CN103389350A

CN103389350A - 一种测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法

Info

Publication number: CN103389350A
Application number: CN2013103475436A
Authority: CN
Inventors: 马强; 孟宪双; 白桦; 陈云霞; 丁岚; 马会娟; 李晶瑞
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2013-08-09
Filing date: 2013-08-09
Publication date: 2013-11-13

Abstract

本发明公开了一种测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法，包括如下步骤：向待测化妆品中加入甲醇涡旋振荡，进行超声提取，提取液离心，取上清液经微孔滤膜过滤，滤液采用高效液相色谱-串联四极杆质谱分析方法进行测定；其中，所述方法中采用A和B的混合溶液作为流动相进行洗脱，A为乙腈，B为水。所述测定方法同时检测化妆品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素3种氯霉素类抗生素。本发明建立的化妆品中3种氯霉素类抗生素的测定方法准确、快速、简便且灵敏度高，可以为化妆品的检验工作和日常生产的质量控制提供科学依据和技术支持。

Description

一种测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法

技术领域

本发明涉及一种氯霉素类抗生素的测定方法，特别是涉及一种同时测定化妆品中3种氯霉素类抗生素的方法。

背景技术

氯霉素，是由委内瑞拉链丝菌产生的抗生素，属抑菌性广谱抗生素。在甲醇、乙醇、丙二醇中易溶，在水中微溶。在弱酸性或中性溶液中较稳定，在碱性溶液中易破坏。因其对造血系统有严重不良反应，需慎重使用。甲砜霉素，别名硫霉素，是氯霉素的同类物，抗菌谱和抗菌作用与氯霉素相仿。氟甲砜霉素，又名氟苯尼考、氟洛芬或氟氯霉素，是甲砜霉素的单氟衍生物。《化妆品卫生规范》（2007年版）明确规定氯霉素等抗生素为化妆品中的禁用物质。

发明内容

本发明的目的是提供一种化妆品中氯霉素类抗生素的测定方法。

本发明的又一目的是提供一种同时测定化妆品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的方法。

一种测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法，包括如下步骤：

向待测化妆品中加入甲醇涡旋振荡，进行超声提取，提取液离心，取上清液经微孔滤膜过滤，滤液采用高效液相色谱-串联四极杆质谱分析方法进行测定；其中，所述方法中采用A和B的混合溶液作为流动相进行洗脱，A为乙腈，B为水。

本发明所述的测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法，其中所述测定方法同时检测化妆品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素3种氯霉素类抗生素。

本发明所述的测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法，其中所述方法的色谱条件为：

色谱柱：XBridge Phenyl，3.5μm，2.1mm×150mm内径；柱温：35℃；进样量：5μL；

所述流动相的流速为0.3mL/min；所述洗脱程序为：0～3min，流动相中B的体积百分比为80%；3～6min，流动相中的B体积百分比由80%下降到40%；6～8min，流动相中B的体积百分比由40%下降到10%；8～8.1min，流动相中B的体积百分比由10%上升到80%；8.1～10min，流动相中B的体积百分比为80%。

本发明所述的测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法，其中所述方法的质谱条件为：

离子化方式：ESI-；毛细管电压：-2.5kV；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流速：1000L/Hr；锥孔气体流速：50L/Hr；离子源温度：150℃；萃取电压：-3.00V；射频透镜电压：-0.10V；碰撞气体：氩气；数据采集模式：MRM。

本发明所述的测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法，其中所述氯霉素的定量限为5μg/kg，所述氟甲砜霉素的定量限为10μg/kg，所述甲砜霉素的定量限为20μg/kg。

本发明所述的测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法，其中，0.5g所述待测试样中加入10mL甲醇，涡旋振荡30s，在超声波清洗仪中超声提取20min，取部分溶液置于离心管中，在离心机上以5000rpm高速离心10min后，取上清液过0.2μm微孔滤膜，滤液供上机测定。

本发明所述的测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法与现有技术不同之处在于：

本发明建立了化妆品中3种禁用氯霉素类抗生素的高效液相色谱-串联四极杆质谱分析方法：样品采用加入甲醇涡旋振荡、超声提取后，提取液经高速离心处理，上清液过0.2μm微孔滤膜，滤液以XBridge Phenyl（3.5μm，2.1×150mm）色谱柱分离后以HPLC-MS/MS多反应监测模式进行定性及定量分析；化妆品中氯霉素的定量限为5μg/kg，在5～50μg/kg3个添加水平范围内，水剂和膏霜类样品的平均回收率分别为80.56～111.29%和81.88～107.00%，相对标准偏差为4.84～12.09%；氟甲砜霉素的定量限为10μg/kg，在10～100μg/kg3个添加水平范围内，水剂和膏霜类样品的平均回收率分别为82.30～112.09%和81.26～115.75%，相对标准偏差为5.43～13.68%；甲砜霉素的定量限为20μg/kg，在20～200μg/kg3个添加水平范围内，水剂和膏霜类样品的平均回收率分别为83.49～115.53%和81.55～117.39%，相对标准偏差为6.03～10.81%。本发明所述方法可以同时检测化妆品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素3种氯霉素类抗生素，快速简便，不需要单独测定其中每一种，节省了时间也节约了成本。本发明建立的化妆品中3种氯霉素类抗生素的测定方法准确、快速、简便且灵敏度高，可以为化妆品的检验工作和日常生产的质量控制提供科学依据和技术支持。

