CN112986431B - 一种基于代谢组学鉴别有机牛奶和常规牛奶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于代谢组学鉴别有机牛奶和常规牛奶的方法,涉及牛奶鉴别与检测技术领域。所述方法包括以下步骤:(1)将有机牛奶和常规牛奶在相同的条件下进行样品预处理;(2)通过高效液相色谱串联高分辨率质谱对经预处理的样品进行数据的采集获得代谢物检测多峰图;(3)对色谱峰进行峰提取与校正,获取所有代谢物的相对峰面积与保留时间;(4)进行主成分分析、正交偏最小二乘分析,筛选差异标志物,得到鉴别模型区分有机牛奶和常规牛奶;(5)所述差异标志物通过与在线数据库比较进行识别。本发明的方法可以实现快速、全面检测和鉴别奶类产品,检测结果准确,操作方法简单。
Description
技术领域
本发明涉及牛奶鉴别与检测技术领域,尤其是涉及一种基于代谢组学鉴别有机牛奶和常规牛奶的方法。
背景技术
牛奶是一种营养价值很高的日常保健食品,含有多种有机成分。牛奶中含有多种维生素、氨基酸以及磷脂等成分,是非常理想的饮品。
有机牛奶在生产和加工过程中绝对禁止使用农药、化肥、激素、生长调节剂以及饲料添加剂等人工合成物质,强调的是“完全天然和无污染”。有机奶牛所产的有机牛奶能最大限度保存牛奶的天然营养成分,有机牛奶新鲜程度会大大提高。
有机牛奶的生产过程要比绿色食品难得多,需要按照有机农业的生产体系进行生产和加工。而常规牛奶就是普通的奶牛产奶经过加工制成的,后期加工的时候里面也会添加一些其他的添加剂,来提高牛奶的口感,常规牛奶相较于有机牛奶,安全性较差。因此,有机牛奶是最安全和最健康的奶制品。
近年来,随着消费者消费水平和消费能力的提升,纯天然、无污染、高品质的有机奶已经成为新的奶制品消费热点。然而,掺假带来的高额利润使得有机食品造假以及掺假越来越泛滥,在高值乳中掺廉价乳已经成为一种常见的“掺假现象”。
因此,需要提供一种能够区分和鉴别有机牛奶和常规牛奶的方法。代谢组学可以从组学层面快速和全面地识别和区分不同的奶制品。代谢组学研究方法分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学,非靶向代谢组学是一种无偏向的组学分析方法,可以对代谢物进行系统的分析,尤其是可以进行差异性研究。目前,基于非靶向代谢组学鉴别奶类的研究还很少有报道。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于代谢组学鉴别有机牛奶和常规牛奶的方法。提供了现有技术中所没有的快速、全面检测和鉴别奶类产品的新的方法。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种基于代谢组学鉴别有机牛奶和常规牛奶的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)将有机牛奶和常规牛奶在相同的条件下进行样品预处理;
(2)通过高效液相色谱串联高分辨率质谱对经预处理的样品进行数据的采集获得代谢物检测多峰图;
(3)对色谱峰进行峰提取与校正,获取所有代谢物的相对峰面积与保留时间;
(4)进行主成分分析、正交偏最小二乘分析,筛选差异标志物,得到鉴别模型区分有机牛奶和常规牛奶;
(5)所述差异标志物通过与在线数据库比较进行识别。
本发明应用非靶向代谢组学技术,对有机牛奶和常规非有机牛奶中的代谢产物进行分析,全面反应样品中的各区别成分,并结合化学分析方法筛选出差异性代谢标志物。
在一个实施方案中,在线数据库为牛奶代谢组学数据库(The Milk CompositionDatabase,MCDB)。
在一个实施方案中,所述有机牛奶和常规牛奶来源于荷斯坦牛。
在一个实施方案中,所述步骤(1)中,样品预处理过程包括将牛奶样品或溶解后的奶粉样品以5000~6000rpm离心20~30min,取1~2mL中层液体加入3~4倍体积的有机溶剂涡旋震荡,以9000~10000rpm离心10~15min后取上清液过滤;
优选地,溶解奶粉用去离子水进行,溶解时固液比为1:5~1:3g/mL;
