CN114942286A - 一种亲水性多肽的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种亲水性多肽的检测方法，首先用磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料对目标样品分离富集后进行MALDI‑TOF/TOF MS分析和nano‑LC‑MS/MS分析，将质谱图做峰提取和归一化，并进行正交偏最小二乘判别分析和主成分分析，以选择特征多肽标志物。本发明合成的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料具备优异的亲水性和体积排阻效果，结合MALDI‑TOF MS和nano‑LC‑MS/MS，能够特异性分离富集内源性亲水性肽。该方法准确、成本低、通量高、样品消耗少，在大规模人群筛查、疾病诊断、亚型分类和预后监测方面具有巨大应用前景。
Description
技术领域
本发明属于一种特异性富集和检测亲水性多肽的方法，具体涉及使用新型磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料分离富集内源性亲水性多肽的方法，尤其涉及一种在磁性介孔多巴胺孔道中固定金属有机骨架材料的合成方法和筛选克罗恩病潜在的内源性亲水性多肽标志物的方法。
背景技术
肽组学是指生物样品中表达的所有内源性肽，包括小尺寸蛋白质、蛋白质降解片段、肽激素和神经肽。它们的表达水平可以反映机体的生理和病理状态。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）作为一种快速、高通量、高分辨率和高灵敏度的技术，已成为肽组学分析的主流方法。迄今为止，人们致力于将磁性材料与MALDI-TOF MS相结合，通过比较疾病患者样本和健康样本之间的肽组来揭示差异表达模式，旨在发现疾病的生物标志物。例如，Inter-α-trypsin 抑制剂（m/z值为3272）、载脂蛋白 A-II（28-94, m/z值为7800）和载脂蛋白 A-I（m/z值为28043）的同时增加可能表明早期卵巢癌。血纤维蛋白肽A、缓激肽，纤维蛋白原Α、补体C3、补体C4a、α-胰蛋白酶抑制剂、载脂蛋白 A-I、载脂蛋白A-IV、载脂蛋白 E、丛生蛋白、高分子量激肽原、因子XIII和转甲状腺素蛋白与前列腺癌、膀胱癌或乳腺癌紧密相关。此外，去丙氨酸纤维蛋白肽A (m/z 1466) 和纤维蛋白原α链（175-200, m/z 2664）分别对肝癌和口腔癌的发病机制发挥重要作用。这些被报道的内源性肽更偏向亲水性，因此亲水性内源性肽在作为生物标志物方面可能具有更大的潜力。
介孔材料由于具备高比表面积和有序多孔通道，在肽组学研究中取得了蓬勃发展。在众多介孔材料中，介孔多巴胺结构中含有的大量邻苯二酚和胺基基团，赋予介孔多巴胺优异的亲水性。近年来，介孔多巴胺在电催化、光热治疗、生物传感和药物传递等众多领域得到了广泛应用。金属有机骨架作为金属离子与有机配体相互络合形成的新兴多孔材料，表现出良好的功能可调性，其中，氨基功能化金属有机框架UiO-66-NH2以其制备简单、亲水性强、稳定性好脱颖而出，并被广泛应用于肽组学研究中。因此，有必要通过结合介孔多巴胺和UiO-66-NH2的材料优势，制备一种既具有高亲水性又具有体积排阻能力的探针，以便于高效鉴定内源性亲水性肽。
克罗恩病是一种进行性和破坏性的胃肠道慢性炎症性肠病，在全球范围内发病率不断上升，病因不明，易引起腹痛、腹泻和胃肠道出血。除了临床症状外，克罗恩病检测还需要放射学、内镜检查和组织活检，且耗时长、成本高，易引起严重并发症。高达50%的患者在诊断克罗恩病后接受了肠切除术。因此，早期发现克罗恩病对指导治疗至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种亲水性多肽的检测方法。
本发明提出一种亲水性多肽的检测方法，具体步骤如下，
（1）用磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料分离富集：将磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料与上样缓冲液以重量体积比为10g：1L的比例混合配置成材料分散液，取20μL材料分散液和2μL目标样品加入200μL上样缓冲液中，37℃下孵育30分钟，用上样缓冲液洗涤，加入10μL洗脱缓冲液，37℃下孵育30分钟，得到洗脱液；
其中，上样缓冲液为含有体积比90：9：1的乙腈、水、三氟乙酸的缓冲溶液；
其中，洗脱缓冲液为含有体积比69.9：30：0.1的乙腈、水、三氟乙酸的缓冲溶液；
