CN112986422A - 鉴别新鲜肉类和反复冻融肉类的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别新鲜肉类和反复冻融肉类的方法。根据本发明的实施例,该方法包括:将待测肉类进行均质提取,离心,以便得到上清液;以及利用色谱‑质谱联用系统对所述上清液进行检测,基于标志物,确定所述待测肉类是新鲜肉类还是反复冻融肉类。该方法采用色谱‑质谱联用系统对肉类进行分析,不仅检测准确性高、检测快速简便,而且能够基于检测成分的变化,获得在某些冻融条件下,对微观结构的破坏作用。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域,具体地,涉及鉴别新鲜肉类和反复冻融肉类的方法。
背景技术
随着快捷的交付系统的发展,人类社会已经进入全球食品采购时代。全球贸易对保证食品安全和质量提出了许多挑战,尤其是鲜肉产品。鲜肉产品交付链中涉及的主要问题之一是在运输过程中对储存条件的不连续控制。非标准操作引起的温度波动可能会导致肉类产品反复冻融。反复冻融会使水份重新分配,并影响肌肉组织中冰晶的大小和分布,细胞冰晶的形成将引起严重的肌肉组织机械损伤,并加速脂质氧化和蛋白质变性。因此反复冻融不利于肌肉的理化性质和质地,例如汁液损失增加,嫩度降低,风味变差。在市场上新鲜牛肉的价格高于冷冻牛肉,使得部分不法商贩用冻融牛肉冒充新鲜牛肉,从中获取非法利益且存在安全隐患。消费者从感官上很难鉴别新鲜牛肉和冻融牛肉。
新鲜肉与冻融肉鉴别的分析方法主要包括酶法,DNA法,光谱技术,生物成像和感官方法。酶法主要是利用检测释放的酶以达到区别新鲜和冻融肉的目的,β-hydroxyacyl-Coenzyme A-hydrogenase(HADH)法是广泛应用的方法,该法主要利用了冻肉中线粒体的裂解,但HADH的释放需要冻藏温度达到-12℃或者更低。DNA分子由于核酸内切酶、核酸外切酶、水解、氧化和烷基化反应而被降解。研究证实,通过彗星实验研究DNA损伤,能够发现:在6次冻融过程和-20℃储藏60天的样本中DNA损伤增加,但是在第30天时DNA损伤并未减少。但将同一来源的新鲜肉和解冻肉进行比较,可以发现一些区别。其颜色和水分布变化可以通过光谱方法进行监测,包括可见光近红外(NIR)光谱和核磁共振(NMR)。尽管光谱法在现场分析中具有巨大潜力,但对模型的全面验证参数较复杂,例如动物年龄,繁殖模式,组织类型等。生物成像方法取决于肉在冻融条件下微观结构恶化程度。这种方法的主要缺点是,在某些冻融条件下,未观察到对微观结构的明显结构破坏。
由此,鉴别新鲜肉类和反复冻融肉类的方法有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明的一个目的在于提出一种鉴别新鲜肉类和反复冻融肉类的方法,具有准确性高、检测快速简便的优点。
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种鉴别新鲜肉类和反复冻融肉类的方法。根据本发明的实施例,该方法包括:将待测肉类进行均质提取,离心,以便得到上清液;以及利用色谱-质谱联用系统对所述上清液进行检测,基于标志物,确定所述待测肉类是新鲜肉类还是反复冻融肉类。
根据本发明实施例的鉴别新鲜肉类和反复冻融肉类的方法,采用色谱-质谱联用系统对肉类进行分析,不仅检测准确性高、检测快速简便,而且能够基于检测成分的变化,获得在某些冻融条件下,对微观结构的破坏作用。
另外,根据本发明上述实施例的鉴别新鲜肉类和反复冻融肉类的方法,还可以具有如下附加的技术特征:
根据本发明的实施例,所述均质提取是利用90体积%甲醇溶液进行的。
根据本发明的实施例,所述待测肉类与所述90体积%甲醇溶液的比例为1g:7-12mL。
根据本发明的实施例,所述色谱-质谱联用系统为超高效液相色谱-高分辨质谱系统。
根据本发明的实施例,所述色谱-质谱联用系统的色谱条件为:色谱柱为C18色谱柱,规格为3.0mm×100mm×1.7μm;柱温:40℃;流速:0.3mL min-1;进样量:5μL,自动进样器温度为4℃。
