145.3为定性离子来判断样品中是否含有L-山梨糖，其中实时直接分析离子源的测试条件为：载气为氦气，氦气压力表的示数0.55MPa；放电针5KV；格栅电压350V；轨道移动速度0.4mm/s；离子源加热器温度550℃；去簇电压50V；入口电压10V。
在以上或其他实施方式中，离子色谱的流动相可以为甲醇和水的混合溶液，其中混合溶液中甲醇的体积百分数为80％-100％，NaOH的浓度为4-10mmol/L；三级四极杆质谱仪的参数碰撞能量可以为18.0ev。
在以上或其他实施方式中，在所得到的包括各种碎片离子的信号的质谱图中，以m/z 163.2为定量离子峰并对该定量离子峰的峰面积进行积分，结合标准曲线和定量离子峰的峰面积来计算样品中的L-山梨糖的含量。
在以上或其他实施方式中，其中，标准曲线的获得包括如下步骤：
以去离子水为溶剂配制浓度为0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/mL的L-山梨糖标准溶液；
实施如上任一项技术方案所述的方法，得到包括各种碎片离子的信号的质谱图，以其中的m/z 163.2为定量离子，并对m/z 163.2所对应的信号的峰面积进行积分，以m/z163.2所对应的信号的峰面积对L-山梨糖的浓度作图，并对图中符合线性范围的点实行线性拟合，得到L-山梨糖标准溶液的标准曲线方程。
本领域的技术人员还将理解的是，本申请的质谱分析方法及快速定性和定量分析方法也可以用于其它糖类化合物(比如L-阿拉伯糖、葡萄糖、木糖或果糖)的分析检测中，必要时，本领域的技术人员可以根据其技术常识并通过常规的实验手段来进一步优化具体检测样品的测试条件。
比如，用于其他种类的单糖的MS/MS参数如下表1所示。
表1以L-阿拉伯糖为例，用于其他单糖分析的MS/MS参数
A*为定量离子，B为定性离子。
与现有技术相比，本申请的糖类化合物的快速定性和定量检测的方法具有以下的有益效果：
1、本申请首次提出IC-DART-MS/MS联用技术，并将其应用于糖类化合物比如L-山梨糖的分析中；
2、克服了MS样品溶液或流动相中不能存在非挥发性盐的缺点，拓展了MS的适用范围；
3、克服现有技术繁琐的前处理过程，工作效率大大提高；
4、比现有的技术节约成本；
5、要比现有的技术更加绿色环保；
6、结合离子色谱能够使糖类化合物的同分异构体实现分离，结合DART离子源，能有效的电离糖类化合物；
7、具有较高的灵敏度；克服了样品和流动相中盐对离子化的影响。
附图说明
附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，但其并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1显示离子色谱串联实时直接分析质谱装置示意图。
图2显示流动相比例的改变对峰面积的影响，其中1-1和1-2表示流动相为100％甲醇；2-1和2-2表示流动相为体积百分数90％的甲醇水溶液；3-1和3-2表示流动相为体积百分数80％的甲醇水溶液；4-1和4-2表示流动相为体积百分数70％的甲醇水溶液。
图3显示在相同的条件下在正离子模式下检测L-山梨糖标准品的3个重复样品的质谱图，其中峰面积的相对标准偏差(RSD)为9.8％，显示出该方法应用于分析时具有良好的重现性。
具体实施方式
下面通过实施例来描述本申请的实施方式，本领域的技术人员应当认识到，这些具体的实施例仅表明为了达到本申请的目的而选择的实施技术方案，并不是对技术方案的限制。根据本申请的教导，结合现有技术对本申请技术方案的改进是显然的，均属于本申请保护的范围。
仪器与试剂
ICS 5000+离子色谱系统(美国Thermo公司)，Q-Tarp 4000三重串联四极杆质谱(美国Applied Biosystems公司)，实时分析离子源(DART，美国Ionsense公司)。L-山梨糖标准品来自于Sigma。甲醇(高效液相色谱级，美国Merck公司)；实验室用水为经Milli-Q净水系统(0.22μm过滤膜)过滤的去离子水。检测样品来自L-山梨糖的制备山梨糖醇的发酵液。
进样方式
采用12Dip-it进样模块进样方式：Dip管蘸取样品，每一个样品重复3根Dip管。将蘸有样品的Dip管于DART-MS/MS离子源气流出口与质谱进样口之间通过，即可得到样品的实时质谱图。
在以下实例中，仅以L-山梨糖为例，其他糖类化合物也可以按照与以下的方法相类似的方法来检测，必要时，本领域的技术人员可以根据其技术常识并通过常规的实验手段来进一步优化具体检测样品的测试条件。
实施例1
样品中的L-山梨糖的定性和定量分析
使用依次串联的离子色谱仪、实时直接分析离子源与三级四极杆质谱仪(IC-DART-MS/MS)(如图1所示)在正离子模式下对样品中的L-山梨糖进行检测，得到包括各种碎片离子的信号的质谱图。
其中，IC-DART-MS/MS检测示意图如图1所示，样品表面的待测物经DART离子源解吸并离子化后，进入质谱进行采集。L-山梨糖为含羰基的碱性化合物，易于结合带正电荷的质子、NH4+等形成正离子，故采用正离子模式。L-山梨糖m/z 198.3[M+NH4]+为母离子，经过打碎之后有诸多碎片，选择m/z 163.2为定量离子；m/z 145.3为定性离子，判断样品中是否存在L-山梨糖。其中实时直接分析离子源的测试条件为：载气为氦气，氦气压力表的示数0.55MPa；放电针5KV；格栅电压350V；轨道移动速度0.4mm/s；离子源加热器温度550℃；去簇电压50V；入口电压10V。
