CN114460189B - 一种筛选超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁差异标志物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种筛选超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁差异标志物的方法，属于食品领域。一种筛选超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁差异标志物的方法，包括下述步骤：将超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁在相同的条件下进行预处理，得待测样品；利用色谱和质谱联用技术分别检测两组待测样品，获得相应的质谱谱图数据；利用软件Analyst 1.6.3处理所得质谱数据，获得各组蓝莓汁中各个代谢物的相对含量；对得到的各组蓝莓汁中各代谢物的相对含量进行主成分分析；对两组代谢物的相对含量数据进行正交偏最小二乘法判别分析，筛选后所得代谢物为差异标志物。色谱与质谱联用可以实现从利用色谱进行物质分离到利用质谱进行物质鉴定的整个流程。
Description
技术领域
本发明涉及一种筛选超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁差异标志物的方法，属于食品领域。
背景技术
随着国内外消费水平的提高，果汁的种类越来越丰富。蓝莓不耐储存、货架期短，它的加工主要以制汁为主。非浓缩还原蓝莓汁就是把蓝莓清洗后榨汁，直接进行灌装，经过超高压冷杀菌制成HPP蓝莓汁，或者经过短时热杀菌制成TP蓝莓汁。因为机器成本和技术等相关的原因，HPP蓝莓汁的价格普遍高于TP蓝莓汁，这就可能导致造假者以TP蓝莓汁充当HPP蓝莓汁进行售卖并从中牟利，以假乱真。然而目前缺乏有效鉴别两种蓝莓汁标志物及相关技术手段。
目前常见的果汁产品检测方法主要有荧光光谱技术、同位素分析技术和PCR技术等，它们都是针对已知造假的某些靶向化物或对原料进行鉴定，难以有效鉴别当今多种造假方式，选择性比较单一。近几年兴起的代谢组学的方法，对食品的造假检测进行鉴定，可以无偏向性地检测生物体小分子，再通过生物信息学分析，筛选差异代谢物，揭示其差异和变化。近三年来，我国浙江大学、中国农业大学等高校和研究所，分别通过非靶向代谢组学的方法，对浆果果汁、橙汁、咖啡、普洱茶叶等食品进行了组学分析或掺伪检测鉴定。但目前缺乏有效鉴别超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁的标志物和相关技术手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选超高压处理(HPP)蓝莓汁和热处理(TP)蓝莓汁差异标志物的方法，并同时提供利用筛选出的差异标志物鉴别HPP蓝莓汁和TP蓝莓汁的方法。
一种筛选超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁差异标志物的方法，
①将超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁在相同的条件下进行预处理，得待测样品；利用色谱和质谱联用技术分别检测两组待测样品，获得相应的质谱谱图数据；
利用软件Analyst 1.6.3处理所得质谱数据，具体为：基于metware数据库，对样本的代谢物进行质谱定性定量分析；用MultiaQuant软件打开多物质提取的离子流谱图，进行色谱峰的积分和校正，获得各组蓝莓汁中各个代谢物的相对含量；
②对得到的各组蓝莓汁中各代谢物的相对含量进行主成分分析(PCA)，以初步了解各组样本之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小，主成分分析表明各组间是否存在变异度；
③对两组代谢物的相对含量数据进行正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，筛选差异标志物，OPLS-DA在原始数据进行log2转换后，再进行中心化处理，公式为：
然后利用R软件中的MetaboAnalystR包OPLSR.Anal函数进行分析，计算OPLS-DA模型；基于OPLS-DA的结果，从获得的多变量分析OPLS-DA模型的变量重要性投影(VIP)可以初步筛选出不同组间差异代谢物，筛选标准为：VIP≥1；同时结合差异倍数值(fold change)来进一步筛选出差异代谢物，筛选标准为：选取log2 fold change≥4的代谢物，筛选后所得代谢物为差异标志物。
上述技术方案，步骤①中，所述质谱谱图数据为质谱图。本发明采用色谱和质谱联用技术所得图谱命名为质谱图，其中的总离子流图显示色谱峰，横坐标是时间。
具体地，得到的具体信息为：代谢物检测的保留时间(Rt)、离子检测的离子流强度(强度单位为cps)、代谢物的特征离子。
