CN105136959A - 一种用于测定植物油中黄曲霉素b1含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于测定植物油中黄曲霉素B1含量的方法，包括以下步骤：1）进行样品前处理；2）配制标准溶液；3）选择色谱条件；4）选择质谱分析条件；5）进行样品的检测；6）记录所测得植物油中黄曲霉素B1的含量。本发明建立了检测植物油中黄曲霉素B1残留的LC－MS/MS方法，通过对仪器条件和前处理条件进行优化，使得方法的灵敏度显著提高，优于目前报道的检测方法，该方法简单、灵敏、稳定，可满足植物油中黄曲霉素B1残留的检测与确证要求。
Description
技术领域
本发明涉及食用油重金属检测领域，具体是指一种用于测定植物油中黄曲霉素B1含量的方法。
背景技术
植物油广泛分布于自然界中，是从植物的果实、种子、胚芽中得到的油脂（如花生油、豆油、亚麻油、蓖麻油、菜子油等）。黄曲霉素B1是目前已知植物油中主要的有害物质。
黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一组结构类似的二呋喃香豆素代谢产物，目前已分离出并明确结构的有12种以上。其中黄曲霉毒素B1的毒性和致癌性最强，其毒性比氰化钾高，也是目前最强的化学致癌物，故各国对其在食品中的允许量都有严格规定。我国植物油中黄曲霉素B1的国标测定方法也为液相测定方法，该法采用石油醚溶解样品，氧化铝层析柱净化，再用高效液相色谱仪结合荧光检测器测定。因为对氧化铝的规格及活化程度要求较高，造成检测数据重现性较差，而且不能满足确证要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对仪器条件和前处理条件进行优化，使得检测灵敏度显著提高的用于测定植物油中黄曲霉素B1含量的方法。
本发明通过下述技术方案实现：一种用于测定植物油中黄曲霉素B1含量的方法，包括以下步骤：
（1）进行样品前处理；
（2）配制标准溶液；
（3）选择色谱条件；
（4）选择质谱分析条件，质谱分析条件为离子源：大气压光致电离；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；干燥气：N2；干燥气温度：325℃；干燥气流速：8L/min；雾化气压力：275.8kPa；气化温度：350℃；
（5）进行样品的检测；
（6）记录所测得植物油中黄曲霉素B1的含量。
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（1）中，样品前处理的具体过程包括以下步骤：
（1.1）称取1.0g样品，精确至0.0001g，置于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯－环己烷混合溶液定容至刻度，涡旋1min，过0.45μm有机滤膜后上GPC净化；
（1.2）GPC泵流速4.7mL/min，弃去0～9min流分，收集9～22min流分，22～27min冲洗GPC柱。洗脱液为乙酸乙酯－环己烷混合溶液；
（1.3）将收集的流分于45℃真空旋转蒸发至近干，残渣用1mL甲醇－丙酮混合溶液充分溶解，准确移取0.7mL溶解液于1mL进样瓶中，氮吹至干；
（1.4）再加入0.2mL甲醇－丙酮混合溶液充分溶解后供液相色谱－串联质谱仪分析。
由于植物油是由不饱和脂肪酸和甘油化合而成的化合物，广泛分布于自然界中。目前去除脂肪类大分子干扰物最有效的方法是GPC(自动凝胶系统)法。GPC是20世纪70年代发展起来的一种净化手段，由于具有自动化程度高、净化效果好及回收率高等优点而被广泛应用。该方法利用化合物中各组分的分子量大小不同，与柱填料之间的作用不同，导致洗脱时间不同而达到分离的目的。因此，本研究利用乙酸乙酯－环己烷将样品溶解，通过凝胶渗透色谱柱除去植物油样品中的大分子杂质，并收集目标化合物。在样品运行前，需对GPC的淋洗条件进行选择。本技术方案采用推荐流速4.7mL/min洗脱，通过检测浓度为20μg/L的黄曲霉素B1在不同流出时间的收集液，确定收集9～22min的流分。结果表明，在此洗脱时间收集，目标化合物的回收率均大于80%，以此确定了本方法的GPC收集时间。此外，为了降低方法检出限，本方法采取氮吹的方式富集样品溶解液，取得了较好效果。
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（2）中，配制标准溶液包括标准工作溶液、空白样品溶液以及基质混合标准工作溶液。
标准工作溶液：以甲醇－丙酮混合溶液(3∶2)稀释得到所需浓度的黄曲霉素B1标准溶液，现配现用；空白样品提取液：选择阴性样品，按样品前处理方法操作；基质混合标准工作溶液：根据仪器的灵敏度和线性范围，吸取一定量的标准工作溶液，用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准工作溶液。
