CN110220965A - 一种快速鉴别反复冻融肉类的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速鉴别反复冻融肉类的方法。该方法包括待测样品的制备,MALDI‑TOF‑MS测定,数据处理及PCA分析;其中,所述MALDI‑TOF‑MS方法检测的样品m/z区间为400‑3000Da。本发明的方法能够稳定且精确的实现对反复冻融肉类的鉴别,且方法简便易于操作,结果直观。
Description
技术领域
本发明涉及肉类检测技术领域,具体涉及一种快速鉴别反复冻融肉类的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
禽畜冷冻肉是肉类产品在国内外市场营销和进出口贸易的一种重要形态,冷冻的低温条件能很好的保持肉类产品的品质,减少微生物的滋生、组织结构的变形和可溶性蛋白等的损失,保证消费者的消费安全,因此,肉类的冷冻贮藏是保证肉制品安全的关键环节。但是在实际生活中,肉品从源头到消费者需经过诸多环节,在加工、运输、贮藏、消费过程中,由于冷藏链技术不健全和操作不规范可能导致新鲜肉类在到消费者手中之前一直被迫进行着冷冻、解冻的循环过程(即反复冻融)。特别是进口肉,由于对源头监控困难,不法商家抓住商机走私“冻龄”超过几十年的“僵尸肉”也时有发生,存在诸多安全隐患。
研究表明反复冻融会促使新鲜肉制品中营养成分流失,脂肪、蛋白质、肌纤维等一系列微观结构发生生理变化,从而影响肉制品的品质特性,使肉制品的食用价值降低。肉制品中含有较多不饱和脂肪酸,受氧气、光、酶等因素影响会发生脂质自动氧化、光氧化、酶促氧化反应导致交联、羰基化或形成二硫键,生成醛类、酮类、醇类等氧化产物对肉类风味具有显著影响。特别是在反复冻融过程中,肉细胞被冰刺反复刺破,多不饱和磷脂、脑磷脂中的硬脂酸、油酸、花生四烯酸等氧化会产生异味,使得肉的鲜味降低,而酸味等异味增加,不仅影响食用甚至会对身体产生有害的影响。
目前针对冰鲜肉与冷冻肉存的分析方法,如水分、氨基酸、脂肪酸、微量元素等营养成分的测定,持水性、剪切力、PH等对肉品质影响较大指标的检测以及对菌落总数、可见光谱、近红外光谱、核磁共振和生物阻抗测量等方法来区分冰鲜肉与冷冻肉。发明人发现这些方法存在统计数据量大、操作过程繁琐、检测结果准确性仍然不高等问题,对于肉类温度和冻融变化,该类方法的分辨能力相对偏低。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱,不产生或产生较少的碎片离子,具有操作简单、方便快速、谱图直观等特点,特别适合于脂质、多肽、蛋白等生物大分子的检测,其测定质量数范围最高可达40万Da以上,且灵敏度高,分辨率高,质量准确度高。仪器由基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)两部分组成。其基本原理是将样品分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时,基质从激光中吸收能量,样品解吸附,基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离,电离的样品在电场作用下飞过真空的飞行管,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测,即通过离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来分析离子,并测得样品分子的分子量。MALDI-TOF-MS与其他技术相比有明显的优势,如样品需求量少,分析时间短,测定结果准确率高。此外MALDI-TOF-MS分析易实现高度自动化,操作简便,大大减少了人力物力资源的浪费。
发明内容
基于现有技术存在的统计数据量大、操作过程繁琐、检测结果准确性不高、识别区分度不明显等一系列现有方法技术中存在的缺陷,发明人在研究过程中发现,肉类在反复冻融过程中,肉细胞被冰刺反复刺破,在这个过程中,脂类和蛋白质分子的氧化程度随着冻融次数和时间会发生不断地细微的变化,而MALDI-TOF的谱图信息可以通过质谱峰和峰的强度准确的反应体系内多种分子的细微变化,因此,本发明的目的在于提供一种基于MALDI-TOF-MS的肉类反复冻融的检测方法,该方法操作简单、准确度高,能够准确反映肉类冻融后其脂类和蛋白质分子的细微变化,并且可通过主成分分析直观的分辨出肉类的冻融次数,使得肉制品安全可控、减少肉制品安全隐患。
