CN114505064B - 葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成方法及应用 - Google Patents
葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供葡萄糖‑6‑磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成方法及应用，利用碳水化合物D‑葡萄糖‑6‑磷酸钠盐优良的生物相容性和亲水性，利用磷酸基团和金属阳离子之间的亲和原理，与锰掺杂硫化锌量子点结合，制备了合成过程简便且安全的葡萄糖‑6‑磷酸的锰掺杂硫化锌量子点，对糖肽表现出超高的特异性和选择性；通过水热反应合成磁性四氧化三铁，在磁性四氧化三铁表面包裹多巴胺层为偶联连接剂接枝锰掺杂硫化锌量子点，得到磁性锰掺杂硫化锌量子点，以接枝的锰掺杂硫化锌量子点为锚定位点官能化D‑葡萄糖‑6‑磷酸钠盐，提高亲水性和可加工性，对外磁场具有较强的响应性，会简化固液分离过程，能够实现糖肽、磷酸肽的同时分离富集。
Description
技术领域
本发明涉及功能化纳米材料与纳米技术领域，具体是葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成方法及应用。
背景技术
糖尿病是一种代谢性疾病，以高血糖为特征，且糖尿病的生物标志物具有多样性。其中被证实的有自身抗体等，但是对糖尿病固有的异质性的及时诊断能力亟待提高。在糖尿病的发病机制中，其中蛋白质糖基化起着关键作用，糖基化作为蛋白质修饰的一种，广泛存在于人体蛋白质中。蛋白质糖基化对细胞间信号转导、免疫调节和细胞分化等细胞过程具有普遍影响。有研究表明，蛋白质异常糖基化与生理异常和病理有关，目前一些糖基化蛋白已成为某些疾病的生物标志物。因此，分析蛋白质糖基化，了解疾病发病机制，进而确定疾病生物标志物，对疾病的治疗及诊断具有重大意义。质谱技术的高通量、高灵敏度和即时性，使其在糖肽研究中被广泛应用。然而，在有的生物样品中，因为糖肽的丰度非常低，直接检测时，非糖肽信号易掩盖糖肽信号。因此，在质谱分析之前，使糖肽达到高效富集是具有重要意义的。
现有技术中为捕获低丰度的糖肽，已经建立了多种策略。其中被广泛应用的是亲水相互作用液相色谱法。但是传统的基于亲水相互作用液相色谱法的材料制备方法费时费力，合成步骤繁杂，并且制备过程中常需要高温高压条件，具备一定的危险性。
因此，发展一种流程简单的亲水相互作用液相色谱法类量子点纳米材料，通过富集糖肽寻找新的糖尿病标志物以提高糖尿病的及时诊断能力是一种新的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成方法及应用，以解决现有技术中的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成，包括以下步骤：
S1：将七水硫酸锌和四水氯化锰、去离子水混合搅拌，在氮气氛围下搅拌30-40min；加入九水硫化钠与去离子水混合溶液，并继续搅拌30-40min，得到锰掺杂硫化锌量子点；
S2：将葡萄糖-6-磷酸二钠溶解于含有乙腈、三氟乙酸和去离子水的混合溶液中，加入锰掺杂硫化锌量子点，并在25℃搅拌6h；
S3：将步骤S2所得的产物用去离子水和乙醇洗涤，并在50℃真空干燥8-12h，得到葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点。
进一步的，步骤S1中七水硫酸锌和四水氯化锰的质量比为18:1；所述七水硫酸锌的浓度为0.3125mol/L；所述四水氯化锰的浓度为0.025mol/L。
进一步的，七水硫酸锌和九水硫化钠的质量比为18:15；九水硫化钠的浓度为1.25mol/L。
进一步的，步骤S2中取葡萄糖-6-磷酸二钠与去离子水的质量体积比为10mg:1mL；步骤S3中乙腈、三氟乙酸和去离子水的体积比为15:0.03:10。