优选地,所述有机溶剂为乙腈。
对样品的预处理可以尽可能地提取出乳品中的代谢产物,使得后续检测分析的结果建立在更加准确的基础上。
在一个实施方案中,所述过滤采用有机滤膜进行;优选地,滤膜的孔径为0.22μm。
在一个实施方案中,在步骤(4)中,以变量重要性>1,显著性水平<0.05,差异倍数>1.25或者<0.80作为门槛值获取差异标志物。
在一个实施方案中,所述高效液相色谱串联高分辨率质谱采用正离子与负离子2种模式进行,获取正、负离子2种模式情况下的差异标志物。
在一个实施方案中,高效液相色谱的流动相A的组成为:正离子模式下为含0.1~0.2%甲酸的水溶液,负离子模式下为含3~5mM乙酸铵的水溶液。
在一个实施方案中,高效液相色谱的流动相B的组成为:正离子模式下为含0.1~0.2%甲酸的乙腈溶液,负离子模式下为含3~5mM乙酸铵的乙腈溶液。
在一个具体的实施方案中,所述梯度洗脱的程序如下:
以上各流动相数值参数可在该数值参数±5%的范围内波动。
在一个实施方案中,所述梯度洗脱的流速为0.3~0.4mL/min,优选0.4mL/min。
在一个实施方案中,所述高分辨质谱的条件为:雾化气为50psi;辅助干燥气为50psi;气帘气为5psi;温度为500℃;喷雾电压:正离子模式为5000V,负离子模式为-4500V;去簇电压:正离子模式为80V,负离子模式为-80V;
其中上述条件中涉及的各个数值参数的浮动范围为该数值参数±10%。
色谱与质谱添加的设置使得样品的分离效果好,能够通过鉴别模型将有机牛奶与常规牛奶进行区分。
在一个实施方案中,在正离子模式下,差异标志物包括7-甲基鸟嘌呤、尿酸、苯乙酰甘氨酸、sn-甘油-3-磷酸胆碱、16-羟基十六酸、二十三烷酸、哌啶;在负离子模式下,差异标志物包括辛酸和癸烯酸。
差异标志物作为鉴别荷斯坦牛有机牛奶和常规牛奶的标志物的应用。
有益效果:
本发明为鉴别荷斯坦牛有机牛奶和常规牛奶提供了一种可靠、快速的鉴别方法,该方法方便、灵敏、精确,通过分析模型筛选差异标志物能够实现对牛奶的快速判别。
本发明有机牛奶组和常规牛奶组的AUC值分别为0.97、0.90,说明鉴别模型能够对样本进行有效判别。
本发明的操作方法简单,省时省力。
附图说明
图1为本发明提供的代谢组质谱图(ESI+为正离子模式下的质谱图;ESI-为负离子模式下的质谱图);
图2为本发明实施例提供的鉴别荷斯坦牛有机牛奶和常规牛奶的PCA得分图(其中Milk为常规牛奶,Organic milk为有机牛奶);
图3为鉴别荷斯坦牛有机牛奶和常规牛奶的OPLS-DA模型图;
图4为鉴别荷斯坦牛有机牛奶和常规牛奶的PCA-class模型Coomans'plot;
图5为鉴别荷斯坦牛有机牛奶和常规牛奶的PCA-class模型ROC曲线。
具体实施方式
下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本发明实施例中涉及的仪器设备与试剂耗材是本领域常规的,可以通过常规的商业途径购买获得。实施例中涉及的操作如无特殊说明,均为本领域的常规技术操作。
实施例
仪器设备:
色谱:SCIEX ExionLCTM系统
质谱:SCIEX Triple TOFTM 6600系统
色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18(30×150,1.8um)
低温高速离心机(eppendrof)
涡旋震荡仪
超纯水仪(Milli-Q)
试剂耗材:
乙腈(质谱级,Merck-Millipore)
甲酸(色谱纯,DIKMA)
乙酸铵(色谱纯,SIMCA)
材料:购买市售的经有机认证的荷斯坦牛有机牛奶以及常规生产线制造的常规荷斯坦牛奶粉。
1.样品预处理:
精确称取0.50g样品于10mL离心管中,加入1.5mL去离子水,颠倒混匀;于4℃5000rpm离心25min,转移1mL中层液体于另一干净离心管中;加入4mL乙腈,涡旋震荡12min;于4℃9000rpm离心12min,去上清液过0.22μm滤膜,上机检测。
2.色谱:
