CN104950062A - 蜂蜜中甜菜糖浆掺假的鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蜂蜜中甜菜糖浆掺假的鉴别方法。本发明的目的在于针对目前造假蜂蜜中的甜菜糖浆,找到一种准确、快速的蜂蜜中甜菜糖浆的鉴别检测方法。为了实现上述发明目的,本发明公开了一种蜂蜜中甜菜糖浆的检测方法,包括样品前处理、液相色谱分离、质谱检测三个步骤。该方法是以质荷比为168.1016的3-甲氧基酪胺为甜菜糖浆特征标志物的液相色谱-质谱检测法。
Description
技术领域
本发明涉及一种蜂蜜是否掺有甜菜糖浆的鉴别检测方法。
背景技术
根据国家标准GB 14963-2011《食品安全国家标准蜂蜜》,蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜/分泌物或蜜露,与自身分泌物结合后,经充分酿造而成的天然甜物质。因此蜂蜜中不应当掺加任何外来的物质。然而掺假蜂蜜屡禁不绝,一些企业和个人将蔗糖、糖浆等甜味物质掺加到纯正蜂蜜中,甚至使用蔗糖、糖浆、香精等勾兑制造“蜂蜜”,对侵害了消费者的权益,影响了蜂蜜行业的正常发展。
现行的蜂蜜相关标准GB/T 18932.1-2002,可以对蜂蜜中的玉米糖浆等C4植物糖浆进行掺假鉴别。但是由于甜菜属于C3植物,它的碳同位素值与蜂蜜的碳同位素值相近,所以很难使用现有的标准和方法对以甜菜糖为原料制成的甜菜糖浆进行识别和鉴定。因此,十分有必要建立准确、快速的蜂蜜甜菜糖浆掺假鉴别技术,以适应蜂蜜掺假的新手段,维护消费者的权益。
发明内容
本发明的目的在于针对目前用于蜂蜜掺假的甜菜糖浆,找到一种准确、快速的蜂蜜中甜菜糖浆掺假的鉴别方法。
本发明提供了一种蜂蜜中甜菜糖浆掺假的鉴别方法,其以3-甲氧基酪胺为甜菜糖浆特征标志物,对蜂蜜进行检测,检测出3-甲氧基酪胺的蜂蜜即为甜菜糖浆掺假蜂蜜。
进一步地,该方法以液相色谱-质谱法进行检测。
进一步地,其中液相色谱-质谱为线性离子阱-静电场轨道阱组合质谱(LTQ-Orbitrap)。
进一步地,其中液相色谱的分离条件为:色谱柱选用T3色谱柱;柱温为40℃;流动相为A.0.1%甲酸—B.甲醇,流速为0.2mL/min;采用梯度洗脱的方式,以体积百分比计,0.0~1.0min,A:99%、B:1%;1.0~4.0min,A:99%~50%;B:1%~50%;4.0~9.0min,A:50%~0%;B:50%~100%;9.1~18.0min,A:99%、B:1%,液相分离采用在线阀切换技术。
进一步地,其中质谱检测条件为:采用电喷雾离子源;正离子模式扫描;在鞘气(N2)流量35arb;辅助气(N2)流量5arb;喷雾电压4.00kV;毛细管温度320℃;毛细管电压25V;Tube lens电压95V的条件下;质谱分辨率设定为30000。
进一步地,在进行液相色谱-质谱法之前,还包括前处理步骤。
进一步地,前处理步骤为溶解法:准确称取蜂蜜样品于具塞刻度离心管中,加入超纯水,震荡至溶解,用0.2μm滤膜过滤。
进一步地,前处理步骤为乙腈提取法:准确称取蜂蜜样品,加入超纯水,涡旋溶解,再加入乙腈,震荡提取10.0min,10000rpm高速离心3.0min,取上层清液,氮气吹干后用超纯水定容,用0.2μm滤膜过滤。
进一步地,检测出质荷比为168.1016的3-甲氧基酪胺的蜂蜜为甜菜糖浆掺假蜂蜜,未检测出质荷比为168.1016的蜂蜜为不包含3-甲氧基酪胺的蜂蜜。