进一步的，葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成的应用，其特征在于，用于寻找糖尿病标志物的方法，具体步骤如下：将三氟乙酸、乙腈和去离子水按照体积比为1:9:99配置成上样缓冲液，将葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点、缓冲液、目标糖基化肽段溶液在37℃下富集30min；用磷酸、去离子水和乙腈混合的缓冲混合液进行洗涤，然后加入去离子水和乙腈混合的洗脱缓冲液，37℃下洗脱30min，离心分离获取上清液，进行MALDI-TOFMS或者nanoLC-MS/MS检测。
进一步的，缓冲混合液由0.5％体积比的磷酸、14.5％体积比的去离子水和85％体积比的乙腈组成。
进一步的，洗脱缓冲液由50％体积比的乙腈和50％体积比的去离子水组成。
目前对血糖中蛋白质糖基化和磷酸化的高效分离分析有助于阐明糖尿病的发病机理，质谱是目前应用最广泛的准确识别和定位糖基化、磷酸化位点的平台，然而，大量未修饰肽的共存限制了利用质谱对糖基化、磷酸化位点的研究，因此需要在质谱分析前对样品中的糖肽或磷酸肽进行有效富集。
目前最主要的捕捉磷酸肽的策略为金属氧化物亲和层析和固定化金属亲和层析，亲水作用液相色谱法具有无偏富集糖肽的性能且易于与质谱联用，是糖肽富集最常用的方法之一
本发明中利用廉价易得、来源丰富，具有优良的生物相容性和亲水性的碳水化合物D-葡萄糖-6-磷酸钠盐(G6PNa2)用于制备亲水探针，作为一种容易获得的生命代谢物，具有优异亲水性的G6PNa2通过其磷酸基团和金属阳离子之间的亲和原理与锰掺杂硫化锌量子点结合，以构建能够同时高效富集糖肽/磷酸肽的功能化探针。
本发明通过一锅法工艺，以硫酸锌、氯化锰和硫化钠为前体，以D-葡萄糖-6-磷酸钠盐(G6PNa2)为修饰物，制备了一种葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点纳米材料，合成过程简便且安全；且功能化修改已集成到一个步骤的过程中，在室温下螯合葡萄糖-6-磷酸后，对糖肽表现出超高的特异性和选择性。
进一步的，锰掺杂硫化锌量子点为磁性锰掺杂硫化锌量子点，制备方法包括以下步骤：
1)将六水氯化铁、乙二醇超声搅拌，加入无水乙酸钠搅拌30min；转移至带有聚四氟乙烯内衬的水热反应釜中，190-195℃保温15h，冷却至18-25℃，通过磁分离，依次用去离子水、乙醇洗涤3-5次，真空干燥，得到磁性四氧化三铁；
2)多巴胺盐酸盐加入去离子水得到溶液A；将三羟甲基氨基甲烷和磁性四氧化三铁加入离子水与乙醇混合溶液中得到溶液B；将溶液A和B混合，18-25℃下搅拌16h；通过磁分离，依次用去离子水、乙醇洗涤3-5次，真空干燥，得到多巴胺改性磁性四氧化三铁；
3)在超声作用下将多巴胺改性磁性四氧化三铁、异丙醇混合搅拌；加入三乙胺搅拌2min得到三乙胺混合溶液；将七水硫酸锌和四水氯化锰、去离子水混合搅拌，在氮气氛围下搅拌30min，加入将九水硫化钠、去离子水混合搅拌30min，转移入三乙胺混合溶液，190-195℃保温10h；通过磁分离技术得到磁性锰掺杂硫化锌量子点，乙醇洗涤后真空干燥。
进一步的，六水氯化铁、无水乙酸钠、乙二醇的摩尔体积比为0.01mol:0.088mol:120mL。
进一步的，多巴胺盐酸盐和磁性四氧化三铁的质量比为4:1；三羟甲基氨基甲烷与磁性四氧化三铁的摩尔比为0.25:0.43；多巴胺改性磁性四氧化三铁、异丙醇的质量体积比为100mg:75mL；七水硫酸锌和四水氯化锰的质量比为18:1；七水硫酸锌的浓度为0.3125mol/L；四水氯化锰的浓度为0.025mol/L；七水硫酸锌和九水硫化钠的质量比为18:15；九水硫化钠的浓度为1.25mol/L。
本发明通过水热反应合成磁性四氧化三铁，且在磁性四氧化三铁表面包裹多巴胺层，以修饰的多巴胺层为偶联连接剂接枝锰掺杂硫化锌量子点，得到磁性锰掺杂硫化锌量子点，以接枝的锰掺杂硫化锌量子点为锚定位点官能化D-葡萄糖-6-磷酸钠盐，构建了新型功能化亲水磁探针。