具体地,本发明的技术方案如下所述:
本发明提供了一种快速鉴别反复冻融肉类的方法,所述方法包括待测样品的制备,MALDI-TOF-MS测定,数据处理及主成分分析(Principal Component Analysis,PCA);其中,所述MALDI-TOF-MS方法检测的样品m/z区间为400-3000Da。
在本发明的实施方式中,本发明提供了一种冻融设计方法,该方法包括:将待检测肉品于无菌条件下去除筋膜后分组进行冻融,依据冻融次数进行分组,分组情况包括:冻融0次,将肉冷冻不再移出;冻融1次,将肉冷冻后解冻;冻融2次,重复冻融1次的步骤2次;依此类推,获得多组不同冻融次数的冻融肉样。每组的冷冻条件以及解冻条件均相同。
在本发明的一个实施方式中,所述冻融设计方法包括:取待检测肉品在无菌条件下去除筋膜后均分组并编号,每组均分为10份,第1组,冻融0次,将肉放于-20℃冷冻不再移出;第2组,冻融1次,将肉放于-20℃冷冻12小时,然后于4℃冷藏室解冻12小时后至肉块中心温度达0-4℃;第3组,冻融2次(重复第2组步骤2次);第4组,冻融3次(重复第2组步骤3次),依此类推,可获得多组不同冻融次数的冻融肉样。
本发明所述的待测肉样包括待检测的肉品、及待检测肉品经过冻融设计得到的各组冻融肉样。其中,在本发明的方法中,待检测肉品经过冻融设计得到的各组冻融肉样作为对照。
在本发明的实施方式中,所述待测样品的制备包括:取待测肉样搅碎后提取制备样品提取液,其中,所述提取溶剂为氯仿和甲醇的混合溶剂,两者的体积比为2:1。发明人在实验过程中,对多种溶剂进行过筛选,比如甲醇、乙醚、氯仿、石油醚等,然而,其提取效果均不理想。
在本发明的实施方式中,所述待测样品的提取在超声下进行,超声时间为10-50min、优选30min,静置后取下层提取液作为待测样品备用。
在本发明的实施方式中,所述待测样品进行MALDI-TOF-MS测定前需进行点样操作,点样操作包括:取待测样品滴加到MALDI靶板上,风干;将基质溶液滴加到风干的待测样品层上,待溶剂挥发基质形成结晶,将MALDI靶板放置到质谱仪中进行MALDI-TOF-MS测定。
在本发明的实施方式中,所述基质溶液为2,5-二羟基苯甲酸溶液(DHB)与选自丙酮、乙腈和水中的一种或多种组成的混合溶液。
其中,所述2,5-二羟基苯甲酸溶液的浓度为10-200mg/mL,优选为50-100mg/mL,进一步优选为100mg/mL。
在本发明的实施方式中,所述基质溶液为2,5-二羟基苯甲酸溶液与丙酮组成的混合溶液或者2,5-二羟基苯甲酸溶液与乙腈和水的二元混合液组成的混合溶液;其中,乙腈和水的二元混合液中,水的体积百分含量为50-70%。
在本发明的实施方式中,待测样品的滴加量为0.5-2μL,优选为0.5-1μL,进一步为1mL;基质溶液的滴加量为0.5-2μL,优选为0.5-1μL,进一步为1μL。
在本发明的实施方式中,所述对待测样品进行MALDI-TOF-MS测定获取质谱图,质谱条件为:极性:正极;激光波长:355nm;激光能量:80%-100%;采用反射模式;采样率:1.25GS s-1;加速电位:±20kV,真空压力:3-5×10-7mbar;脉冲离子提取延迟:100ns;检测质量区间:400-3000Da。所述质谱仪为Bruker RapifleX MALDI Tissuetyper system或宽谱定量飞行时间质谱仪(QuanTOF)。
在本发明的实施方式中,所述数据处理包括将MALDI-TOF-MS测定获取的质谱图数值化得到对应的质谱图数据,对质谱图数据进行预处理后进行PCA分析,获取PCA分析图。
PCA分析法是多元统计分析方法中一种最主要的分析方法,能够将多个变量通过比较转化为少数几个主要变量,既能不损失样本特征值的数量和信息,又能够将原来多维的数据用几个主成分来描述,在起到降维作用的同时,还可简化繁多的求解目标,使问题变得简单、直观。本发明即是通过PCA统计学方法,归纳并具象出不同冻融次数肉样品质谱峰强度的分布特征,进而鉴别是否是反复冻融肉。PCA方法作为一种常用的统计方法,是一种已有的数据处理技术,已经得到广泛的应用,常用的统计软件,如Matlab、SPSS和SIMCA都能进行PCA计算,比如,PCA分析结果可应用SIMCA 14.0软件进行PCA计算得到,具体的,比如将MALDI-TOF-MS检测得到的质谱图数值化后的分子量及质谱峰强度输入软件,即可计算得到PCA分析图。