根据本发明的实施例,所述色谱-质谱联用系统的色谱流动相:A:含0.1%甲酸的甲醇,B:含0.1%甲酸的水。
根据本发明的实施例,所述色谱的梯度洗脱条件:0-0.5min,0-5.0%A;0.5-2.5min,5.0%A;2.5-4.5min,5-40.0%A;4.5-10min,70%-0A;10-12min,0-5%A;12-15min,5.0%A。
根据本发明的实施例,所述色谱-质谱联用系统的质谱条件为:正、负模式下全扫描和MS/MS扫描的分辨率分别为70,000FWHM和17,500FWHM;离子源:HESI源;离子源参数:离子传输管温度350℃;喷雾电压:3.6kV;鞘气流速:40Arb;辅助气流速:10Arb;扫描范围为70-1000m/z。
根据本发明的实施例,所述肉类为牛肉。
根据本发明的实施例,所述标志物为选自乳酸、烟酸和酪胺中的至少一种。
根据本发明的实施例,利用主成分分析模型,所述检测的数据进行分析,基于样本分组的聚集程度,确认上述待测肉类是否冻融肉类。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了根据本发明一个实施例的新鲜与不同冻融次数牛肉正、负模式下的总离子流示意图,其中,A为正离子模式,B为负离子模式;
图2显示了根据本发明一个实施例的新鲜与不同冻融次数牛肉PCA示意图;
图3显示了根据本发明另一个实施例的新鲜与不同冻融次数牛肉PCA示意图;
图4显示了根据本发明另一个实施例的标志物变化趋势示意图,其中,A为乳酸,B为烟酸,C为酪胺。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种鉴别新鲜肉类和反复冻融肉类的方法。根据本发明的实施例,该方法包括:将待测肉类进行均质提取,离心,以便得到上清液;以及利用色谱-质谱联用系统对所述上清液进行检测,基于标志物,确定所述待测肉类是新鲜肉类还是反复冻融肉类。
根据本发明实施例的鉴别新鲜肉类和反复冻融肉类的方法,采用色谱-质谱联用系统对肉类进行分析,不仅检测准确性高、检测快速简便,而且能够基于检测成分的变化,获得在某些冻融条件下,对微观结构的破坏作用。
化学计量学针对海量数据挖掘与处理、分析信号的提取和分析方面提供了强大的手段,解决了食品分析中现代仪器数据多维化、复杂化的难题。超高效液相色谱-串联高分辨质谱具有样本预处理简单、数据量丰富、良好的选择性、灵敏度高等优点。发明人采用超高效液相色谱-串联高分辨质谱对牛肉进行分析,并结合化学计量学方法筛选出牛肉在反复冻融过程中潜在的差异标志物,从而获得本发明实施例的快速、简便的新鲜和冻融牛肉识别方法。
由于甲醇价格便宜、离子化效率高、酸碱调节剂溶解性好、通用性强。根据本发明的实施例,该均质提取是利用90体积%甲醇溶液进行的。
根据本发明的实施例,该待测肉类与90体积%甲醇溶液的比例为1g:7-12mL。由此,有利于充分提取肉类中的待测化合物。
根据本发明的实施例,该色谱-质谱联用系统为超高效液相色谱-高分辨质谱系统。由此,样本预处理简单、数据量丰富、具有良好的选择性、灵敏度高等优点。
根据本发明的实施例,该色谱-质谱联用系统的色谱条件为:色谱柱为C18色谱柱,规格为3.0mm×100mm×1.7μm;柱温:40℃;流速:0.3mL min-1;进样量:5μL,自动进样器温度为4℃。由此,有利于充分分离待测化合物,色谱峰峰型好。
根据本发明的实施例,该色谱-质谱联用系统的色谱流动相:A:含0.1%甲酸的甲醇,B:含0.1%甲酸的水。由此,有利于充分分离待测化合物,检测结果准确性和灵敏性高。
根据本发明的实施例,所述色谱的梯度洗脱条件:0-0.5min,0-5.0%A;0.5-2.5min,5.0%A;2.5-4.5min,5-40.0%A;4.5-10min,70%-0A;10-12min,0-5%A;12-15min,5.0%A。由此,有利于充分分离待测化合物,检测结果准确性和灵敏性高。