多巴胺沉积在磁性四氧化三铁表面，从而形成具有独特亲水性的天然胶黏剂聚多巴胺，且在水热反应中，多巴胺中的质子化氮原子可以与锰、锌离子结合并介导其水解过程，充当磁性四氧化三铁与锰掺杂硫化锌量子点之间的偶联连接剂，提高葡萄糖-6-磷酸的磁性锰掺杂硫化锌量子点的亲水性和可加工性，在磁性四氧化三铁上利用逐层修饰法构建了功能化亲水磁探针，对外磁场具有较强的响应性，会简化固液分离过程；且聚多巴胺作为偶联连接剂在探针表面修饰磁性锰掺杂硫化锌量子点；引入的磁性锰掺杂硫化锌量子点不仅作为后续官能化D-葡萄糖-6-磷酸钠盐的锚定位点，而且能够有效富集磷酸肽；D-葡萄糖-6-磷酸钠盐的官能化赋予了纳米材料高亲水性，进而捕捉糖肽。本发明能够实现糖肽/磷酸肽的同时分离富集。
本发明的有益效果：
本发明通过一锅法工艺，以硫酸锌、氯化锰和硫化钠为前体，以D-葡萄糖-6-磷酸钠盐为修饰物，制备了葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点纳米材料，合成周期极短的材料制备流程，节省了大量时间和劳力；在制备中使用的反应原料常见，合成过程简便且安全；此外，功能化修改已集成到一个步骤的过程中，在室温下螯合葡萄糖-6-磷酸后，对糖肽表现出超高的特异性和选择性，这表明了其在寻找糖尿病标志物中的巨大潜力。
本发明通过水热反应合成磁性四氧化三铁，且在磁性四氧化三铁表面包裹多巴胺层，以修饰的多巴胺层为偶联连接剂接枝锰掺杂硫化锌量子点，得到磁性锰掺杂硫化锌量子点，以接枝的锰掺杂硫化锌量子点为锚定位点官能化D-葡萄糖-6-磷酸钠盐，在磁性四氧化三铁上利用逐层修饰法构建了功能化亲水磁探针，对外磁场具有较强的响应性，会简化固液分离过程；且聚多巴胺作为偶联连接剂在探针表面修饰磁性锰掺杂硫化锌量子点；引入的磁性锰掺杂硫化锌量子点不仅作为后续官能化D-葡萄糖-6-磷酸钠盐的锚定位点，而且能够有效富集磷酸肽；D-葡萄糖-6-磷酸钠盐的官能化赋予了纳米材料高亲水性，进而捕捉糖肽。本发明能够实现糖肽、磷酸肽的同时有效分离富集。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明做进一步详细的说明，其中：
图1为本发明实施例1的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的透射电子显微镜照片图；
图2为本发明实施例1的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的红外光谱图；
图3为本发明实施例1的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的元素分析图；
图4为本发明实施例2中葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点富集HRP中的糖肽的质谱图；
图5为本发明实施例2中葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点富集糖肽段检测限(0.05fmol/μL)的质谱图；
图6是本发明实施例3中葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点富集混合蛋白(BSA:HRP＝1000:1)中的糖肽的质谱图；
图7为本发明实施例4中葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点富集标准糖肽的负载质谱图；
图8为本发明实施例5中葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点富集人血清中糖肽段的维恩图和序列频率示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，若本发明实施例或附图中有涉及方向性指示诸如上、下、左、右、前、后……，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态如各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成方法，包括以下步骤：
S1：取1.8g的七水硫酸锌和0.1g的四水氯化锰溶于20mL去离子水中；将所得的溶液倒入容量为250mL的三颈烧瓶中，并在氮气保护下搅拌30min；取1.5g的九水硫化钠溶于5mL去离子水，加入三颈烧瓶中，并继续搅拌30min，得到锰掺杂硫化锌量子点；