本发明公开了一种蜂蜜中甜菜糖浆掺假的检测方法,包括样品前处理、液相色谱分离、质谱检测三个步骤。该方法是以质荷比为168.1016的3-甲氧基酪胺为甜菜糖浆的特征标志物的液相色谱-质谱检测法。通过液相色谱-质谱法的谱图比对,发现纯蜂蜜和甜菜糖浆的差异性物质,即甜菜糖浆的特征标志物。经过结构鉴定,甜菜糖浆的特征标志物是3-甲氧基酪胺。最终确定质荷比为168.1016的3-甲氧基酪胺为甜菜糖浆的特征标志物。
所述的样品前处理方法为:(1)溶解法。准确称取2.0(±0.05)g蜂蜜样品于10mL具塞刻度离心管中,加入20.0mL超纯水,震荡至溶解,用0.2μm滤膜过滤;(2)乙腈提取法。准确称取2.0(±0.05)g蜂蜜样品,加入1.0mL超纯水,涡旋溶解,再加入5.0mL乙腈,震荡提取10.0min,10000rpm高速离心3.0min,取上层清液2.0mL,氮气吹干后用超纯水定容至1.0mL,用0.2μm滤膜过滤。
所述的液相分离条件为:色谱柱选用T3色谱柱;柱温为40℃;流动相为A.0.1%甲酸—B.甲醇,流速为0.2mL/min;采用梯度洗脱的方式,以体积百分比计,0.0~1.0min,A:99%、B:1%;1.0~4.0min,A:99%~50%;B:1%~50%;4.0~9.0min,A:50%~0%;B:50%~100%;9.1~18.0min,A:99%、B:1%,液相分离采用在线阀切换技术,保留时间4.0min之前的色谱流出物切换至废液瓶,以免干扰物质进入质谱其影响质谱检测的准确性。
所述的质谱检测条件为:使用线性离子阱-静电轨道阱质谱仪(LTQ-Orbitrap);采用电喷雾离子源;正离子模式扫描;在鞘气(N2)流量35arb;辅助气(N2)流量5arb;喷雾电压4.00kV;毛细管温度320℃;毛细管电压25V;Tube lens电压95V的条件下;质谱分辨率设定为30000。由于LTQ-Orbitrap具有高质量精度和高分辨率的特性,确保了目标物的定性可靠和检测的准确性。
本发明的方法操作简单、准确率高、用样量低、检测限低,极大地提高了甜菜糖浆掺假蜂蜜检测的效率和准确性。
附图说明
图1为实施例1中质荷比为168.1016离子的二级质谱图;
图2为实施例1中3-甲氧基酪胺的二级质谱图(质荷比为168.1016离子);
图3a为实施例3中真实蜂蜜样品的液相色谱-质谱谱图;
图3b为实施例3中甜菜糖浆样品的液相色谱-质谱谱图;
图3c为实施例3中含5%甜菜糖浆的蜂蜜样品的液相色谱-质谱谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1甜菜糖浆特征标志物的确定和鉴定
第一步,典型甜菜糖浆和典型纯蜂蜜的收集
收集不同厂家和来源的甜菜糖浆,共收集到目前常用的10种甜菜糖浆。收集国内不同产地和蜜源的蜂蜜,产地包括辽宁、黑龙江、河北、河南、内蒙古、山东、湖北、安徽等26个省市,蜜源包括油菜、荆条、苹果、洋槐、荔枝、椴树、龙眼、枣花、葵花、紫云英、芝麻、野桂花等12种。
第二步,甜菜糖浆特征峰的确定
对收集和制作的甜菜糖浆,以及收集的纯蜂蜜,使用LTQ-Orbitrap进行检测。通过谱图比对,发现所有被检测甜菜糖浆中均大量含有质荷比为168.1016的离子,而所有纯蜂蜜中均不含有这种离子。因此确认这种离子是甜菜糖浆显著区别于纯蜂蜜的特征性差异物质,可以使用这种离子作为甜菜糖浆的特征标志物。
第三步,甜菜糖浆特征标志物的结构鉴定
