CN113866333A - 一种鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉的方法，包括市售冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉产品收集，代谢物提取，采用LC‑QTOF MS仪器进行样品的代物数据采集、不同性别、日龄和储存期的冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉差异代谢物筛选，及PLS‑DA判别模型的建立。主要通过对鸡肉样品的提取，上机检测，代谢组学数据分析，建立正交偏最小二乘回归分析(OPLS‑R)模型，确定冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉的差异代谢物，建立判别模型，用于鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉，有效识别冷冻鸡肉冒充冰鲜鸡肉的掺假问题。

Description

一种鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉的方法
技术领域
本发明涉及冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉鉴别技术领域，尤其涉及一种鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉的方法。
背景技术
食品欺诈是指蓄意对食品进行虚假描述、造成该食品的宣称与其真实属性不符的行为，经济利益驱动型掺假(economically motivated adulteration, EMA)是一种典型的食品欺诈，全球每年由于食品欺诈带来的直接经济损失高达100～150亿美元。其中，肉类造成的食品欺诈问题占比高达22％，因此，肉类食品欺诈问题不容忽视。
自从禽流感爆发以来，中国活禽交易已经被禁止。冰鲜鸡肉(2.8-4.44℃冷藏储存)和冷冻鸡肉(18℃或更低的冷冻储存)是市场上鸡肉的主要销售形式。冰鲜储存可以避免冰晶的形成和再结晶，保持冰鲜鸡肉原有风味和营养；而冷冻储藏中，冰晶的生成和再结晶会破坏鸡肉的微观结构，不利于鸡肉品质。但是，由于冰鲜鸡肉的保质期较短，商家常使用冷冻鸡肉冒充冰鲜鸡肉，导致EMA事件的发生。因此，亟需开发一种鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉的方法。
对于肉类真实性检测技术，目前主要有基于蛋白质的免疫学技术和蛋白质谱技术，基于DNA的PCR技术，以及基于代谢物的红外光谱、电子鼻与电子舌技术。蛋白质是肉类的主要组成部分，其氨基酸序列和三维结构具有种间差异性，DNA比蛋白质的稳定性更强，且具有更丰富的种间多态性，有利于物种鉴别。但是，目前基于蛋白质和DNA的检测技术主要应用于不同物种之间的掺假行为鉴别，而同物种内的掺假鉴别是肉类真实性检测分析的难点。
目前，我国畜牧业正在向高质量发展转型，而对应的监管体系、检测技术不够健全，从产品标准、到技术规范、再到真实性识别手段，均有缺位，因此，无法对品质优良但保质期短的冰鲜鸡肉进行保护，使得部分蓄意造假的商人有机可乘，使用品质一般但保质期长的冷冻鸡肉进行替代。该方法可以用于鉴别冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉，帮助完善肉品真实性鉴别技术体系，强化监督检查，促进产品升级。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉的方法，基于LC-QTOF-MS方法的代谢组学方案，用于鉴别冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉。主要通过对鸡肉样品的提取，上机检测，代谢组学数据分析，建立正交偏最小二乘回归分析(orthogonalpartial least squares regression analysis，OPLS-R)模型，确定冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉的差异代谢物，建立判别模型，用于鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、样品制备
收集市售冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉产品，根据性别、日龄、储存期进行分类；
b、提取不同类别鸡肉代谢物的提取液；
c、将鸡肉代谢物的提取液采用LC-QTOF MS仪器进行样品的代物数据采集，色谱为液相色谱，液相条件为：
色谱柱为C18,1.8μm,2.1×100mm；
流动相A为0.1％甲酸水，B为0.1％甲酸乙腈；
流动相洗脱梯度，0-1.00min，5％B；1.00-22.00min，52-100％B； 22.00-27.00min，100％B；27.00-27.10min，100-5％B；27.10-30.00min， 5％B；
进样量，5μL，流速，0.3mL/min，柱温，40℃；
具体的，质谱条件为：离子源为电喷雾离子源，采集模式为数据依赖型扫描，正离子模式的喷雾电压分别为5500V，去簇电压分别为80V，离子源温度500℃，雾化器压力(GS1)50psi，加热辅助气压力(GS2)50 psi，碰撞能35±15eV，数据采集范围为50-1500Da。