S2：取500mg葡萄糖-6-磷酸二钠溶解于含有75mL乙腈、150μL三氟乙酸和50mL去离子水的混合溶液，加入步骤S1的三颈烧瓶中，并在25℃搅拌6h；
S3：将步骤S2所得的产物用去离子水和乙醇充分洗涤，并在真空干燥器中50℃干燥过夜，得到葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点。
所得的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的透射电子显微镜照片(JEOL1011显微镜，日本)如图1所示，傅里叶红外变换光谱图(赛默飞NicoletiS10，美国)如图2所示，元素分析图如图3所示。
实施例2-实施例5中的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点均采用实施例1中的合成方法制备得到。
实施例2
葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点在富集HRP中的糖肽的应用：
(1)试样的准备：辣根过氧化物酶(HRP)在25mmol/LNH4HCO3溶液中37℃酶解16h；
(2)富集：0.5mg葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点分散到10μL的1％体积比的三氟乙酸、9％体积比的乙腈和90％体积比的去离子水的离心管中，再加入2μL步骤(1)制备的样品，在37℃富集30min；用0.5％体积比的磷酸、14.5％体积比的去离子水和85％体积比的乙腈的缓冲液充分洗涤并离心分离3次；加入10μL50％体积比的乙腈和50％体积比的去离子水的洗脱液，37℃洗脱30min，离心分离获取上清液；
(3)质谱分析：取1μL步骤(2)所得的上清液点靶，用DHB作为基质进行质谱分析，质谱图如图4所示，图5是葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点富集HRP中的糖肽段检测限(0.05fmol/μL)。
由实施例2及图4可知，利用HRP酶解物评估了葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点富集糖肽的能力，可见，通过G6PNa2与糖肽之间的亲水相互作用实现对糖肽的捕捉，通过锰掺杂硫化锌量子点与磷酸根之间强的作用实现磷酸肽的选择性富集，在未经富集便直接检测的情况下，检测到非糖肽信号占据主导谱，极大地抑制了糖肽的信号，而在使用葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点特异性富集糖肽后，属于糖肽的信号大量增长，检测到24个糖肽信号，且糖肽信号占据主导谱，质谱图中几乎不存在非糖肽的信号，表明葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点具有优异的富集糖肽的能力。
由实施例2及图5可知，利用稀释后至0.05fmol/μL的低浓度HRP酶解物评估了葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点富集糖肽的能力，依赖于G6PNa2与糖肽之间出色的亲水相互作用实现了在低丰度下对糖肽的富集。图5中可以看出，葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点在0.05fmol/μL的低浓度HRP酶解物中依旧能捕捉到8个糖肽，表明葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点对糖肽具有较低的检出限。
实施例3
葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点在富集混合蛋白中的糖肽的应用：
(1)试样的准备：牛血清白蛋白(BSA)先用二硫苏糖醇和碘乙酰胺还原烷基化，然后在37℃酶解16h；辣根过氧化物酶(HRP)在25mMNH4HCO3溶液中37℃酶解16h；将牛血清白蛋白(BSA)和辣根过氧化物酶(HRP)以1000：1摩尔比加到含有1％体积比的三氟乙酸、9％体积比的乙腈和90％体积比的去离子水的离心管中；