使用LTQ-Orbitrap的多级质谱功能,对甜菜糖浆中质荷比为168.1016的这种离子进行二级质谱检测,见图1。由离子的精确质量数和二级质谱中离子的各个碎片的精确质量数推断,这种物质是3-甲氧基酪胺(C9H13NO2)。购买3-甲氧基酪胺标准品,经过LTQ-Orbitrap的检测,甜菜糖浆中质荷比为168.1016的离子,其保留时间和二级质谱均与3-甲氧基酪胺产生的质荷比为168.1016的离子相同(见附图1和附图2),因此可以确定甜菜糖浆的特征标志物为3-甲氧基酪胺。
实施例2甜菜糖浆检测方法的确定
1.样品前处理
(1)溶解法。准确称取2.0(±0.05)g蜂蜜样品于10mL具塞刻度离心管中,加入20.0mL超纯水,震荡至溶解,用0.2μm滤膜过滤;(2)乙腈提取法。准确称取2.0(±0.05)g蜂蜜样品,加入1.0mL超纯水,涡旋溶解,再加入5.0mL乙腈,震荡提取10.0min,10000rpm高速离心3.0min,取上层清液2.0mL,氮气吹干后用超纯水定容至1.0mL,用0.2μm滤膜过滤。
2.仪器分析条件
液相色谱-质谱条件
a)液相色谱:Accela(Thermo scientific);
b)色谱柱:Atlantis T3,3μm,150×2.1mm(内径)或相当者;
c)流动相及梯度洗脱程序:A.0.1%甲酸水溶液,B.甲醇,梯度洗脱程序参见表1;
d)流速:0.2mL/min;
e)柱温:40℃;
f)进样量:20.0μL;
g)质谱仪:线性离子阱-静电场轨道阱组合质谱(LTQ-Orbitrap)
h)离子源:电喷雾离子源;
i)扫描方式:正离子模式扫描;
j)鞘气(N2)流量:35arb;
k)辅助气(N2)流量:5arb;
l)喷雾电压:4.00kV;
m)毛细管温度:320℃;
n)毛细管电压:25V;
o)Tube lens电压95V;
p)质谱分辨率:30000;
q)检测离子:m/z 168.1016。
表1.1梯度洗脱程序
时间(min) | A(%) | B(%) |
0.0 | 99.0 | 1.0 |
1.0 | 99.0 | 1.0 |
4.0 | 50.0 | 50.0 |
9.0 | 0.0 | 100.0 |
9.1 | 99.0 | 1.0 |
18.0 | 99.0 | 1.0 |
实施例3蜂蜜样品及配制掺杂甜菜糖浆样品的测定
样品来源:从历年可靠来源中留存的40个真实蜂蜜样品,这些样品包括油菜、椴树、洋槐等典型蜜种,经过反复验证为纯正蜂蜜。5个甜菜糖浆样品,来自不同地区的糖浆生产厂家。任意选取其中1个甜菜糖浆,按照5%的重量百分比混入任意选取的15个真实蜂蜜样品,制成15个含5%甜菜糖浆的蜂蜜。
检测方法:使用线性离子阱-静电场轨道阱组合质谱(LTQ-Orbitrap)测定真实蜂蜜样品、甜菜糖浆样品和含5%甜菜糖浆的蜂蜜,以质荷比为168.1016的3-甲氧基酪胺为甜菜糖浆的特征标志物,检测出特征标志物的样品为阳性,没有检测出特征标志物的样品为阴性。
样品前处理方法:(1)溶解法。准确称取2.0(±0.05)g蜂蜜样品于10mL具塞刻度离心管中,加入20.0mL超纯水,震荡至溶解,用0.2μm滤膜过滤;(2)乙腈提取法。准确称取2.0(±0.05)g蜂蜜样品,加入1.0mL超纯水,涡旋溶解,再加入5.0mL乙腈,震荡提取10.0min,10000rpm高速离心3.0min,取上层清液2.0mL,氮气吹干后用超纯水定容至1.0mL,用0.2μm滤膜过滤。