基质是指样品中待测物以外的组分，其常对分析物的分析过程有显著干扰，并影响分析结果的准确性。由于植物油样品富含油脂，为了消除测定液中存在的基质效应，本方法采取凝胶渗透色谱去除油脂，可较大程度减小测定液中的基质效应。实验分别采用甲醇－丙酮混合溶液(3∶2)及空白样品测定液配制成浓度分别为3，10，50μg/L的目标化合物混合标准溶液，通过二者响应值的比较来确定基质效应。
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（3）中，色谱条件为色谱柱：XDBC18色谱柱(4.6mm×50mm，1.8μm)；流速：0.25mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；流动相：A为甲醇，B为10mmoL/L乙酸铵水溶液；梯度洗脱程序：0～5min，25%～75%A；5～17min，75%A；17～20min，75%～100%A，20～34min，100%A。
色谱条件的优化
色谱柱的选择
为了优化色谱峰的分离并改善峰形，本方法分别采用资生堂MGⅢ－C18色谱柱(150mm×2.1mm，5μm)、XDBC18色谱柱(4.6mm×50mm，1.8μm)、ZOＲBAXSB－Aq色谱柱(150mm×2.1mm，3.5μm)进行分离实验，发现XDBC18色谱柱(4.6mm×50mm，1.8μm)的分离效果较好。
进样量的选择
进样量大可提高测定的灵敏度，但XDBC18色谱柱(4.6mm×50mm，1.8μm)柱容量较小，所以本方法选择的进样量为10μL。在上述优化条件下，黄曲霉素B1。
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（4）中，质谱分析条件为离子源：大气压光致电离；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；干燥气：N2；干燥气温度：325℃；干燥气流速：8L/min；雾化气压力：275.8kPa；气化温度：350℃。
离子源与助剂的选择
因为黄曲霉素B1为弱极性化合物，在ESI源和APCI源的作用下均不易电离，因此响应值很低。但黄曲霉素B1在接受了光子作用后则会发生光电离(PI)成为可被质谱仪检测的离子，所以实验选择APPI源。助剂作为光电离的媒介，主要通过电荷交换或质子转移帮助待测物形成离子。本实验对比了丙酮和甲苯两种助剂的效果。发现丙酮作助剂时，黄曲霉素B1的响应值均比相同条件下甲苯作助剂时低，因此实验选择甲苯作为助剂。
质谱参数的优化
采用直接进样方式将浓度为100μg/L的黄曲霉素B1，标准工作溶液注入离子源中，在正离子模式下进行母离子全扫描，得到黄曲霉素B1的分子离子峰。根据欧盟指令规定对于质谱确证方法必须达到4个确证点的要求，低分辨液相色谱－质谱联用仪检测应在确定母离子的基础上选择两个以上的子离子。以该离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，然后采集全扫描的二级质谱图，得到碎片离子信息，最后再对得到的二级质谱参数(如破碎电压、碰撞能量等)进行优化，以定性离子与定量离子产生的离子对强度比例达到最大时为最佳。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明在此洗脱时间收集目标化合物，使目标化合物的回收率均大于80%，以此确定了本方法的GPC收集时间；
（2）为了降低方法检出限，本发明方法采取氮吹的方式富集样品溶解液，取得了较好效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
实施例：
本实施例的主要实施步骤如下：
（1）进行样品前处理；
（2）配制标准溶液；
（3）选择色谱条件；
（4）选择质谱分析条件；
（5）进行样品的检测；
（6）记录所测得植物油中黄曲霉素B1的含量。
其中，所述步骤（1）中，样品前处理的具体过程包括以下步骤：
（1.1）称取1.0g样品，精确至0.0001g，置于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯－环己烷混合溶液定容至刻度，涡旋1min，过0.45μm有机滤膜后上GPC净化；
（1.2）GPC泵流速4.7mL/min，弃去0～9min流分，收集9～22min流分，22～27min冲洗GPC柱。洗脱液为乙酸乙酯－环己烷混合溶液；
（1.3）将收集的流分于45℃真空旋转蒸发至近干，残渣用1mL甲醇－丙酮混合溶液充分溶解，准确移取0.7mL溶解液于1mL进样瓶中，氮吹至干；
（1.4）再加入0.2mL甲醇－丙酮混合溶液充分溶解后供液相色谱－串联质谱仪分析。
所述步骤（2）中，配制标准溶液包括标准工作溶液、空白样品溶液以及基质混合标准工作溶液，具体配置过程为根据仪器的灵敏度和线性范围，吸取一定量的标准工作溶液，用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准工作溶液。