(2)富集：0.5mg实施例1所得的纳米材料分散到100μL含有步骤(1)的糖肽的1％体积比的三氟乙酸、9％体积比的乙腈和90％体积比的去离子水的离心管中，37℃富集30min；用0.5％体积比的磷酸、14.5％体积比的去离子水和85％体积比的乙腈的缓冲液充分洗涤并离心分离3次；加入10μL50％体积比的乙腈和50％体积比的去离子水的洗脱液，37℃洗脱30min，离心分离获取上清液；
(3)质谱分析：取1μL步骤(2)所得的洗脱液点靶，用DHB作为基质进行质谱分析，图6是葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点富集混合蛋白(BSA:HRP＝1000:1)中的糖肽的质谱图。
由实施例3及图6可知，利用BSA作为干扰蛋白，通过改变HRP酶解物和BSA的质量比研究了葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的选择性，在未经富集直接检测的情况下，获得的质谱图中显示没有检测到糖肽。在使用葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点特异性富集糖肽后，当HRP酶解物与BSA的质量比为1:1000时，纳米球依旧富集到了10个糖肽，表明葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点对糖肽具有良好的选择性，且可以从半复杂样品中捕获糖肽。
且可以通过从HRP酶解物中富集糖肽研究了探针的可重复利用性，该实验共重复15次，在每个循环之前，使用脱附缓冲液和上样缓冲液洗涤纳米球，尽管葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点已经重复使用15次，但其富集能力几乎与最初时相同，表明葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点具有良好的可重复利用性。
实施例4
葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点在富集HRP中糖肽的负载分析；
(1)称取0.25mg,0.5mg,0.75mg,1mg,1.5mg的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点；
(2)富集：将步骤(1)的不同量的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点分别分散到100μL的糖肽的1％体积比的三氟乙酸、9％体积比的乙腈和90％体积比的去离子水的离心管中，分别加入0.1mgHRP，37℃富集30min；分别用0.5％体积比的磷酸、14.5％体积比的去离子水和85％体积比的乙腈的缓冲液充分洗涤并离心分离3次；分别加入10μL50％体积比的乙腈和50％体积比的去离子水的洗脱液，37℃洗脱30min，离心分离获取上清液；
(3)质谱分析：取1μL步骤(2)所得的5种洗脱液点靶，用DHB作为基质进行质谱分析，质谱图如图7所示，计算得出该纳米材料对于糖肽的负载量为100mg/g。
由实施例4及图7可知，通过使用不同量(0.25mg-1.25mg)的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点从相同量的HRP(0.1mg)酶解物溶液中富集糖肽，通过三个平行测试，评估三个突出的糖肽峰的强度，研究了葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点对糖肽的负载量。如图7a所示，三种糖肽(m/z＝3672、4223、4985)的峰强度随着材料数量的增加而增加。当材料量为1mg时，三个糖肽峰的强度达到峰值。虽然材料的数量增加，但糖肽峰的强度没有明显变化。对富集后的上清液再次进行富集和检测，以验证糖肽的富集是否达到容量。如图7b的质谱图所示，当物质的量为0.75mg时，仍有几个糖肽峰。相反，当材料量为1mg或1.5mg时，上清液中未检测到糖肽峰(图7c，d)，这证实了1mg材料被0.1mgHRP富集至饱和。通过HRP的量(0.1mg)除以饱和富集下材料的量(1mg)，葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点对糖肽的负载能力经计算约为100mg/g。