另外，实验发现，氦气(He)的灵敏度明显高于氮气(N2)，故选择氦气作为载气。实验还比较了加热器温度对目标物响应的影响，当温度逐渐上升时，响应逐渐增大，选择550℃进行实验。其次还考察了离子色谱的流动相(甲醇/水)对灵敏度的影响(见图2)，逐渐改变流动相中水含量的变化比较目标物的响应趋势，结果表明甲醇含量越高时目标物的响应越高，因此选择流动相为甲醇和水的混合溶液，其中混合溶液中甲醇的体积百分数为80％-100％，NaOH的浓度为4-10mmol/L。上述优化过程很大程度上改进了方法的灵敏度和精密度。
此外，检测的质谱条件如表2所示。
表2用于L-山梨糖的MS/MS质谱参数
*为定量离子，B为定性离子。
为了验证结果的准确性，参照文献((丁黎,陈建华,安登魁.衍生化GC法测定生物转化产品L—山梨糖及其中残余D—山梨醇的含量[J].药学学报,1998,33(3):217-221)的方法对相同的检测样品进行了定性分析，结果与用本申请的方法所得到的结果相一致。
并且，与文献的方法相比，本申请的方法要简单、便捷得多。
此外，在所得到的包括各种碎片离子的信号的质谱图中，以m/z 163.2为定量离子峰并对该定量离子峰的峰面积进行积分，结合标准曲线和定量离子峰的峰面积来计算样品中的L-山梨糖的含量。
其中，标准曲线的获得包括如下步骤：以去离子水为溶剂配制浓度为0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/mL的L-山梨糖标准溶液；
实施如上所述的方法，得到包括各种碎片离子的信号的质谱图，以其中的m/z163.2为定量离子，并对m/z 163.2所对应的信号的峰面积进行积分，以m/z 163.2所对应的信号的峰面积对L-山梨糖的浓度作图，并对图中符合线性范围的点实行线性拟合，得到L-山梨糖标准溶液的标准曲线方程。
为了验证结果的准确性，参照文献(丁黎,陈建华,安登魁.衍生化GC法测定生物转化产品L—山梨糖及其中残余D—山梨醇的含量[J].药学学报,1998,33(3):217-221)的方法对相同的检测样品进行了定量分析，结果与用本申请的方法所得到的结果相一致。
以上所述仅为本申请的优选实施例，并非对本申请作出任何形式上和实质上的限制。本领域的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，当可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更改、修饰与演变的等同变化均为本申请的等效实施例；同时，凡依据本申请的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更改、修饰与演变等均在本申请的由权利要求界定的范围内。
Claims (4)
1.一种用于快速分析样品中的糖类化合物的方法，所述方法采用依次串联的离子色谱仪、实时直接分析离子源与三级四极杆质谱仪在正离子多级反应监测扫描模式下对样品中的L-山梨糖进行检测，得到包括各种碎片离子的信号的质谱图，以质谱图中m/z 145.3为定性离子来判断样品中是否含有L-山梨糖，其中实时直接分析离子源的测试条件为：载气为氦气，氦气压力表的示数0.55MPa；放电针5KV；格栅电压350V；轨道移动速度0.4mm/s；离子源加热器温度550℃；去簇电压50V；入口电压10V；
其中离子色谱仪的流动相为甲醇和NaOH溶液的混合溶液，其中混合溶液中甲醇的体积百分数为80％-100％，NaOH的浓度为4-10mmol/L；三级四极杆质谱仪的碰撞能量为18.0ev。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所得到的包括各种碎片离子的信号的质谱图中，以m/z 163.2为定量离子峰并对该定量离子峰的峰面积进行积分，结合标准曲线和定量离子峰的峰面积来计算样品中的L-山梨糖的含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，标准曲线的获得包括如下步骤：
以去离子水为溶剂配制浓度为0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/mL的L-山梨糖标准溶液；
在上述方法下进行分析，得到包括各种碎片离子的信号的质谱图，以其中的m/z 163.2为定量离子，并对m/z 163.2所对应的信号的峰面积进行积分，以m/z 163.2所对应的信号的峰面积对L-山梨糖的浓度作图，并对图中符合线性范围的点实行线性拟合，得到L-山梨糖标准溶液的标准曲线方程。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述的去离子水的电阻率大于等于18.2MΩ.cm。
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