液相色谱方法:色谱柱选用T3色谱柱;柱温为40℃;流动相为A.0.1%甲酸—B.甲醇,流速为0.2mL/min;采用梯度洗脱的方式,以体积百分比计,0.0~1.0min,A:99%、B:1%;1.0~4.0min,A:99%~50%;B:1%~50%;4.0~9.0min,A:50%~0%;B:50%~100%;9.1~18.0min,A:99%、B:1%,所述的液相分离采用在线阀切换技术;质谱方法:采用电喷雾离子源;正离子模式扫描;在鞘气(N2)流量35arb;辅助气(N2)流量5arb;喷雾电压4.00kV;毛细管温度320℃;毛细管电压25V;Tube lens电压95V的条件下;质谱分辨率设定为30000。
检测结果:见表1。乙腈提取法的样品谱图见附图3。
表1实施例2中所测样品的检测结果
结果分析:质荷比为168.1016的甜菜糖浆特征标志物3-甲氧基酪胺的检出,即表1中的“阳性”,代表样品中含有甜菜糖浆。从表1的结果可以看出,所有真实蜂蜜样品均为阴性,没有检出3-甲氧基酪胺,而所有甜菜糖浆和掺有5%甜菜糖浆的蜂蜜中均为阳性,检出了3-甲氧基酪胺。该实施例说明本方法的准确率为100%,可以用于蜂蜜中甜菜糖浆掺假的准确、快速鉴别。
Claims (9)
1.一种蜂蜜中甜菜糖浆掺假的鉴别方法,其特征在于,以3-甲氧基酪胺为甜菜糖浆特征标志物,对蜂蜜进行检测,检测出3-甲氧基酪胺的蜂蜜即为甜菜糖浆掺假蜂蜜。
2.根据权利要求1所述的鉴别方法,其特征在于,该方法以液相色谱-质谱法进行检测。
3.根据权利要求1-2任一项所述的鉴别方法,其特征在于,其中液相色谱-质谱为线性离子阱-静电场轨道阱组合质谱(LTQ-Orbitrap)。
4.根据权利要求1-3任一项所述的鉴别方法,其特征在于,其中液相色谱的分离条件为:色谱柱选用T3色谱柱;柱温为40℃;流动相为A.0.1%甲酸—B.甲醇,流速为0.2mL/min;采用梯度洗脱的方式,以体积百分比计,0.0~1.0min,A:99%、B:1%;1.0~4.0min,A:99%~50%;B:1%~50%;4.0~9.0min,A:50%~0%;B:50%~100%;9.1~18.0min,A:99%、B:1%,液相分离采用在线阀切换技术。
5.根据权利要求1-4任一项所述的鉴别方法,其特征在于,其中质谱检测条件为:采用电喷雾离子源;正离子模式扫描;在鞘气(N2)流量35arb;辅助气(N2)流量5arb;喷雾电压4.00kV;毛细管温度320℃;毛细管电压25V;Tube lens电压95V的条件下;质谱分辨率设定为30000。
6.根据权利要求1-5任一项所述的鉴别方法,其特征在于,在进行液相色谱-质谱法之前,还包括前处理步骤。
7.根据权利要求6所述的鉴别方法,其特征在于,前处理步骤为溶解法:准确称取蜂蜜样品于具塞刻度离心管中,加入超纯水,震荡至溶解,用0.2μm滤膜过滤。
8.根据权利要求6所述的鉴别方法,其特征在于,前处理步骤为乙腈提取法:准确称取蜂蜜样品,加入超纯水,涡旋溶解,再加入乙腈,震荡提取10.0min,10000rpm高速离心3.0min,取上层清液,氮气吹干后用超纯水定容,用0.2μm滤膜过滤。
9.根据权利要求1-8任一项所述的鉴别方法,其特征在于,检测出质荷比为168.1016的3-甲氧基酪胺的蜂蜜为甜菜糖浆掺假蜂蜜,未检测出质荷比为168.1016的蜂蜜为不包含3-甲氧基酪胺的蜂蜜。
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