上述技术方案，步骤①中，用MultiaQuant软件打开多物质提取的离子流谱图。本发明色谱技术和质谱技术联用获得色谱图文件，所述色谱图包括两个图谱，分别在正/负离子模式下下获得，一为“总离子流图”(TIC)，另一为“多物质提取的离子流谱图”(XIC)。此处，用MultiaQuant软件打开XIC图。
上述技术方案，步骤②中，通过主成分分析判断各组间是否存在变异度。
上述技术方案，步骤③中，采取将fold change、OPLS-DA模型的VIP值相结合的方法来筛选差异代谢物，筛选标准为：选取log2 fold change≥4的代谢物：代谢物在两组蓝莓汁中差异为4倍，则认为差异显著。
上述技术方案，步骤③中，选取VIP≥1的代谢物：VIP值表示对应代谢物的组间差异在模型中各组样本分类判别中的影响强度，VIP≥1的代谢物则为差异显著。
优选地，所述预处理为：将样品从-80℃冰箱中取出解冻后，涡旋10s混匀；取混匀后的样本600μL，置于2mL EP管中，加入600μL 70％甲醇内标提取液，涡旋3min。4℃下，12000r/min离心10min；取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤。
优选地，质谱条件如下：于三重四级杆线性离子阱质谱仪AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系统上进行LIT和三重四级杆(QQQ)扫描；
在正离子模式下时，离子源气体I(GSI)，气体II(GSII)和帘气(CUR)分别设置为50、60和25psi，离子源温度为550℃，离子喷雾电压为5500V，碰撞诱导电离参数设置为高；在QQQ和LIT模式下分别用10和100μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准；QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体(氮气)设置为中等；
在负离子模式下时，离子源气体I(GSI)，气体II(GSII)和帘气(CUR)分别设置为50、60和25psi，离子源温度为550℃，离子喷雾电压为-4500V，碰撞诱导电离参数设置为高；在QQQ和LIT模式下分别用10和100μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准；QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体(氮气)设置为中等。
优选地，色谱条件如下：
色谱柱为Agilent SB-C18 1.8μm，2.1mm*100mm；以流动相A和B进行梯度洗脱，流动相A相为超纯水(加入0.1％的甲酸)，B相为乙腈(加入0.1％的甲酸)，流速为0.35mL/min；柱温为40℃；进样量为4μL；洗脱梯度条件为0.00min B相比例为5％，9.00min内B相比例线性增加到95％，并维持在95％1min，10.00-11.10min，B相比例降为5％，并以5％平衡至14min。
优选地，所述蓝莓汁来源于Duke蓝莓。进一步地，基于Duke蓝莓，所述选超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁差异标志物，在正离子模式下，包括：飞燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷和1,3,5-苯三酚；在负离子模式下为2-呋喃甲酸、杨梅素-3-O-阿拉伯糖苷、杨梅素-3-O-鼠李糖苷、松柏醇和芥子醇。
本发明进一步提供利用上述差异标志物鉴别超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁的方法。
一种鉴别超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁的方法，利用权利要求1所述方法确定超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁的差异标志物；通过检测确定待测蓝莓汁中差异标志物的含量，将上述标志物在待测蓝莓汁中的含量代入OPLS-DA模型中进行鉴别，根据标志物的含量判断待鉴别蓝莓汁。
优选地，所述OPLS-DA模型根据所述标志物在HPP和TP蓝莓汁中的含量构建而成。
本发明的有益效果为：本发明所述筛选超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁差异标志物的方法主要基于色谱与质谱联用技术。色谱与质谱联用可以实现从利用色谱进行物质分离到利用质谱进行物质鉴定的整个流程，其中超高效液相色谱串联质谱能够准确地对代谢物进行定性和定量。代谢物的定量是利用三重四级杆质谱的多反应监测模式(multiplereaction monitoring，MRM)分析完成的。MRM模式中，四级杆首先筛选目标物质的前体离子(母离子)，排除掉其他分子量物质对应的离子以初步排除干扰；前体离子经碰撞室诱导电离后断裂形成很多碎片离子，碎片离子再通过三重四级杆过滤选择出所需要的一个特征碎片离子，排除非目标离子干扰，使定量更为精确，重复性更好。