实施例5
葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点在富集人血清中的糖肽的应用；
(1)试样的准备：获得的人血清先用二硫苏糖醇和碘乙酰胺还原烷基化，然后在37℃酶解16h；
(2)富集：0.5mg葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点分散到100μL含有步骤(1)的糖肽的1％体积比的三氟乙酸、9％体积比的乙腈和90％体积比的去离子水的离心管中，37℃富集30min；用0.5％体积比的磷酸、14.5％体积比的去离子水和85％体积比的乙腈的缓冲液充分洗涤并离心分离3次；加入10μL50％体积比的乙腈和50％体积比的去离子水的洗脱液，37℃洗脱30min，离心分离获取上清液；
(3)质谱分析：收集步骤(2)所得的洗脱液，在37℃下去糖基化16h，脱盐冻干并进行nanoLC-MS/MS检测，所得数据的维恩图和肽段序列频率图如图8所示。
由实施例5及图8可知，使用健康人血清胰蛋白酶消化物和糖尿病血清胰蛋白酶消化物作为典型复杂生物样品进行富集。图8a为从健康人血清胰蛋白酶消化物和糖尿病患者血清胰蛋白酶消化物中富集和鉴定的糖肽、糖基化位点和糖蛋白数量的维恩图，从而研究健康人和糖尿病患者之间糖基化蛋白的差异。由图8a可知，从健康人血清胰蛋白酶消化物中鉴定出可归因于76种糖蛋白的139种N-糖肽和124个糖基化位点，而从糖尿病患者血清胰蛋白酶消化物中鉴定出可归因于54种糖蛋白的100种N-糖肽和83个糖基化位点。为了研究健康人和糖尿病患者之间有价值的差异，我们对获得的糖基化位点的主要基序构象进行了评估。将氨基酸序列的N端到C端比对后，以糖基化位点(N)为中心进行序列分析，如图8b所示。对N-糖基化位点周围的氨基酸频率进行分析，如图8c所示，nXT、nXS和nXC为N-糖基化位点周围的氨基酸序列。健康人血清胰蛋白酶消化物中富集和鉴定的糖肽的三个基序频率分别为56.12％(nXT)、41.01％(nXS)和2.88％(nXC)，糖尿病患者血清胰蛋白酶消化物中富集和鉴定的糖肽的三个基序频率分别为61.90％(nXT)、37.14％(nXS)和0.95％(nXC)。结果表明，葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点可应用于复杂的实际样品中，在糖蛋白组学应用中具有良好的应用前景。
实施例1-5，均通过一锅法工艺，以硫酸锌、氯化锰和硫化钠为前体，以D-葡萄糖-6-磷酸钠盐(G6PNa2)为修饰物，制备了一种葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点纳米材料，合成过程简便且安全；且功能化修改已集成到一个步骤的过程中，在室温下螯合葡萄糖-6-磷酸后，对糖肽表现出超高的特异性和选择性，这表明了其在糖尿病标志物研究中具有良好的前景。
实施例6
葡萄糖-6-磷酸的磁性锰掺杂硫化锌量子点的合成：
S1：1)将0.01mol六水氯化铁、120mL乙二醇超声搅拌，加入7.2g无水乙酸钠搅拌30min；转移至带有聚四氟乙烯内衬的水热反应釜中，195℃保温15h，冷却至25℃，通过磁分离，依次用去离子水、乙醇洗涤3次，真空干燥，得到磁性四氧化三铁；
2)400mg多巴胺盐酸盐加入30mL去离子水得到溶液A；将0.25mmol三羟甲基氨基甲烷和100mg磁性四氧化三铁加入30mL离子水与30mL乙醇混合溶液中得到溶液B；将溶液A和B混合，25℃下搅拌16h；通过磁分离，依次用去离子水、乙醇洗涤3次，真空干燥，得到多巴胺改性磁性四氧化三铁；
3)在超声作用下将100mg多巴胺改性磁性四氧化三铁、75mL异丙醇混合搅拌；加入0.06mL三乙胺搅拌2min，得到三乙胺混合溶液加入容量为250mL的三颈烧瓶；取1.8g的七水硫酸锌和0.1g的四水氯化锰溶于20mL去离子水中，倒入三颈烧瓶，并在氮气保护下搅拌30min；取1.5g的九水硫化钠溶于5mL去离子水，加入三颈烧瓶中，并继续搅拌30min，得到葡萄糖-6-磷酸的磁性锰掺杂硫化锌量子点；