（2）将1μL步骤（1）所得洗脱液混合1μL基质点靶，自然干燥后进行进行MALDI-TOF/TOF MS分析，其中，基质为含有体积比50：49.9：0.1的乙腈、水、三氟乙酸的20 mg mL-1 2,5-二羟基苯甲酸缓冲溶液；
（3）将步骤（2）所得的MALDI-TOF/TOF MS的质谱图做峰提取和归一化，并进行正交偏最小二乘判别分析和主成分分析，选择特征多肽标志物；
（4）将步骤（1）所得洗脱液冻干进行nano-LC-MS/MS分析鉴别多肽；
（5）将步骤（3）所得的特征多肽标志物的质荷比和步骤（4）中nano-LC-MS/MS分析鉴别的多肽匹配，确定特征多肽标志物的氨基酸序列。
本发明中，步骤（1）中使用的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料的合成步骤如下：
（1）将六水合三氯化铁溶解于乙二醇中，至溶液澄清透明后加入无水醋酸钠，充分搅拌超声后转移至反应釜中，在100-450℃下加热10-20小时，反应完毕后待反应釜冷却至室温，用去离子水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于40-75℃下真空干燥；
其中，六水合三氯化铁、乙二醇和无水醋酸钠的质量体积比为1.35 g：75 mL：3.6g；
（2）将步骤（1）所得产物与普朗尼克F127均匀分散于乙醇和去离子水的混合溶液中，在超声均匀后，将1, 3, 5-三甲苯，盐酸多巴胺，浓氨水分别注入溶液中，室温搅拌2-3小时，反应结束后用水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于60-90℃下用丙酮回流24小时，所得产物于40-75℃下真空干燥；
其中，普朗尼克F127，乙醇，去离子水，1, 3, 5-三甲苯，盐酸多巴胺，浓氨水的质量体积比为200 mg：10 mL：10 mL：0.2 mL：120 mg：0.16 mL；
（3）将步骤（2）所得产物均匀分散于N，N-二甲基甲酰胺中，在超声均匀后，将氯化锆和2-氨基对苯二甲酸混合，在120℃下持续搅拌45-75分钟，用去离子水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于40-75℃下真空干燥；
其中，N，N-二甲基甲酰胺，氯化锆，2-氨基对苯二甲酸的质量体积比为75 mL：157mg：122 mg。
本发明中，步骤（2）中的MALDI-TOF/TOF MS分析具体条件为：使用BrukerUltrafleXtreme MALDI-TOF/TOF质谱，采用355 nm Nd:YAG 激光光源，激光频率为2000Hz，加速电压为20 kV，其中离子源1处电压为20 kV，离子源2处电压为17.6 kV；采集模式为反射阳离子模式，采集范围m/z为700-5000 Da；从Flexcontrol 3.4获得质谱数据，并在Flexanalysis 3.4中导出数据。
本发明中，步骤（4）中的nano-LC-MS/MS分析具体条件为：使用EASY-nLC 1000液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific）联用Orbitrap Fusion质谱仪（Thermo FisherScientific），液相色谱的A相和B相分别为含0.1%甲酸的水和含0.1%甲酸的乙腈，将步骤（1）所得洗脱液冻干后重新溶解于A相中，通过线性梯度，其中5% A-30% B，50 min，将其上样至分析柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap C18, 75 μm×25 cm）中进行分析；电喷雾的电压为2.3 kV，一级谱图中母离子的扫描范围为m/z=350-1600，分辨率为60000（m/z=200，通过高能碰撞解离获取二级谱图，分辨率为15000，m/z=200；选择高能碰撞解离模式依次碎裂电荷为+2、+3、+4的母离子；归一化碰撞能量为28%；
串联质谱由Proteome Discoverer（Thermo Fisher Scientific，版本2.4.0.305）提取，使用Uniprot-SwissProt 数据库（分类学：智人，20386 个条目）进行数据库检索，设置母离子质量容差为10 ppm，碎片离子质量公差为0.020 Da。
本发明中，步骤（3）中选择特征多肽标志物的条件是VIP值> 2、P值< 0.05 和FC值> 2或<0.5。
本发明中，步骤（5）中多肽匹配条件为MALDI-TOF/TOF MS分析选择的特征多肽标志物的质荷比和nano-LC-MS/MS分析鉴别的多肽的质荷比在100 ppm内一致。