d、不同性别和日龄的冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉差异代谢物筛选；
e、根据差异代谢物，对不同性别、日龄和储存期冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉建立PLS-DA判别模型，对冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉样品进行判别。
具体的，在步骤b中，鸡肉代谢物提取的方法为：取不同分类的鸡肉均质100mg，加入1mL、50％的甲醇水溶液，超声10min后，16100rcf 离心20min，取上清液，通过0.22μm滤膜，得到鸡肉代谢物提取液。
具体的，在步骤d中，所述不同类别的鸡肉差异代谢物的筛选包括：
1)将原始数据导入MS-DIAL软件，进行峰对齐、峰识别等，导出所有代谢物的峰面积；
2)根据峰面积信息，删除每组样品中检出率小于80％的物质；
3)筛选t检验中P<0.05，差异倍数>2，OPLS-R模型中的VIP>1.5的物质，作为差异代谢物。
具体的，在步骤e中，根据差异代谢物，随机选择若干数量的冰鲜鸡肉和个冷冻鸡肉样本作为训练集，建立PLS-DA模型，并同时选取若干数量的冰鲜鸡肉和冷冻鸡样本作为测试集，来测试模型的判别准确度。
本发明的有益效果是：本发明对鉴别冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉提供一种鉴别方法，通过确定冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉的差异代谢物，并在其中寻找稳定的差异代谢物，作为稳定标志物，建立判别模型，用于准确快速鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉，有效识别冷冻鸡肉冒充冰鲜鸡肉的掺假问题。
附图说明
图1为本发明冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉鉴别方法流程图。
图2为本发明冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉差异代谢物检验结果图。
图3为本发明OPLS-R模型的得分图(其中C表示冰鲜鸡；F-30表示储存30天的冷冻鸡；F-180表示储存180天的冷冻鸡；F-270表示储270 天的冷冻鸡)。
图4为本发明OPLS-R模型VIP计算得到的S-plot图。
图5为本发明冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉PLS-DA判别模型图。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
本发明提供一种鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉的方法，基于LC-QTOF-MS (Liquidchromatogram time-of-flight mass spectrometry)方法的代谢组学方案，用于鉴别冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉。主要通过对鸡肉样品的提取，上机检测，代谢组学数据分析，建立正交偏最小二乘回归分析OPLS-R(orthogonal partial least squares regression analysis)模型，确定冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉的差异代谢物，建立判别模型，用于鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉。
参照附图1所示的一种鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉的方法，其具体实施方式如下：
1、样品制备
从市售样品中收集冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉(考虑性别、日龄、储存期)，样品信息见表1。
Figure RE-GDA0003366856750000051
表1冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉样本信息
2、鸡肉代谢物提取
取100mg的鸡肉，均质，加入1mL，50％的甲醇水溶液，超声10min, 16100rcf离心20min，取上清液，通过0.22μm滤膜，得到鸡肉代谢物提取液。
3、LC-QTOF MS代谢组学数据采集
1)液相条件：
色谱柱为C18,1.8μm,2.1×100mm；流动相A为0.1％甲酸水，B为0.1％甲酸乙腈；流动相洗脱梯度，0-1.00min,5％B；1.00-22.00min,52- 100％B；22.00-27.00min,100％B；27.00-27.10min,100-5％B；27.10- 30.00min,5％B；进样量，5μL，流速，0.3mL/min，柱温，40℃。
2)质谱条件：