下面结合附图对本发明所述的测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法作进一步说明。

附图说明

图1为本发明中3种氯霉素类抗生素的选择离子质量色谱图；

图2为本发明中3种氯霉素类抗生素在四种色谱柱上的信号响应比较图；

图3为本发明中3种氯霉素类抗生素在MeOH/H₂O经优化梯度洗脱后的MRM色谱图；

图4为本发明中3种氯霉素类物质在30、35、40、45及50℃下的信号响应强度比较图。

具体实施方式

实施例1

1．仪器与试剂

ACQUITY超高效液相色谱仪、Waters XEVO TQ三重四极杆质谱仪、MassLynx数据处理系统(美国Waters公司)；超纯水器(Milli-Q，美国Millipore公司)；高速冷冻离心机(CR21G，日本Hitachi公司)；超声波清洗器(KQ-600，江苏省昆山市超声仪器有限公司)；MS2型涡旋振荡器(德国IKA公司)；电子天平(AB204-S，美国METTLER TOLEDO公司)；通风柜(FC-150，大连莱博泰克实验室设备有限公司)；甲醇、乙腈及甲酸均为色谱纯试剂(美国Fisher公司)。

氯霉素（纯度98.6%）及氟甲砜霉素（纯度99.5%）购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，甲砜霉素（纯度99.3%）购自中国食品药品检定研究院，3种氯霉素类抗生素的结构式如下：

氯霉素甲砜霉素氟甲砜霉素

2．色谱条件

色谱柱：XBridge Phenyl(3.5μm，2.1mm×150mm)

流动相：A：ACN B：H₂O

柱温：35℃

流速：0.3mL/min

进样量：5μL

梯度洗脱程序：见表1。

表1梯度洗脱程序

3.质谱条件

离子化方式：ESI^-

毛细管电压：-2.5kV

脱溶剂气温度：500℃

脱溶剂气流速：1000L/Hr

锥孔气体流速：50L/Hr

离子源温度：150℃

萃取电压：-3.00V

射频透镜电压：-0.10V

碰撞气体：氩气

数据采集模式：MRM（多反应监测）

4.标准溶液的配制

准确称取3种氯霉素类抗生素标准品各10mg(精确至0.0001g)，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释种刻度，混匀，得到每种物质质量浓度为1000μg/mL的标准储备液。将各标准溶液配制成混合标准溶液，然后将其稀释成3种氯霉素标准品浓度均分别为0.1μg/L、0.2μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL系列混合标准溶液。

5.样品的预处理

称取水剂、膏霜类化妆品试样0.5g于25mL比色管中，准确加入10mL甲醇，涡旋振荡30s，然后在超声波清洗仪中超声提取20min，取部分溶液置于离心管中，在离心机上以5000rpm高速离心10min后，取上清液过0.2μm微孔滤膜，滤液供上机测定。

6.实验结果

3种氯霉素类抗生素化合物的质谱分析相关参数见表2，MRM色谱图见图1（3种氯霉素类抗生素的选择离子质量色谱图），其中编号1为甲砜霉素，编号2为氟甲砜霉素，编号3为氯霉素。

表2 3种氯霉素类抗生素的质谱分析参数

注：^*为定量离子。

7.线性关系及检出限：

将一系列不同质量浓度的3种氯霉素类混合标准溶液依次进样，以峰面积（y）对质量浓度（x）进行线性回归，绘制标准工作曲线。实验结果显示，3种物质在各自线性范围内呈良好线性关系，回归方程、线性相关系数及检出限、定量限见表2。

表2 3种氯霉素的线性方程、检出限及定量限

8.回收率及精密度：

称取经测定不含3种氯霉素类抗生素的空白化妆品0.5g，分别添加低、中、高三个浓度标准混合溶液，涡旋振荡混匀，按照本研究确定的实验方法进行测定，每种类型样品的每个添加水平平行测定6份，进行回收率实验，计算出相应目标化合物的回收率及精密度值，结果见表3。

表3化妆品中3种氯霉素的回收率及精密度（n=6）

本发明中主要从以下几个方面进行了考虑：

（1）样品提取方法的选择

氯霉素的化学结构含有对硝基苯基、丙二醇与二氯乙酰胺三个部分；甲砜霉素的结构与氯霉素相似，其中的甲砜基取代了氯霉素的硝基；与氯霉素和甲砜霉素相比，氟甲砜霉素与氯霉素的主要区别是将后者分子结构上的氯替换成氟。根据其化学结构，3种氯霉素具有易溶于醇、微溶于水的特性。在处理样品时，为使操作步骤简便且尽可能获得较高的提取效率，采用加入甲醇振荡、超声提取方式，并分别考察了提取溶剂及提取时间条件下的提取效率，确定了化妆品中3种氯霉素类抗生素的提取方法。