S2：取500mg葡萄糖-6-磷酸二钠溶解于含有75mL乙腈、150μL三氟乙酸和50mL去离子水的混合溶液，加入步骤S1的三颈烧瓶中，并在25℃搅拌6h；
S3：将步骤S2所得的产物用去离子水和乙醇充分洗涤，并在真空干燥器中50℃干燥过夜，得到葡萄糖-6-磷酸的磁性锰掺杂硫化锌量子点。
实施例6的性能测试：
1、糖肽的负载量：通过使用不同量(0.25mg-1.25mg)的葡萄糖-6-磷酸的磁性锰掺杂硫化锌量子点从相同量的HRP酶解物溶液中富集糖肽；
2、富集糖肽的可重复利用性：通过从HRP酶解物中富集糖肽研究了葡萄糖-6-磷酸的磁性锰掺杂硫化锌量子点的可重复利用性；
3、富集磷酸肽的能力：利用0.8pmol/μL的β-casein酶解物中检测富集磷酸肽的能力；
4、磷酸肽的检出限和选择性：降低β-casein酶解物的含量，测试磷酸肽信号，当β-casein酶解物与BSA的摩尔比为到1:1000后测试磷酸肽信号；
5、富集磷酸肽的可重复利用性：利用0.8pmol/μL的β-casein酶解物进行循环试验；
6、同时富集糖肽和磷酸肽的能力：利用含有HRP酶解物和β-casein酶解物混合物，在吸附过程中采用上样缓冲液，在洗涤过程中采用洗涤缓冲液，在分步脱附过程中先后采用体积比为3:7的乙腈与去离子水组成的洗涤缓冲液和0.3mol/L氨水溶液进行洗脱，在同时脱附过程中采用0.4mol/L氨水溶液进行洗脱，检测糖肽和磷酸肽的信号。
表1
由表1可知，实施例6的葡萄糖-6-磷酸的磁性锰掺杂硫化锌量子点对糖肽的负载量为300mg/g；对糖肽的可重复利用性实验共重复20次，在每个循环之前，使用脱附缓冲液和上样缓冲液洗涤纳米球，尽管葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点已经重复使用20次，但其富集能力几乎与最初时相同，表明葡萄糖-6-磷酸的磁性锰掺杂硫化锌量子点具有优秀的可重复利用性。
未经纳米球富集时，从0.8pmol/μL的β-casein酶解物中检测到1个强度极低的磷酸肽的信号，在使用实施例6制备的葡萄糖-6-磷酸的磁性锰掺杂硫化锌量子点特异性富集磷酸肽后，会出现了9条磷酸肽的信号，磷酸肽的信号占据主导谱，说明葡萄糖-6-磷酸的磁性锰掺杂硫化锌量子点具有优异的富集磷酸肽的能力。
当β-casein酶解物的含量低至0.015fmol/μL，实施例6中依然捕捉到了4个磷酸肽，表明对磷酸肽具有较低的检出限，当β-casein酶解物与BSA的摩尔比为到1:1000后，虽然存在较强的非磷酸肽的干扰，但仍捕捉到了4个磷酸肽，表明对磷酸肽具有优秀的选择性。
0.8pmol/μL的β-casein酶解物中共进行了20次循环，实施例6将进行过20次磷酸肽富集循环的纳米球再次用于选择性捕捉磷酸肽，结果与未进行磷酸肽富集而直接选择性捕捉磷酸肽的结果类似，表明探针表面的G6PNa2在磷酸肽富集的洗脱过程中并未被洗掉，表明具有优秀的可重复利用性。
在直接检测含有HRP酶解物和β-casein酶解物混合物的情况下，非磷酸肽和非糖肽的信号占主导，磷酸肽和糖肽峰少且丰度极低，实施例6的在经过同时富集并分步脱附后，出现24个糖肽和9个磷酸肽的信号并占据主导谱，说明具有良好的同时富集糖肽和磷酸肽的能力。
以上所述仅为本发明的为实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图所做的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括以下步骤：
S1：将七水硫酸锌和四水氯化锰、去离子水混合，在氮气氛围下搅拌30-40min；加入九水硫化钠和去离子水混合溶液，并继续搅拌30-40min，得到锰掺杂硫化锌量子点；
S2：将葡萄糖-6-磷酸二钠溶解于含有乙腈、三氟乙酸和去离子水的混合溶液中，加入锰掺杂硫化锌量子点，并在18-25℃搅拌6h；