在本发明的实施方式中,PCA分析图中会反映出待检测的肉品、以及待检测的肉品经冻融设计后的各组冻融肉样的冻融次数的聚类情况。其中,冻融肉样的PCA分析图的示例可如图1或图2所示。相同冻融次数的待测样品会聚集分布在相同的椭圆置信区间内,不同冻融次数的待测样品的椭圆置信区间相距较远、区分度高,能够通过肉眼进行分辨,说明本发明能够较好的通过PCA分析图的方式直观的反应出肉类的冻融次数,且不同冻融次数的肉品能明显进行区分。此外,未经冻融设计的待检测的肉品在PCA分析图中会聚类出现在与其冻融次数(或冻融时间)接近的冻融肉样的椭圆置信区间附近,此处所述的附近可以理解为椭圆置信区间彼此相邻或者彼此出现交叠,举例而言,比如待检测的肉品在靠近冻融4次的冻融肉样的椭圆置信区间内聚集或部分在其椭圆置信区间内聚集,则可初步判断该待检测的肉品是经反复冻融的。基于此,本发明的方法可以简单直接的预估出待测肉品的冻融情况,从而快速判断肉类是否是反复冻融肉。
此外,需要说明的是,MALDI-TOF-MS特别适合于脂质、多肽、蛋白等生物大分子的检测,其测定质量数范围最高可达40万Da以上,当使用该方法测量小分子物质时,尤其当检测的分子的m/z<1000时,容易产生严重的基质背景干扰,从而影响谱图的稳定性和可辨识度,因而本领域技术人员并不倾向于使用该方法测量小分子物质,或者即便使用该方法测量小分子物质,往往也会选用纳米材料作为基质或倾向于开发新的基质使用,而不会选择小分子的传统基质,从而以期能够规避或极大程度的减小上述不足之处。然而,在本发明的方法中,采用MALDI-TOF-MS检测小分子脂类物质(本发明检测的主要是肉类,其主要成分为油脂,检测m/z范围为400-3000Da),基于本发明整体的设计,不仅避免了上述缺陷的产生,而且,本发明的方法能够稳定且精确的实现对反复冻融肉类的鉴别,且方法简便易于操作,结果直观。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1为实施例1中不同冻融次数的B国进口牛肉PCA分析图。
图2为实施例2中不同冻融次数的A国进口牛肉PCA分析图。
图3为实施例3中不同冻融次数的C国进口牛肉PCA分析图。
图4为实施例1中不同冻融次数的A国进口牛肉叠加质谱图。
图5为实施例2中不同冻融次数的B国进口牛肉叠加质谱图。
图6为实施例3中不同冻融次数的C国进口牛肉叠加质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得,如无特殊说明,本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1 A国进口牛肉的检测
1、冻融设计:将待检测的A国进口上脑牛肉块于无菌条件下去除筋膜后均分为4组并编号,每组均分为10份,第1组,冻融0次,将肉放于-20℃冷冻不再移出。第2组,冻融1次,即将肉放于-20℃冷冻12小时,然后于4℃冷藏室解冻12小时至肉块中心温度达0-4℃。第3组,冻融2次(重复第2组步骤2次)。第4组,冻融3次(重复第2组步骤3次)。
2、肉样品提取液的制备:
取经冻融设计后的4组A国上脑牛肉块于绞肉机中搅碎,准确称取2g于10毫升离心管中,加入3毫升氯仿/甲醇(2:1,v/v)混合液,震荡混匀后超声提取30分钟,静置,取下层提取液即为样品提取液。
3、MALDI-TOF-MS测定
取1微升牛肉样品提取液滴加到MALDI靶板上,待样品风干;
将1微升基质溶液(100mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸的乙腈/水溶液,其中,水/乙腈=5:5,v/v)滴加到风干的样品提取液层上,待溶剂(乙腈/水)挥发基质形成结晶。
将MALDI靶板放置到质谱仪中,通过MALDI-TOF-MS方法获得A国上脑牛肉块样品的质谱图;其中,质谱条件为:极性:正极;激光波长:355nm;激光能量:80%-100%;采用反射模式;采样率:1.25GS s-1;加速电位:±20kV,真空压力:3-5×10-7mbar;脉冲离子提取延迟:100ns;检测质量区间:400-3000Da。质谱仪为Bruker rapifleX MALDI Tissuetypersystem。