附图说明
图1为样品总离子流图，A为正离子模式，B为负离子模式；
图2为样品多物质提取的离子流谱图，A为正离子模式，B为负离子模式；
图3为样品总PCA得分图；
图4为OPLS-DA模拟验证图，A为正离子模式，B为负离子模式。
图5为OPLS-DA模型概要图，A为正离子模式，B为负离子模式。
图6为OPLS-DA S-plot图，A为正离子模式，B为负离子模式。
图7为OPLS-DA得分图，A为正离子模式，B为负离子模式。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
1.仪器设备：
恒温水浴锅(DK-S26，上海景鸿仪器设备有限公司)
自动超高压灭菌设备(HPP-600-L，浙江温州宜宾机械有限公司)
色谱：超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)
(SHIMADZU Nexera X2,https://www.shimadzu.com.cn/)
质谱：(Tandem mass spectrometry，MS/MS)(Applied Biosystems 4500QTRAP，http://www.appliedbiosystems.com.cn/)。
色谱柱：Agilent SB-C18 1.8μm，2.1mm*100mm
高速离心机(eppendorf)
涡旋震荡仪
超纯水仪(Milli-Q)
2.试剂及材料：
甲醇(色谱纯，Merck)
乙腈(色谱纯，Merck)
标准品(色谱纯，BioBioPha/Sigma-Aldrich)
蓝莓汁：蓝莓选用于辽宁省沈阳市皇冠蓝莓有限公司种植、并于2020年7月采摘的蓝莓，品种为Duke蓝莓。将新鲜无损伤的蓝莓经过清洗后去掉表面污垢，晾干后用家用榨汁机榨成蓝莓果浆，在4℃下以4500g的转速离心10min。于-80℃储存直至分析。TP和HPP处理均在当天进行，TP样品制备是使用恒温水浴进行的。取50mL蓝莓原浆样品，以75℃处理20min进行灭菌。然后将样品用流动的水快速冷却，转移到PET瓶中，并保存在-80℃下以备进一步研究。HPP样品制备使用自动超高压灭菌设备进行处理。在处理之前，取50mL蓝莓原浆分别真空包装到不透光和低密度的聚乙烯袋中，然后转移到5L压力处理室中。水用作压力传递介质。将密封的样品暴露在550MPa条件下，超高压灭菌10min。在压力处理过程中，压力上升时间为5s，腔室温度为20±2℃，压力释放时间为3s。TP和HHP处理后，将所有样品以12,000g离心10分钟，并除去残留物。收集上清液装至自PET瓶中用于随后的分析。在分析之前，样品储存在-80℃。
3.样品提取流程：
将样品从-80℃冰箱中取出解冻后，涡旋10s混匀。取混匀后的样本600μL，置于2mLEP管中。加入600μL 70％甲醇内标提取液，涡旋3min。离心(12000r/min，4℃)10min。取上清液用微孔滤膜(0.22μm)过滤，保存于进样瓶中，用于检测。
4.色谱质谱采集条件：
数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(Ultra Performance LiquidChromatography，UPLC)(SHIMADZU Nexera X2,https://www.shimadzu.com.cn/)和串联质谱(Tandem mass spectrometry，MS/MS)(Applied Biosystems 4500QTRAP，http://www.appliedbiosystems.com.cn/)。
液相条件主要包括：
1)色谱柱：Agilent SB-C18 1.8μm，2.1mm*100mm；
2)流动相：A相为超纯水(加入0.1％的甲酸)，B相为乙腈(加入0.1％的甲酸)；
3)洗脱梯度：0.00min B相比例为5％，9.00min内B相比例线性增加到95％，并维持在95％1min，10.00-11.10min，B相比例降为5％，并以5％平衡至14min；
4)流速：0.35mL/min；柱温：40℃；进样量：4μL。
质谱条件主要包括：
LIT和三重四极杆(QQQ)扫描是在三重四极杆线性离子阱质谱仪(Q TRAP)，AB4500Q TRAP UPLC/MS/MS系统上获得的，该系统配备了ESI Turbo离子喷雾接口，可由Analyst1.6.3软件(AB Sciex)控制运行正负两种离子模式。ESI源操作参数如下：离子源，涡轮喷雾；源温度550℃；离子喷雾电压(IS)5500V(正离子模式)/-4500V(负离子模式)；离子源气体I(GSI)，气体II(GSII)和帘气(CUR)分别设置为50、60和25.0psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在QQQ和LIT模式下分别用10和100μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体(氮气)设置为中等。通过进一步的DP和CE优化，完成了各个MRM离子对的DP(去簇电压)和CE(碰撞能量)。根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的MRM离子对。