S3：将步骤S2所得的产物用去离子水和乙醇洗涤，真空干燥后得到葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成方法，其特征在于，七水硫酸锌和四水氯化锰的质量比为18:1；七水硫酸锌和九水硫化钠的质量比为18:15。
3.根据权利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成方法，其特征在于，七水硫酸锌的浓度为0.3125mol/L，四水氯化锰的浓度为0.025mol/L，九水硫化钠的浓度为1.25mol/L。
4.根据权利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成方法，其特征在于，步骤S2中葡萄糖-6-磷酸二钠与去离子水的质量体积比为10mg:1mL；步骤S2中乙腈、三氟乙酸和去离子水的体积比为15:0.03:10。
5.根据权利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成方法，其特征在于，锰掺杂硫化锌量子点为磁性锰掺杂硫化锌量子点，制备方法包括以下步骤：
1)将六水氯化铁、乙二醇超声搅拌，加入无水乙酸钠搅拌30min；转移至带有聚四氟乙烯内衬的水热反应釜中，190-195℃保温15h，冷却至18-25℃，通过磁分离，依次用去离子水、乙醇洗涤3-5次，真空干燥，得到磁性四氧化三铁；
2)多巴胺盐酸盐加入去离子水得到溶液A；将三羟甲基氨基甲烷和磁性四氧化三铁加入离子水与乙醇混合溶液中得到溶液B；将溶液A和B混合，18-25℃下搅拌16h；通过磁分离，依次用去离子水、乙醇洗涤3-5次，真空干燥，得到多巴胺改性磁性四氧化三铁；
3)在超声作用下将多巴胺改性磁性四氧化三铁、异丙醇混合搅拌；加入三乙胺搅拌2min得到三乙胺混合溶液；将七水硫酸锌和四水氯化锰、去离子水混合搅拌，在氮气氛围下搅拌30min，加入将九水硫化钠、去离子水混合搅拌30min，转移入三乙胺混合溶液，190-195℃保温10h；通过磁分离技术得到磁性锰掺杂硫化锌量子点，乙醇洗涤后真空干燥。
6.根据权利要求5所述的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成方法，其特征在于，步骤1)中六水氯化铁、无水乙酸钠、乙二醇的摩尔体积比为0.01mol:0.088mol:120mL。
7.根据权利要求5所述的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的合成方法，其特征在于，多巴胺盐酸盐和磁性四氧化三铁的质量比为4:1；三羟甲基氨基甲烷与磁性四氧化三铁的摩尔比为0.25:0.43；多巴胺改性磁性四氧化三铁、异丙醇的质量体积比为100mg:75mL；步骤3)中硫酸锌和四水氯化锰的质量比为18:1；步骤3)中七水硫酸锌和九水硫化钠的质量比为18:15。
8.根据权利要求1-7任一项所述的合成方法合成的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的应用，其特征在于，用于寻找糖尿病标志物的方法，具体步骤如下：将三氟乙酸、乙腈和去离子水按照体积比为1:9:99配置成上样缓冲液，将葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点、上样缓冲液、目标糖基化肽段溶液在37℃下孵育30min；用磷酸、去离子水和乙腈混合的缓冲混合液进行洗涤，然后加入去离子水和乙腈混合的洗脱缓冲液，37℃下洗脱30min，离心分离获取上清液，进行MALDI-TOFMS或nanoLC-MS/MS检测。
9.根据权利要求8所述的合成方法合成的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的应用，其特征在于，缓冲混合液由0.5％体积比的磷酸、14.5％体积比的去离子水和85％体积比的乙腈组成。
10.根据权利要求8所述合成方法合成的葡萄糖-6-磷酸的锰掺杂硫化锌量子点的应用，其特征在于，洗脱缓冲液由乙腈和去离子水按照体积比1:1组成。
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