本发明中，步骤（5）中将步骤（3）的MALDI-TOF/TOF MS特征多肽标志物的质荷比和步骤（4）中nano-LC-MS/MS鉴别的多肽匹配，确定8条特征多肽标志物的氨基酸序列（m/z值为1979.87对应HPNSPLDEENLTQENQD，m/z值为2884.56对应DQTVSDNELQEMSNQGSKYVNKEIQ，m/z值为1369.75对应SEETKENEGFTV，m/z值为2094.98对应EDPQGDAAQKTDTSHHDQD，m/z值为1692.91对应DYLNETQQLTPEIK，m/z值为833.41对应GPTGTGESK，m/z值为2678.49对应APNIYVLDYLNETQQLTPEIKSK，m/z值为1250.62对应KAADDTWEPFA）。
本发明中，步骤（1）中目标样品为血清或尿液。
本发明的有益效果在于：本发明提出的亲水性多肽的检测方法使用了磁性介孔多巴胺孔道中固定金属有机骨架材料，用于特异性富集和分析亲水性多肽。具有如下优点：
1. 本发明提出的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料在介孔多巴胺孔道中固定金属有机骨架材料，材料具有大比表面积，良好的磁响应性，与亲水性肽具有强亲水相互作用，因此本发明方法可以更灵敏、更有选择性地分离富集内源性亲水性肽。
2.磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料的介孔结构有助于目标内源性亲水性肽的捕获和大分子量蛋白质的排阻，因此本发明方法在复杂的生物样品中显示出对内源性亲水性肽良好的富集能力。
3.本发明方法中通过机器学习算法可以分析亲水性多肽在健康人和克罗恩病患者之间的表达差异，从而筛选特征多肽标志物，结合nano-LC MS/MS可以大规模鉴定内源性亲水性多肽，深入分析生物功能。
总之，本发明制备的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料具有高亲水性、独特的介孔结构和优异的磁响应性，可以成功地用于特异性分离富集克罗恩病患者和健康人血清或尿液中的内源性亲水性多肽，并筛选出8条特征亲水性多肽为潜在的克罗恩病标志物，成功实现了克罗恩病患者的初步诊断和亚型分类，这表明其在大规模人群筛查、疾病诊断、亚型分类和预后监测方面具有巨大应用前景。
附图说明
图1为实施例1的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料的扫描电子显微镜照片；
图2为实施例1的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料的透射电子显微镜照片；
图3为实施例1的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料的X射线衍射谱图；
图4为实施例1的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料的氮气吸附等温线以及孔径分布图；
图5为实施例1的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料的接触角图；
图6为实施例2的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料对血清中内源性亲水性肽分离富集的质谱图。图(a)为未经富集的血清代表质谱图，图(b)是本材料富集的克罗恩病患者血清中内源性亲水性肽的代表质谱图，图(c)是本材料富集的健康人血清中内源性亲水性肽的代表质谱图；
图7为实施例3的基于训练集的正交偏最小二乘判别分析模型；
图8为实施例3的基于训练集的8条特征多肽的热图；
图9为实施例4的基于验证集的主成分分析模型。
具体实施方式
本发明利用磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料与内源性亲水性肽的相互作用来实现对血清亲水性多肽的特异性富集和分析，以下介绍具体实施方式。
实施例1：磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料的合成。
（1）将1.35 g FeCl3·6H2O在75 mL乙二醇中经磁力搅拌至固体完全溶解后，加入3.6 g醋酸钠，再经充分搅拌和超声后转移至水热反应釜中，200℃下加热16个小时，待反应釜冷却后，用去离子水和乙醇分别洗涤产物三次，50℃下真空干燥；
（2）将步骤（1）所得产物50 mg与200 mg普朗尼克F127（sigma-aldrich）均匀分散于10 mL乙醇和10 mL去离子水的混合溶液中，在持续超声直至均匀的情况下，将0.2 mL 1,3, 5-三甲苯，120 mg盐酸多巴胺，0.16 mL浓氨水分别注入溶液中，室温搅拌2小时，反应结束后用水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于80℃下用200 mL丙酮回流48小时，所得产物于50℃下真空干燥；