质控样本(QC)由样本提取物混合制备而成，用于分析样本在相同的处理方法下的重复性。在仪器分析的过程中，每10个检测分析样本中插入一个质控样本，以监测分析过程的重复性。通过对不同质控QC样本质谱检测分析的总离子流图进行重叠展示分析，可以判断代谢物提取和检测的重复性。根据QC样本质谱检测总离子流图的叠加图(总离子流图见图1)。结果显示代谢物检测总离子流的曲线重叠性高，即保留时间和峰强度均一致，表明质谱对同一样品不同时间检测时，信号稳定性较好。仪器的高稳定性为数据的重复性和可靠性提供了重要的保障，其中N代表负离子模式，P代表正离子模式。
5.数据分析
利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据，基于metware数据库，对样本的代谢物进行了质谱定性定量分析，多反应监测模式MRM代谢物检测多峰图展示了样本中能够检测到的物质，每个不同颜色的质谱峰代表检测到的一个代谢物。通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度(CPS)，用MultiaQuant软件打开样本下机质谱文件，进行色谱峰的积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积代表对应物质的相对含量，最后导出所有色谱峰面积积分数据保存。代谢物多峰检测图见图2
通过对样本(包括质控样品)进行主成分分析(PCA)，初步了解了各组样本间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小。PCA结果显示各组之间代谢组分离趋势，提示样品组间代谢组是否存在差异(总PCA得分图见图3)。其中MIX表示质控样本，PC1表示第一主成分，PC2表示第二主成分，百分比表示该主成分对数据集的解释率；图中的每个点表示一个样品，同一个组的样品使用同一种颜色表示。从PCA得分图中可以看出HPP和TP蓝莓汁样品之间存在明显差异。
然后进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)并建立回归模型，筛选差异代谢物。这一方法结合了正交信号矫正(OSC)和PLS-DA方法，能够将X矩阵信息分解成与Y相关和不相关的两类信息，通过去除不相关的差异来筛选差异变量。OPLS-DA在原始数据进行log2转换后，再进行中心化处理，公式为：
基于OPLS-DA结果，从获得的多变量分析OPLS-DA模型的变量重要性投影(VIP)可以初步筛选出不同组间差异代谢物。同时结合差异倍数值(fold change)来进一步筛选出差异代谢物。采取将fold change、OPLS-DA模型的VIP值相结合的方法来筛选差异代谢物。筛选标准为：
1)选取log2 fold change≥4的代谢物。代谢物在对照组和实验组中差异为4倍，则认为差异显著。
2)选取VIP≥1的代谢物。VIP值表示对应代谢物的组间差异在模型中各组样本分类判别中的影响强度，一般认为VIP≥1的代谢物则为差异显著。
根据OPLS-DA模型分析代谢组数据，绘制各组的得分图，进一步展示各个分组之间的差异。评价模型的预测参数有R2X，R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q2表示模型的预测能力，这三个指标越接近于1时表示模型越稳定可靠，Q2>0.5时可认为是有效的模型，Q2>0.9时为出色的模型。(见图4-图7)
基于以上模型和筛选条件，在正离子模式下获得的差异标志物为飞燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷和1,3,5-苯三酚；在负离子模式下为2-呋喃甲酸、杨梅素-3-O-阿拉伯糖苷、杨梅素-3-O-鼠李糖苷、松柏醇和芥子醇。(各差异代谢物详细信息见表一)
表一
利用上述标志物鉴别HPP和TP蓝莓汁的方法，可以是通过建立鉴别模型来进行鉴别，也可以是通过阈值来鉴别，无论何种方法，只要是以上述标志物的至少一种来鉴别HPP和TP蓝莓汁，即属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种筛选超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁差异标志物的方法，其特征在于：