根据本发明的实施例,所述色谱-质谱联用系统的质谱条件为:正、负模式下全扫描和MS/MS扫描的分辨率分别为70,000FWHM和17,500FWHM;离子源:HESI源;离子源参数:离子传输管温度350℃;喷雾电压:3.6kV;鞘气流速:40Arb;辅助气流速:10Arb;扫描范围为70-1000m/z。在上述条件下,质谱首先采集样品的全扫描谱图,并按照自动触发做全扫描谱中前N强母离子的二级质谱,保证了数据的充分性。
根据本发明的实施例,该肉类为牛肉。根据本发明的实施例,该标志物为选自乳酸、烟酸和酪胺中的至少一种。其中,上述标志物在新鲜和不同冻融次数肉类的含量变化示意图如图4所示,乳酸含量在新鲜到冻融1次期间呈上升趋势,可能是刚屠宰后牛肉的肌细胞尚未死亡,只能进行无氧呼吸,从而造成大量乳酸的生成。从冻融2次到冻融5次乳酸含量逐渐下降,可能是因为糖原酵解酶活性降低,导致了乳酸生成速率小于乳酸降解的速率。烟酸和酪胺在新鲜中含量最低,随着冻融次数的增加含量逐渐上升。具体地,基于正交偏最小二乘分析的分析模型,选取VIP>1及P<0.05为差异标志物的筛选条件。
根据本发明的实施例,利用主成分分析模型,对该检测的数据进行分析,基于样本分组的聚集程度,确认上述待测肉类是否冻融肉类。具体地,新鲜肉类和不同冻融次数的肉类的检测数据聚集程度不同。通过待测肉类数据与上述肉类的聚集程度,选择聚集程度最近的,则为该冻融次数的肉类或新鲜肉类。
为了便于理解本发明实施例的鉴别新鲜肉类和反复冻融肉类的方法,在此提供一种基于超高效液相色谱-串联高分辨质谱结合化学计量学鉴别新鲜肉类和反复冻融肉类的一般方法,该方法包括如下步骤:
(1)准备牛肉样本并编号,具体分为新鲜肉和冻融肉;
(2)通过超高效液相色谱-串联高分辨质谱对步骤(1)中的牛肉样本进行质谱数据采集;
(3)对步骤(2)中采集的质谱数据进行化学计量学分析,并建立多元统计分析模型,所述多元统计分析模型包括主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),通过所述PCA判断新鲜组与不同冻融次数组牛肉样品是否存在差异,通过OPLS-DA确定所述新鲜和冻融牛肉样品的潜在的差异标志物;
(4)利用筛选出的差异标志物对所测样品进行鉴别,基于所述待测肉类与所建模型样本分组的聚集程度,确认上述待测肉类是否冻融肉类。
其中对上述步骤(2)采集的质谱数据进行预处理,使用Xcalibur 3.0对原始数据进行峰检测、峰比对、峰面积归一化和过滤等操作。
其中上述步骤(3)利用主成分分析对新鲜和不同冻融次数牛肉的数据进行降维处理,先建立主成分分析模型再优化主成分个数。上述正交偏最小二乘判别分析模型个数为2,分别由新鲜组与冻融循环3次组、冻融循环5次组建立。选取变量重要性VIP>1及T检验显著水平P<0.05为筛选潜在差异标志物条件。
下面参考具体实施例,对本发明进行说明,需要说明的是,这些实施例仅仅是说明性的,而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品,例如可以采购自Sigma公司。
实施例1
利用本发明实施例的方法,检测新鲜牛肉和反复冻融牛肉的差异标志物,具体方法如下:
1.1试剂与仪器
Q-Exactive-Ultimate 3000超高效液相色谱-质谱仪(美国Thermo Fisher公司);分离色谱柱为C18色谱柱(ACQUITY UPLC BEH C18(3.0mm×100mm,1.7μm));均质器(德国IKA公司);高速离心机(美国Beckman Coulter公司);涡旋混匀器(美国ScientificInstruments公司)。
甲醇(色谱纯,美国Thermo Fisher公司);甲酸(色谱级,北京百灵威科技有限公司);实验用水由Milli-Q超纯水系统制备。
1.2样本的采集与制备
1.2.1样本采集
从当地牛肉交易市场购买新鲜的牛背最长肌,于实验室进行分割,去除脂肪和结缔组织后置于聚乙烯自封袋中,随后于-20℃冰箱储存。新鲜肉不做冻融处理。