应用SCIEX ExionLCTM系统,色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18(30×150,1.8um)。柱温:38℃;进样量:6μL;流速:0.4mL/min。
流动相:正离子模式为含0.1%甲酸的水相和0.1%甲酸的乙腈相;负离子模式为含5mM乙酸铵的水相和5mM乙酸铵的乙腈相;
流动相梯度洗脱程序如下表:
表1液相色谱梯度洗脱程序:
3.质谱
应用SCIEX Triple TOFTM 6600系统。
电喷雾离子源参数设置如下:
喷雾电压(ISVF),5000V(正离子模式)或-4500V(负离子模式);雾化气(GS1),50psi;辅助干燥气(GS2),50psi;气帘气(CUR),25psi;温度(TEM),500℃;去簇电压(DP),80V(正离子模式)或-80V(负离子模式)。
在实验过程中采用IDA数据采集方法,在数据采集循环中,筛选强度最强且大于50的母离子采集其对应的二级质谱数据。一个循环设定的时间为560ms,包括了1个TOF-MS扫描和12个MS2扫描。其中TOF-MS扫描时间为150ms,质量检测范围为50-1000Da;每个MS2扫描时间为30ms,质量检测范围为50-1000Da,且MS2谱图均在HighSensitivity模式下采集,碰撞能量(CE)为30±15eV,质谱图见图1。
4.数据分析
原始数据使用Peakview 2.2软件(AB Sciex,USA)进行预处理,包括基线校正,峰提取,峰校正,标准化和归一化,获取所有代谢物的相对峰面积与保留时间。将处理后的数据导入Excel中,计算QC样品的变异系数(CV%),将超过30%的化合物剔除,缺失值超过50%的特征值剔除,其余的缺失值采用该特征值在所有样品中的最小值的一半进行填充。
计算代谢物在有机牛奶和常规牛奶组间的差异倍数(Fold change,FC),并对预处理后的数据进行显著性分析。
对非靶向代谢物数据进行主成分分析,判断两组样品是否存在差异。从PCA得分图,如图2所示,主成分得分图,可以发现各区域具有样品均匀分布,且无强异常样品点,说明样品本底统一、多数变量参与模型、模型可靠。两组样品具有较好的分离度,样品全部落在95%置信区间内。正、负离子模式前四个成分对差异的累计贡献率分别为71.8%和76.6%。这说明PCA模型对两组样品具有很好的鉴别能力,即有机牛奶和常规牛奶可以通过PCA进行区分,也进一步说明两组样品之间存在明显的差异。
随后进行正交偏最小二乘分析,建立OPLS-DA模型,筛选差异标志物(差异代谢物筛选条件:VIP>1,P value<0.05,Fold change<0.8或>1.25。VIP=Variableimportance,VIP值主要反映某变量对于模型重要性;P value为两组中某变量的显著性检验,当数据服从正态分布时为t检验,当数据不服从正态分布时为秩和检验;差异倍数(Foldchange)为两组中某变量含量水平的平均值/中位数比值,当数据服从正态分布时取平均值,当数据不服从正态分布时取中位数)。
如图3所示,模型中R2X(cum)和R2Y(cum)分别表示模型对X和Y矩阵的解释能力,Q2Y(cum)表示模型的预测能力,当R2X越小,R2Y和Q2Y越大且接近1时,模型越稳定可靠。在建立的OPLS-DA模型中,正离子模式下R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2Y(cum)分别为53.3%,96.3%和79.0%,负离子模式下R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2Y(cum)分别为42.0%,91.2%和75.2%,说明模型较稳定且预测能力好。
基于OPLS-DA模型,VIP>1,P value<0.05,Fold change<0.8或>1.25作为门槛值,正离子模式下获得7个潜在的特征标志物:7-甲基鸟嘌呤、尿酸、苯乙酰甘氨酸、sn-甘油-3-磷酸胆碱、16-羟基十六酸、二十三烷酸、哌啶;负离子模式下获得2个潜在的特征标志物:辛酸和癸烯酸,详细信息见表2。