①将超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁在相同的条件下进行预处理，得待测样品；利用色谱和质谱联用技术分别检测两组待测样品，获得相应的质谱谱图数据，其中，所述预处理为：将样品从-80℃冰箱中取出解冻后，涡旋10s混匀；取混匀后的样本600μL，置于2mL EP管中，加入600μL 70％甲醇内标提取液，涡旋3min；4℃下，12000r/min离心10min；取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤；
利用软件Analyst 1.6.3处理所得质谱数据，具体为：基于metware数据库，对样本的代谢物进行质谱定性定量分析；用MultiaQuant软件打开多物质提取的离子流谱图，进行色谱峰的积分和校正，获得各组蓝莓汁中各个代谢物的相对含量；
②对得到的各组蓝莓汁中各代谢物的相对含量进行主成分分析(PCA)，以初步了解各组样本之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小，主成分分析表明各组间是否存在变异度；
③对两组代谢物的相对含量数据进行正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，筛选差异标志物，OPLS-DA在原始数据进行log2转换后，再进行中心化处理，公式为：
然后利用R软件中的MetaboAnalystR包OPLSR.Anal函数进行分析，计算OPLS-DA模型；基于OPLS-DA的结果，从获得的多变量分析OPLS-DA模型的变量重要性投影(VIP)可以初步筛选出不同组间差异代谢物，筛选标准为：VIP≥1；同时结合差异倍数值(fold change)来进一步筛选出差异代谢物，筛选标准为：选取log2 fold change≥4的代谢物，筛选后所得代谢物为差异标志物；
质谱条件如下：于三重四级杆线性离子阱质谱仪AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系统上进行LIT和三重四级杆(QQQ)扫描；
在正离子模式下时，离子源气体I(GSI)，气体II(GSII)和帘气(CUR)分别设置为50、60和25psi，离子源温度为550℃，离子喷雾电压为5500V，碰撞诱导电离参数设置为高；在QQQ和LIT模式下分别用10和100μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准；QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体氮气设置为中等；
在负离子模式下时，离子源气体I(GSI)，气体II(GSII)和帘气(CUR)分别设置为50、60和25psi，离子源温度为550℃，离子喷雾电压为-4500V，碰撞诱导电离参数设置为高；在QQQ和LIT模式下分别用10和100μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准；QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体氮气设置为中等；
色谱条件如下：色谱柱为Agilent SB-C18 1.8μm，2.1mm*100mm；以流动相A和B进行梯度洗脱，流动相A相为含有0.1％甲酸的超纯水，B相为含有0.1％甲酸的乙腈，流速为0.35mL/min；柱温为40℃；进样量为4μL；洗脱梯度条件为0.00min B相比例为5％，9.00min内B相比例线性增加到95％，并维持在95％1min，10.00-11.10min，B相比例降为5％，并以5％平衡至14min；
所述蓝莓汁来源于Duke蓝莓；所述超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁差异标志物，在正离子模式下，包括：飞燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷和1,3,5-苯三酚；在负离子模式下为2-呋喃甲酸、杨梅素-3-O-阿拉伯糖苷、杨梅素-3-O-鼠李糖苷、松柏醇和芥子醇。
2.一种鉴别超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁的方法，其特征在于：利用权利要求1所述方法确定超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁的差异标志物；通过检测确定待测蓝莓汁中差异标志物的含量，将上述标志物在待测蓝莓汁中的含量代入OPLS-DA模型中进行鉴别，根据标志物的含量判断待鉴别蓝莓汁。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述OPLS-DA模型根据所述标志物在超高压处理蓝莓汁和热处理蓝莓汁中的含量构建而成。
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