（2）质谱条件的优化

用甲醇稀释每种标准储备液浓度至1μg/mL，进行质谱调谐方法的优化。用蠕动泵以10μL/min的流速连续注射，分别将3种标准溶液注入ESI离子源中，根据氯霉素类化合物的化学电离性质，选择在ESI^-离子化模式下进行一级质谱分析(Q1扫描)，得到准分子离子[M-1]信息。根据欧盟2002/657/EC指令规定对于质谱确证方法须达到4个确证点的要求，应在确定母离子的基础上选择至少两个子离子。因此，在确定准分子离子后，再对准分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息，选择合理丢失且丰度较大的的两个碎片离子作为辅助定性离子，以其中丰度最大的碎片离子作为定量离子。在此过程中，分别对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量、离子源温度、雾化气等参数进行了优化。

（3）色谱柱的选择

分别对XSelect CSH C₁₈、XBridge C₁₈、XBridge Phenyl及Sunfire C₁₈（规格均为3.5μmI.D.，2.1mm×150mm）四种选择性及分离性不同的色谱柱进行了考察，实验后发现四种色谱柱对三种物质均可以较好的分离，但XBridge Phenyl色谱柱对三种物质的信号响应强度最大，而且氯霉素和氟甲砜霉素的分离度也达到基线分离。因此，最终选择XBridge Phenyl（3.5μm，2.1mm×150mm）柱作为目标物质分离时的色谱柱。3种氯霉素类抗生素在四种色谱柱上的信号响应比较结果见图2。

（4）流动相的选择

3种氯霉素类化合物均在ESI^-负离子模式下检测，因此，流动相中不考虑加入甲酸或乙酸。实验中主要考察了ACN/H₂O及MeOH/H₂O体系，并分别记录3种氯霉素物质的定量离子的峰面积。根据实验结果，在ACN/H₂O流动相体系中，氯霉素和甲砜霉素的信号与在MeOH/H₂O体系中相差无几，但氟甲砜霉素在前者体系中要比在后者中的信号响应值高，而且由于3种氯霉素类物质在ACN/H₂O流动相体系中的色谱峰形、对称性及尖锐程度要优于MeOH/H₂O体系。因此，选择ACN/H₂O作为流动相进行梯度洗脱。3种氯霉素类抗生素在ACN/H₂O经优化梯度洗脱后的MRM色谱图见图1，在MeOH/H₂O经优化梯度洗脱后的MRM色谱图见图3。

（5）色谱柱温度的优化

在液相色谱质谱分析时，色谱柱的温度会对所分离物质的保留值、信号响应强度以及选择性有不同程度的影响。本研究主要设置30、35、40、45及50℃等5个不同温度条件下，氯霉素类混合标准溶液经XBridge Phenyl色谱柱分离后，记录在不同的色谱柱温度条件下各定量离子的峰面积。实验结果表明，甲砜霉素及氟甲砜霉素的信号响应值均在35℃时达到最高值，而氯霉素在35～50℃之间的信号响应值相差无几（见图4），说明氯霉素的信号响应强度对色谱柱的温度变化并不敏感。因此，本研究选择35℃作为样品分析时色谱柱的温度。

（6）流速的优化

在液相色谱分析或液相色谱-质谱分析时，流速大小的设置在色谱峰分离及峰型优差方面也起着至关重要的作用，流速过大（在色谱柱的耐受范围之内），色谱峰分离不开；流速太小，容易造成拖尾峰，也会造成分析时间过长，降低工作效率。尤其在液相色谱-质谱分析时，流速大小的选择还应考虑离子化效率的问题。实验中分别考察了不同流速下目标物质的保留时间、分离度及信号响应强度的情况，最终确定0.3mL/min作为分析时流动相的速率。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法，其特征在于：所述测定方法同时检测化妆品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素3种氯霉素类抗生素。

3.根据权利要求2所述的测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法，其特征在于：所述方法的色谱条件为：

4.根据权利要求3所述的测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法，其特征在于：所述方法的质谱条件为：

5.根据权利要求1或2或3或4所述的测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法，其特征在于：所述氯霉素的定量限为5μg/kg，所述氟甲砜霉素的定量限为10μg/kg，所述甲砜霉素的定量限为20μg/kg。

6.根据权利要求1所述的测定化妆品中氯霉素类抗生素的方法，其特征在于：0.5g所述待测试样中加入10mL甲醇，涡旋振荡30s，在超声波清洗仪中超声提取20min，取部分溶液置于离心管中，在离心机上以5000rpm高速离心10min后，取上清液过0.2μm微孔滤膜，滤液供上机测定。