表2有机牛奶与常规牛奶中的潜在差异标志物
本发明中的特征性差异物是从大量数据中筛查和识别的,具备客观性和精准性,可用于有机牛奶和常规牛奶的鉴别。
随后进行PCA Class分析,建立PCA Class鉴别模型。PCA Class是根据分组信息建立独立的PCA模型,根据数据对不同PCA模型的符合程度判断样本类别。我们采用样品的差异代谢物数据阵建立分组独立的PCA模型(图4)。
通过ROC曲线检验模型的可靠程度,AUC值为研究组样本之间的区分良好程度(0.7~0.8表示良好判别,0.8~1表示优秀判别),如图5所示有机牛奶组和常规牛奶组的AUC值分别为0.97、0.90,说明鉴别模型能够对样本进行有效判别。
Claims (8)
1.一种基于代谢组学鉴别有机牛奶和常规牛奶的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)将有机牛奶和常规牛奶在相同的条件下进行样品预处理;
(2)通过高效液相色谱串联高分辨率质谱对经预处理的样品进行数据的采集获得代谢物检测多峰图;
(3)对色谱峰进行峰提取与校正,获取所有代谢物的相对峰面积与保留时间;
(4)进行主成分分析、正交偏最小二乘分析,筛选差异标志物,得到鉴别模型区分有机牛奶和常规牛奶;
(5)所述差异标志物通过与在线数据库比较进行识别;
所述高效液相色谱采用SCIEX ExionLCTM系统,色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18;高效液相色谱的流动相A的组成为:正离子模式下为含0.1~0.2%甲酸的水溶液,负离子模式下为含3~5 mM乙酸铵的水溶液;高效液相色谱的流动相B的组成为:正离子模式下为含0.1~0.2%甲酸的乙腈溶液,负离子模式下为含3~5 mM乙酸铵的乙腈溶液;
所述高分辨率质谱采用SCIEX Triple TOFTM 6600系统;所述高分辨率 质谱的条件为:雾化气为50psi;辅助干燥气为50psi;气帘气为5psi;温度为500℃;喷雾电压:正离子模式为5000V,负离子模式为-4500V;去簇电压:正离子模式为80V,负离子模式为-80V;其中上述条件中涉及的各个数值参数的浮动范围为该数值参数±10%;
所述高效液相色谱串联高分辨率质谱采用正离子与负离子2种模式进行,获取正、负离子2种模式情况下的差异标志物;在正离子模式下,差异标志物包括7-甲基鸟嘌呤、尿酸、苯乙酰甘氨酸、sn-甘油-3-磷酸胆碱、16-羟基十六酸、二十三烷酸、哌啶;在负离子模式下,差异标志物包括辛酸和癸烯酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述有机牛奶和常规牛奶来源于荷斯坦牛。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,样品预处理过程包括将牛奶样品或溶解后的奶粉样品以5000~6000 rpm离心20~30 min,取1~2 mL中层液体加入3~4倍体积的有机溶剂涡旋震荡,以 9000~10000 rpm离心10~15 min后取上清液过滤。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,溶解奶粉用去离子水进行,溶解时固液比为1:5~1:3 g/mL。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述过滤采用有机滤膜进行。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,滤膜的孔径为0.22 μm。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(4)中,以变量重要性>1,显著性水平<0.05,差异倍数>1.25或者<0.80作为门槛值获取差异标志物。
8.根据权利要求1-7任一项所述方法获得的差异标志物作为鉴别荷斯坦牛有机牛奶和常规牛奶的标志物的应用。
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