所述步骤（3）中，色谱条件为色谱柱：XDBC18色谱柱(4.6mm×50mm，1.8μm)；流速：0.25mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；流动相：A为甲醇，B为10mmoL/L乙酸铵水溶液；梯度洗脱程序：0～5min，25%～75%A；5～17min，75%A；17～20min，75%～100%A，20～34min，100%A。
所述步骤（4）中，质谱分析条件为离子源：大气压光致电离；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；干燥气：N2；干燥气温度：325℃；干燥气流速：8L/min；雾化气压力：275.8kPa；气化温度：350℃。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.一种用于测定植物油中黄曲霉素B1含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）进行样品前处理；
（2）配制标准溶液；
（3）选择色谱条件；
（4）选择质谱分析条件，质谱分析条件为离子源：大气压光致电离；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；干燥气：N2；干燥气温度：325℃；干燥气流速：8L/min；雾化气压力：275.8kPa；气化温度：350℃；
（5）进行样品的检测；
（6）记录所测得植物油中黄曲霉素B1的含量。
2.根据权利要求1所述的一种用于测定植物油中黄曲霉素B1含量的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，样品前处理的具体过程包括以下步骤：
（1.1）称取1.0g样品，精确至0.0001g，置于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯－环己烷混合溶液定容至刻度，涡旋1min，过0.45μm有机滤膜后上GPC净化；
（1.2）GPC泵流速4.7mL/min，弃去0～9min流分，收集9～22min流分，22～27min冲洗GPC柱；
洗脱液为乙酸乙酯－环己烷混合溶液；
（1.3）将收集的流分于45℃真空旋转蒸发至近干，残渣用1mL甲醇－丙酮混合溶液充分溶解，准确移取0.7mL溶解液于1mL进样瓶中，氮吹至干；
（1.4）再加入0.2mL甲醇－丙酮混合溶液充分溶解后供液相色谱－串联质谱仪分析。
3.根据权利要求2所述的一种用于测定植物油中黄曲霉素B1含量的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，配制标准溶液包括标准工作溶液、空白样品溶液以及基质混合标准工作溶液，具体配置过程为根据仪器的灵敏度和线性范围，吸取一定量的标准工作溶液，用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准工作溶液。
4.根据权利要求3所述的一种用于测定植物油中黄曲霉素B1含量的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，色谱条件为色谱柱：XDBC18色谱柱(4.6mm×50mm，1.8μm)；流速：0.25mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；流动相：A为甲醇，B为10mmoL/L乙酸铵水溶液；梯度洗脱程序：0～5min，25%～75%A；5～17min，75%A；17～20min，75%～100%A，20～34min，100%A。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN105866295A (zh) * | 2016-06-12 | 2016-08-17 | 肇庆学院 | 一种快速检测中药材中黄曲霉素b1含量的方法 |
| CN112540132A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-03-23 | 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所） | 一种分离富集植物油中黄曲霉毒素的方法 |
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2015
- 2015-09-23 CN CN201510610514.3A patent/CN105136959A/zh active Pending
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