4、鉴别结果:
将MALDI-TOF-MS得到的不同冻融次数的牛肉样品的质谱图(4组冻融样品的叠加质谱图如图4所示)经预处理数值化为分子量和峰强度后导入SIMCA14.0软件进行PCA分析,结果如图1所示,表明冻融0次的牛肉的椭圆置信区间能明显的与反复冻融的A国进口牛肉区分开,PCA分类结果能将不同冻融次数的肉区分开,区分结果准确率较高。
实施例2 B国进口牛肉的检测
1、冻融设计:将待检测的B国进口牛里脊于无菌条件下去除筋膜后均分为4组并编号,每组均分为10份,第1组,冻融0次,将肉放于-20℃冷冻不再移出。第2组,冻融1次,即将肉放于-20℃冷冻12小时,然后于4℃冷藏室解冻12小时至肉块中心温度达0-4℃。第3组,冻融2次(重复第2组步骤2次)。第4组,冻融3次(重复第2组步骤3次)。
2、肉样品提取液的制备:
取经冻融设计后的4组B国牛里脊于绞肉机中搅碎,准确称取2g于10毫升离心管中,加入3毫升氯仿/甲醇(2:1,v/v)混合液,震荡混匀后超声提取30分钟,静置,取下层提取液即为样品提取液。
3、MALDI-TOF-MS测定
取1微升牛肉样品提取液滴加到MALDI靶板上,待样品风干;
将1微升基质溶液(100mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸的乙腈/水溶液,其中,水/乙腈=7:3,v/v)滴加到风干的样品提取液层上,待溶剂(乙腈/水)挥发基质形成结晶。
将MALDI靶板放置到质谱仪中,通过MALDI-TOF-MS方法获得A国上脑牛肉块样品的质谱图;其中,质谱条件为:极性:正极;激光波长:355nm;激光能量:80%-100%;采用反射模式;采样率:1.25GS s-1;加速电位:±20kV,真空压力:3-5×10-7mbar;脉冲离子提取延迟:100ns;检测质量区间:400-3000Da。质谱仪为Bruker rapifleX MALDI Tissuetypersystem。
4、鉴别结果:
将MALDI-TOF-MS得到的不同冻融次数的牛肉样品的质谱图(4组冻融样品的叠加质谱图如图5所示)经预处理数值化为分子量和峰强度后导入SIMCA14.0软件进行PCA分析,结果如图2所示,表明冻融0次的牛肉的椭圆置信区间能明显的与反复冻融的B国进口牛肉区分开,PCA分类结果能将不同冻融次数的肉区分开,区分结果准确率较高。
实施例3 C国进口牛肉的鉴别
1、冻融设计:将待检测的C国进口牛肉于无菌条件下去除筋膜后均分为4组并编号,每组均分为10份,第1组,冻融0次,将肉放于-20℃冷冻不再移出。第2组,冻融1次,即将肉放于-20℃冷冻12小时,然后于4℃冷藏室解冻12小时至肉块中心温度达0-4℃。第3组,冻融2次(重复第2组步骤2次)。第4组,冻融3次(重复第2组步骤3次)。
2、肉样品提取液的制备:
取经冻融设计后的4组C国进口牛肉(均称为冻融样品)与未经冻融设计的同批次C国进口牛肉(简称为待测样品)于绞肉机中搅碎,准确称取2g于10毫升离心管中,加入3毫升氯仿/甲醇(2:1,v/v)混合液,震荡混匀后超声提取30分钟,静置,取下层提取液即为样品提取液。
3、MALDI-TOF-MS测定
取1微升牛肉样品提取液滴加到MALDI靶板上,待样品风干;
将1微升基质溶液(100mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸的乙腈/水溶液,其中,水/乙腈=7:3,v/v)滴加到风干的样品提取液层上,待溶剂(乙腈/水)挥发基质形成结晶。
将MALDI靶板放置到质谱仪中,通过MALDI-TOF-MS方法获得A国上脑牛肉块样品的质谱图;其中,质谱条件为:极性:正极;激光波长:355nm;激光能量:80%-100%;采用反射模式;采样率:1.25GS s-1;加速电位:±20kV,真空压力:3-5×10-7mbar;脉冲离子提取延迟:100ns;检测质量区间:400-3000Da。质谱仪为Bruker rapifleX MALDI Tissuetypersystem。。
4、鉴别结果:
将MALDI-TOF-MS得到的4组经冻融设计的冻融样品及待测样品的质谱图(其叠加质谱图如图6所示)经预处理数值化为分子量和峰强度后导入SIMCA14.0软件进行PCA分析,结果如图3所示,表明冻融0次的牛肉的椭圆置信区间能明显的与反复冻融的C国进口牛肉区分开,PCA分类结果能将不同冻融次数的肉区分开,区分结果准确率较高,待测样品(在图3中以五角星形状表示)与冻融3次的冻融样品的椭圆置信区间存在交叠,结果表明该C国进口牛肉为反复冻融肉。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种快速鉴别反复冻融肉类的方法,所述方法包括待测样品的制备,MALDI-TOF-MS测定,数据处理及PCA分析;其中,所述MALDI-TOF-MS方法检测的样品m/z区间为400-3000Da。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述待测样品的制备包括对待测样品进行冻融设计,所述冻融设计包括:将待检测肉品于无菌条件下去除筋膜后分组进行冻融,分组情况包括:冻融0次,将肉冷冻不再移出;冻融1次,将肉冷冻后解冻;冻融2次,重复冻融1次的步骤2次,依此类推,获得多组不同冻融次数的冻融肉样。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,取待测肉样和/或冻融肉样搅碎后提取制备样品提取液,其中,所述提取溶剂为氯仿和甲醇的混合溶剂,两者的体积比为2:1。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述待测样品的提取在超声下进行,超声时间为10-50min、优选30min,静置后取下层提取液作为待测样品备用。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述待测样品进行MALDI-TOF-MS测定前需进行点样操作,点样操作包括:取待测样品滴加到MALDI靶板上,风干;将基质溶液滴加到风干的待测样品层上,待溶剂挥发基质形成结晶,将MALDI靶板放置到质谱仪中进行MALDI-TOF-MS测定。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述基质溶液为2,5-二羟基苯甲酸溶液与选自丙酮、乙腈和水中的一种或多种组成的混合溶液;
优选地,所述2,5-二羟基苯甲酸溶液的浓度为10-200mg/mL,优选为50-100mg/mL,进一步优选为100mg/mL;
优选地,所述基质溶液为2,5-二羟基苯甲酸溶液与丙酮组成的混合溶液或者2,5-二羟基苯甲酸溶液与乙腈和水的二元混合液组成的混合溶液;
优选地,乙腈和水的二元混合液中,水的体积百分含量为50-70%。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,待测样品的滴加量为0.5-2mL,优选为0.5-1mL,进一步为1mL;
优选地,基质溶液的滴加量为0.5-2mL,优选为0.5-1mL,进一步为1mL。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述MALDI-TOF-MS测定的质谱条件为:
极性:正极;激光波长:355nm;激光能量:80%-100%;采用反射模式;采样率:1.25 GSs-1;加速电位:±20kV,真空压力:3-5×10-7mbar;脉冲离子提取延迟:100ns;检测质量区间:400-3000Da;
优选地,所述质谱仪为Bruker rapifleX MALDI Tissuetyper system或宽谱定量飞行时间质谱QuanTOF。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述数据处理包括将MALDI-TOF-MS测定获取的质谱图数值化得到对应的质谱图数据,对质谱图数据进行预处理后进行PCA分析,获取PCA分析图。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法包括根据PCA分析图判断待测样品是否为反复冻融肉。
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