（3）将步骤（2）所得产物50 mg均匀分散于75 mL N，N-二甲基甲酰胺中，在持续超声直至均匀的情况下，将157 mg氯化锆和122 mg 2-氨基对苯二甲酸混合。在120℃下持续搅拌60分钟后，反应结束所得产物用水和无水乙醇分别洗涤三次后，于50℃下真空干燥；即得磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料，命名为MMP-b-MOFs。
磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料的扫描电子显微镜照片如图1；磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料的透射电子显微镜照片如图2；磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料的X射线衍射谱图如图3；磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料的氮气吸附等温线以及孔径分布图如图4；磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料的接触角图如图5。
从图1至图5可以看出：磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料呈现均匀的球形形态及核壳结构，具有3.80 nm和6.79 nm两个主要孔径，具备优异的亲水性。
实施例2：将实施例1得到的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料作为固相吸附剂用于50个克罗恩病患者血清样品和50个健康人血清中亲水性肽的分离富集。
（1）将50个克罗恩病患者和50个健康对照的血清以4:1的比例随机分成训练集和验证集，分别对应80和20个样本。
（2）取2 mg实施例1所得的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料与200 μL上样缓冲液（乙腈/水/三氟乙酸体积比=90/9/1）混合配置成材料分散液，取20μL材料分散液和2μL血清加入200μL上样缓冲液中，37℃孵育30分钟，用上样缓冲液洗涤，加入10μL洗脱缓冲液（乙腈/水/三氟乙酸体积比=30/69.9/0.1），37℃洗脱30分钟，得到洗脱液。
（3）质谱分析：取1 μL步骤（2）中洗脱液混合1 μL 20 mg mL-1 2,5-二羟基苯甲酸（DHB）基质（乙腈/水/三氟乙酸体积比=50/49.9/0.1）点靶，自然干燥后进行MALDI-TOF/TOFMS分析，使用Bruker UltrafleXtreme MALDI-TOF/TOF质谱，采用355 nm Nd:YAG 激光光源，激光频率为2000 Hz，加速电压为20 kV（离子源1处电压为20 kV，离子源2处电压为17.6kV），采集模式为反射阳离子模式，采集范围m/z为700-5000 Da；从Flexcontrol 3.4获得质谱数据，并在Flexanalysis 3.4中导出数据。质谱图如图6所示。
分析结果：由图6可以看出，来自于血清的亲水性肽被本材料所捕获，而在原液中大分子蛋白的干扰被大幅去除。
实施例3：将实施例2得到的血清亲水性肽质谱图做峰提取和归一化，使用Metaboanalyst 5.0和SIMCA对训练集做正交偏最小二乘判别分析，计算每条多肽的VIP值、P值和FC值，筛选特征多肽标志物。
（1）使用R包MALDIquant、MALDIquantForeign和limma对血清亲水性肽质谱图做峰提取和归一化。
（2）使用Metaboanalyst 5.0和SIMCA对训练集和验证集分别进行正交偏最小二乘判别分析和主成分分析，以选择特征多肽标志物。具体是使用Metaboanalyst 5.0和SIMCA计算每条多肽的VIP 值、P值和FC值，筛选VIP值> 2、P值< 0.05 和FC值> 2或<0.5的多肽为特征多肽标志物。
（3）基于特征多肽标志物对训练集绘制热图。
分析结果：由图7可以看出，在正交偏最小二乘判别分析模型中，克罗恩病患者和健康人的血清亲水性多肽分离效果较好。由图8可以看出，8条特征多肽标志物对于区分克罗恩病患者和健康人发挥了重要的作用。
实施例4：将实施例3得到的8条特征多肽标志物对验证集做主成分分析。
分析结果：由图9可以看出，在主成分分析这一无监督机器学习算法下，8条特征多肽标志物具备将克罗恩病患者从健康人中区分的能力。
实施例5：将实施例2得到的洗脱液做nano-LC-MS/MS分析，鉴定多肽序列。