1.2.2冻融牛肉制备
将牛肉在-20℃条件下冷冻72小时,随后转移到4℃冰箱中解冻12小时为1次冻融循环,本实验一共做了5次冻融循环。每次冻融循环精确称量3g牛肉并制备8个平行样本,使用30ml(甲醇/水,9:1)进行均质提取,均质5mins,转速8000rpm。均质后离心15mins,转速10000rpm,离心后取上清液2ml再次离心15mins,转速14000rpm。之后过0.22μm微孔滤膜保存在进样小瓶中,所有的样本均储存在-80℃冰箱中集中进样。
1.3色谱与质谱工作条件
色谱条件:柱温40℃;流速0.3mL min-1;流动相组成A:甲醇(0.1%甲酸),B:水(0.1%甲酸);进样量为5μL,自动进样器温度为4℃。梯度洗脱条件:0min,5.0%A;0.5min,5.0%A;2.5min,40.0%A;4.5min,70.0%A;10min,0A;12min,5.0%A;15min,5.0%A。
质谱条件:正、负模式下全扫描和MS/MS扫描的分辨率分别为70,000FWHM和17,500FWHM;离子源:HESI源;离子源参数:离子传输管温度350℃;喷雾电压:3.6kV;鞘气流速:40Arb;辅助气流速:10Arb;扫描范围为70-1000m/z。
1.4数据处理和差异标志物的鉴定
使用Xcalibur 3.0对原始数据进行峰检测、峰比对、峰面积归一化和过滤等操作。将处理后的数据导入Compound Discoverer 3.1软件进行保留时间和质荷比的校正,保留时间偏差设置为12s,质量偏差为5ppm。选取响应强度大于100000的峰,搜索mz cloud数据库进行化合物的对比。使用空白样本(甲醇:水(9:1))去除背景离子,QC样本用作归一化。从Compound Discoverer 3.1软件鉴定的结果中筛选P<0.05的化合物导入Simca-P(14.1)进行多元统计分析。PCA和OPLS-DA用来揭示不同冻融次数组与新鲜组代谢轮廓的变化,相应的变量重要性(Variable importance in the projection,VIP)通过OPLS-DA模型计算出来,选取VIP>1及P<0.05为筛选差异标志物条件。
2结果与讨论
2.1不同冻融次数牛肉与新鲜牛肉代谢轮廓分析
通过高通量、高灵敏度的UPLC-MS技术同时对正、负离子模式下的新鲜牛肉和冻融1次、冻融2次、冻融3次、冻融4次、冻融5次的牛肉进行数据采集,生成色谱图,如图1所示,结果表明新鲜组与不同冻融次数组的牛肉在正、负离子模式下的色谱图存在明显差异。
2.2主成分分析
主成分模型选择了前10个主要成分,解释了总方差(R2)的70.9%,其预测能力(Q2)为52.1%。主成分分析表明,新鲜牛肉的检测数据相互聚集,不同冻融次数的牛肉数据也各自相互聚集,新鲜组与不同冻融次数的组可以区分开,区分程度随冻融次数的增多而升高。此外,如图2所示,QC样本在PCA分数图上具有较好的聚集,表明在分析过程中仪器设备是稳定,数据是可靠的。从相同的市场中购买同一部位的牛肉,采用相同的前处理步骤,色谱与质谱条件,采集质谱数据,进行峰检测、峰比对、峰面积归一化和过滤等操作。将预处理好的数据导入PCA模型中,如图3所示,与冻融4次组有较好的聚集,判断待测样本为冻融肉。
2.3正交偏最小二乘判别分析
为了确定新鲜和不同冻融次数牛肉样本中代谢物之间的差异及变化趋势,分别选用新鲜组、冻融3次组和冻融5次组建立两个二元OPLS-DA模型。OPLS-DA用于两组之间的对比,R2Y(cum)代表模型对Y变量的解释性,Q2代表模型的预测能力。根据表1说明,所建立的两个OPLS-DA模型具有良好的预测能力。
表1不同冻融次数组与新鲜组OPLS-DA模型的R2、Q2
2.4差异标志物的鉴定与筛选