离子源为电喷雾离子源，采集模式为数据依赖型扫描，正离子模式的喷雾电压分别为5500V，去簇电压分别为80V，离子源温度500℃，雾化器压力(GS1)50psi，加热辅助气压力(GS2)50psi，碰撞能35±15eV，数据采集范围为50-1500Da。
4、不同性别和日龄的冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉差异代谢物筛选：
1)仪器采集数据导入MS-DIAL软件，进行峰对齐，峰识别等，导出所有原始物质的峰面积；
2)根据峰面积信息，删除每组样品中检出率小于80％的物质。(“原始物质”和“预处理后的物质-筛选检出率大于80％”数据记载如表1和表2 所示)
Figure RE-GDA0003366856750000071
表1原始物质
Figure RE-GDA0003366856750000081
表2预处理后的物质-筛选检出率大于80％
3)筛选t检验中P<0.05，差异倍数>2，T检验和差异倍数检验结果如图2所示，其中T检验和差异倍数检验结果，粉色表示P<0.05以及差异倍数>2的物质。
此外，再结合OPLS-R模型中的VIP(Variables important for prediction)>1.5的物质，得到作为差异代谢物(“差异代谢物-筛选P<0.05, 差异倍数>2，VIP>1.5”记载如表3所示)，OPLS-R模型的得分图如图3所示。基于该模型可以进行VIP计算，得到S-plot图，如图4所示，其中，红色的点表示VIP值大于1.5的代谢物。
Figure RE-GDA0003366856750000091
表3差异代谢物-筛选P<0.05,差异倍数>2，VIP>1.5
5、PLS-DA判别模型的建立
根据差异代谢物，随机选择10个冰鲜鸡肉和17个冷冻鸡肉样本作为训练集，建立PLS-DA(Partial least-squares discrimination analysis)模型，剩下的5个冰鲜鸡肉和8个冷冻鸡样本作为测试集，来测试模型的判别准确度。模型的测试准确度达到91％，判别准确度达到100％，“PLS-DA模型”数据记载(如表4所示)，模型如图5所示。
Figure RE-GDA0003366856750000101
表4 PLS-DA模型
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、样品制备
收集市售冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉产品，根据性别、日龄、储存期进行分类；
b、提取不同类别鸡肉代谢物的提取液；
c、将鸡肉代谢物的提取液采用LC-QTOF MS仪器进行样品的代物数据采集，色谱为液相色谱，液相条件为：
色谱柱为C18,1.8μm,2.1×100mm；
流动相A为0.1％甲酸水，B为0.1％甲酸乙腈；
流动相洗脱梯度，0-1.00min，5％B；1.00-22.00min，52-100％B；22.00-27.00min，100％B；27.00-27.10min，100-5％B；27.10-30.00min，5％B；
进样量，5μL，流速，0.3mL/min，柱温，40℃；
d、不同性别和日龄的冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉差异代谢物筛选；
e、根据差异代谢物，对不同性别、日龄、储存期冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉建立PLS-DA判别模型，对冰鲜鸡肉和冷冻鸡肉样品进行判别。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉的方法，其特征在于：在步骤b中，鸡肉代谢物提取的方法为：取不同分类的鸡肉均质100mg，加入1mL、50％的甲醇水溶液，超声10min后，16100rcf离心20min，取上清液，通过0.22μm滤膜，得到鸡肉代谢物提取液。
3.根据权利要求2所述的一种鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉的方法，其特征在于：在步骤d中，所述不同类别的鸡肉差异代谢物的筛选包括：
1)将原始数据导入MS-DIAL软件，进行峰对齐、峰识别等，导出所有代谢物的峰面积；
2)根据峰面积信息，删除每组样品中检出率小于80％的物质；
3)筛选t检验中P<0.05，差异倍数>2，OPLS-R模型中的VIP>1.5的物质，作为差异代谢物。
4.根据权利要求3所述的一种鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉的方法，其特征在于：在步骤e中，根据差异代谢物，随机选择若干数量的冰鲜鸡肉和个冷冻鸡肉样本作为训练集，建立PLS-DA模型，并同时选取若干数量的冰鲜鸡肉和冷冻鸡样本作为测试集，来测试模型的判别准确度。
5.根据权利要求1所述的一种鉴别冰鲜鸡肉与冷冻鸡肉的方法，其特征在于：在步骤c中，质谱条件为：离子源为电喷雾离子源，采集模式为数据依赖型扫描，正离子模式的喷雾电压分别为5500V，去簇电压分别为80V，离子源温度500℃，雾化器压力(GS1)50psi，加热辅助气压力(GS2)50psi，碰撞能35±15eV，数据采集范围为50-1500Da。
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