（1）使用EASY-nLC 1000液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific）联用OrbitrapFusion质谱仪（Thermo Fisher Scientific），液相色谱的A相和B相分别为含0.1%甲酸的水和含0.1%甲酸的乙腈，将步骤（1）所得洗脱液冻干后重新溶解于A相中，通过线性梯度，其中5% A-30% B，50 min，将其上样至分析柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap C18, 75 μm×25 cm）中进行分析；电喷雾的电压为2.3 kV，一级谱图中母离子的扫描范围为m/z=350-1600，分辨率为60000（m/z=200，通过高能碰撞解离获取二级谱图，分辨率为15000，m/z=200；选择高能碰撞解离模式依次碎裂电荷为+2、+3、+4的母离子；归一化碰撞能量为28%；
（2）串联质谱由Proteome Discoverer（Thermo Fisher Scientific，版本2.4.0.305）提取，使用Uniprot-SwissProt 数据库（分类学：智人，20386 个条目）进行数据库检索，设置母离子质量容差为10 ppm，碎片离子质量公差为0.020 Da。
（3）将实施例3得到的的特征多肽标志物的质荷比和nano-LC-MS/MS鉴别的多肽匹配，通过在100 ppm内一致的原则，确定8条特征多肽标志物的氨基酸序列。
分析结果：8条特征多肽标志物的氨基酸序列如下：m/z值为1979.87对应HPNSPLDEENLTQENQD，m/z值为2884.56对应DQTVSDNELQEMSNQGSKYVNKEIQ，m/z值为1369.75对应SEETKENEGFTV，m/z值为2094.98对应EDPQGDAAQKTDTSHHDQD，m/z值为1692.91对应DYLNETQQLTPEIK，m/z值为833.41对应GPTGTGESK，m/z值为2678.49对应APNIYVLDYLNETQQLTPEIKSK，m/z值为1250.62对应KAADDTWEPFA。
实施例6：将实施例1得到的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料作为固相吸附剂用于50个克罗恩病患者尿样和50个健康人尿样中亲水性肽的分离富集。
（1）将50个克罗恩病患者和50个健康对照的尿样以4:1的比例随机分成训练集和验证集，分别对应80和20个样本。
（2）尿液样品在4 °C下以4000 rpm速度离心20分钟，上清液置于-80 °C中保存。取2 mg实施例1所得的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料与200 μL上样缓冲液（乙腈/水/三氟乙酸体积比=90/9/1）混合配置成材料分散液，取20μL材料分散液和2μL尿液上清液加入200μL上样缓冲液中，37℃孵育30分钟，用上样缓冲液洗涤，加入10μL洗脱缓冲液（乙腈/水/三氟乙酸体积比=30/69.9/0.1），37℃洗脱30分钟，得到洗脱液。
（3）质谱分析：取1 μL步骤（2）中洗脱液混合1 μL 20 mg mL-1 2,5-二羟基苯甲酸（DHB）基质（乙腈/水/三氟乙酸体积比=50/49.9/0.1）点靶，自然干燥后进行MALDI-TOF/TOFMS分析，使用Bruker UltrafleXtreme MALDI-TOF/TOF质谱，采用355 nm Nd:YAG 激光光源，激光频率为2000 Hz，加速电压为20 kV（离子源1处电压为20 kV，离子源2处电压为17.6kV），采集模式为反射阳离子模式，采集范围m/z为700-5000 Da；从Flexcontrol 3.4获得质谱数据，并在Flexanalysis 3.4中导出数据。
其他条件均与实施例2一样，仅步骤（2）不同。
Claims (8)
1.一种亲水性多肽的检测方法，其特征在于具体步骤如下，
（1）用磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料分离富集：将磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料与上样缓冲液以重量体积比为10g：1L的比例混合配置成材料分散液，取20μL材料分散液和2μL目标样品加入200μL上样缓冲液中，37℃下孵育30分钟，用上样缓冲液洗涤，加入10μL洗脱缓冲液，37℃下孵育30分钟，得到洗脱液；
其中，上样缓冲液为含有体积比90：9：1的乙腈、水、三氟乙酸的缓冲溶液；
其中，洗脱缓冲液为含有体积比69.9：30：0.1的乙腈、水、三氟乙酸的缓冲溶液；
（2）将1μL步骤（1）所得洗脱液混合1μL基质点靶，自然干燥后进行进行MALDI-TOF/TOFMS分析，其中，基质为含有体积比50：49.9：0.1的乙腈、水、三氟乙酸的20 mg mL-1 2,5-二羟基苯甲酸缓冲溶液；