通常认为OPLS-DA模型计算的VIP及单变量分析P值为选取化合物的指标,选取VIP>1及P<0.05为筛选差异标志物条件。最终差异标志物为新鲜组与冻融3次组、新鲜组与冻融5次组所选出标志物中相同的化合物。初步筛选出11种潜在的差异标志物(表2),其中乳酸与肉的嫩度相关,烟酸与肉色相关,酪胺与人体健康相关,最终确定了乳酸、烟酸和酪胺为差异标志物。
表2新鲜和不同冻融次数牛肉差异标志物VIP和P值
实施例2
从相同的市场中购买同一部位的牛肉,采用实施例1的前处理步骤,色谱与质谱条件,采集质谱数据,进行峰检测、峰比对、峰面积归一化和过滤等操作。将预处理好的数据导入实施例1构建的PCA模型中,结果如图3所示,表明与冻融4次组有较好的聚集,判断该待测样本为冻融肉,可能冻融4次。
综上所述,本发明实施例的方法为鉴别新鲜和反复冻融肉类提供了一种稳定、可靠、快速的方法,与其他方法相比较,该方法样品预处理简单、数据量丰富、具有选择性好、灵敏度高等优点,通过多元统计模型筛选差异标志物能够实现对新鲜和反复冻融肉类的快速判别。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种鉴别新鲜肉类和反复冻融肉类的方法,其特征在于,包括:
将待测肉类进行均质提取,离心,以便得到上清液;以及
利用色谱-质谱联用系统对所述上清液进行检测,基于标志物,确定所述待测肉类是新鲜肉类还是反复冻融肉类。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述均质提取是利用90体积%甲醇溶液进行的。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述待测肉类与所述90体积%甲醇溶液的比例为1g:7-12mL。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述色谱-质谱联用系统为超高效液相色谱-高分辨质谱系统。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述色谱-质谱联用系统的色谱条件为:
色谱柱为C18色谱柱,规格为3.0mm×100mm×1.7μm;
柱温:40℃;
流速:0.3mL min-1;
进样量:5μL,自动进样器温度为4℃。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述色谱-质谱联用系统的色谱流动相:A:含0.1%甲酸的甲醇,B:含0.1%甲酸的水,
任选地,所述色谱的梯度洗脱条件:0-0.5min,0-5.0%A;0.5-2.5min,5.0%A;2.5-4.5min,5-40.0%A;4.5-10min,70%-0A;10-12min,0-5%A;12-15min,5.0%A。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述色谱-质谱联用系统的质谱条件为:
正、负模式下全扫描和MS/MS扫描的分辨率分别为70,000FWHM和17,500FWHM;
离子源:HESI源;
离子源参数:离子传输管温度350℃;
喷雾电压:3.6kV;
鞘气流速:40Arb;
辅助气流速:10Arb;
扫描范围为70-1000m/z。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述肉类为牛肉。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述标志物为选自乳酸、烟酸和酪胺中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,利用主成分分析模型,对所述检测的数据进行分析,基于样本分组的聚集程度,确认上述待测肉类是否冻融肉类。
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CN112986422B (zh) | 2023-02-17 |
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