（3）将步骤（2）所得的MALDI-TOF/TOF MS的质谱图做峰提取和归一化，并进行正交偏最小二乘判别分析和主成分分析，选择特征多肽标志物；
（4）将步骤（1）所得洗脱液冻干进行nano-LC-MS/MS分析鉴别多肽；
（5）将步骤（3）所得的特征多肽标志物的质荷比和步骤（4）中nano-LC-MS/MS分析鉴别的多肽匹配，确定特征多肽标志物的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的亲水性多肽的检测方法，其特征在于步骤（1）中使用的磁性介孔多巴胺金属有机骨架材料的合成步骤如下：
（1）将六水合三氯化铁溶解于乙二醇中，至溶液澄清透明后加入无水醋酸钠，充分搅拌超声后转移至反应釜中，在100-450℃下加热10-20小时，反应完毕后待反应釜冷却至室温，用去离子水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于40-75℃下真空干燥；
其中，六水合三氯化铁、乙二醇和无水醋酸钠的质量体积比为1.35 g：75 mL：3.6 g；
（2）将步骤（1）所得产物与普朗尼克F127均匀分散于乙醇和去离子水的混合溶液中，在超声均匀后，将1, 3, 5-三甲苯，盐酸多巴胺，浓氨水分别注入溶液中，室温搅拌2-3小时，反应结束后用水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于60-90℃下用丙酮回流24小时，所得产物于40-75℃下真空干燥；
其中，普朗尼克F127，乙醇，去离子水，1, 3, 5-三甲苯，盐酸多巴胺，浓氨水的质量体积比为200 mg：10 mL：10 mL：0.2 mL：120 mg：0.16 mL；
（3）将步骤（2）所得产物均匀分散于N，N-二甲基甲酰胺中，在超声均匀后，将氯化锆和2-氨基对苯二甲酸混合，在120℃下持续搅拌45-75分钟，用去离子水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于40-75℃下真空干燥；
其中，N，N-二甲基甲酰胺，氯化锆，2-氨基对苯二甲酸的质量体积比为75 mL：157 mg：122 mg。
3.根据权利要求1所述的亲水性多肽的检测方法，其特征在于：步骤（2）中的MALDI-TOF/TOF MS分析具体条件为：采用355 nm Nd:YAG 激光光源，激光频率为2000 Hz，加速电压为20 kV，其中离子源1处电压为20 kV，离子源2处电压为17.6 kV；采集模式为反射阳离子模式，采集范围m/z为700-5000 Da；从Flexcontrol 3.4获得质谱数据，并在Flexanalysis 3.4中导出数据。
4.根据权利要求1所述的亲水性多肽的检测方法，其特征在于：步骤（4）中的nano-LC-MS/MS分析具体条件为：
液相色谱的A相和B相分别为含0.1%甲酸的水和含0.1%甲酸的乙腈，将步骤（1）所得洗脱液冻干后重新溶解于A相中，通过线性梯度，其中5% A-30% B，50 min，将其上样至分析柱中进行分析；电喷雾的电压为2.3 kV，一级谱图中母离子的扫描范围为m/z=350-1600，分辨率为60000，m/z=200，通过高能碰撞解离获取二级谱图，分辨率为15000，m/z=200；选择高能碰撞解离模式依次碎裂电荷为+2、+3、+4的母离子；归一化碰撞能量为28%；
MS/MS使用Uniprot-SwissProt 数据库进行检索，设置母离子质量容差为10 ppm，碎片离子质量公差为0.020 Da。
5.根据权利要求1所述的亲水性多肽的检测方法，其特征在于：步骤（3）中选择特征多肽标志物的条件是VIP值大于 2、P值小于 0.05 、FC值大于 2或小于0.5。
6.根据权利要求1所述的亲水性多肽的检测方法，其特征在于：步骤（5）中多肽匹配条件为MALDI-TOF/TOF MS分析选择的特征多肽标志物的质荷比和nano-LC-MS/MS分析鉴别的多肽的质荷比在100 ppm内一致。
7.根据权利要求1所述的亲水性多肽的检测方法，其特征在于：步骤（5）中将步骤（3）的MALDI-TOF/TOF MS特征多肽标志物的质荷比和步骤（4）中nano-LC-MS/MS鉴别的多肽匹配，确定8条特征多肽标志物的氨基酸序列，m/z值分别为1979.87， 2884.56，1369.75，2094.98，1692.91，833.41，2678.49，1250.62。
8.根据权利要求1所述的亲水性多肽的检测方法，其特征在于：步骤（1）中目标样品为血清或尿液。
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