CN109855929B - 一种多模式捕获、连续强洗脱糖基化肽和磷酸化肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种多模式捕获、连续强洗脱糖基化肽和磷酸化肽的方法，具体步骤如下，将修饰了钛离子和半胱氨酸的强磁响应性纳米材料与富集缓冲溶液配成分散液，将其与目标糖基化肽段、标准磷酸化肽段混合孵育40‑50分钟。在磁铁的辅助下，用富集缓冲液将材料清洗，以乙腈体积占比为1%‑80%，三氟乙酸为0.1%‑5%的体系作为洗脱液Ⅰ，再以体积比为1%‑10%氨水作为洗脱液Ⅱ，两个洗脱液分别点靶并混合点靶，进行质谱分析。本发明可以实现同时大规模鉴定糖基化蛋白质和磷酸化肽蛋白质，在翻译后修饰蛋白质组学中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于将新型多功能基团磁性纳米材料用于分析糖基化肽和磷酸化肽的方法，具体涉及一种双特异性多模式捕获、两步连续强洗脱糖基化肽和磷酸化肽的方法，尤其涉及一种基于金属离子修饰的亲水磁性纳米材料双特异性多模式分离提纯并连续高强度洗脱糖基化肽和磷酸化肽的方法。
背景技术
磷酸化蛋白组学和糖基化蛋白组学是两种非常重要的蛋白质翻译后修饰组学，在生物体生命活动中发挥重要作用。其中，蛋白质磷酸化与细胞转化、代谢途径和信号传导息息相关，同样，蛋白质糖基化也在一系列蛋白折叠，受体活化和细胞内运输中起到重要作用。在较为复杂的生物样品中，天然的糖蛋白和磷酸化蛋白相对含量低，此外，糖基化还具有微相上的不均一性，尤其表现在糖链的结构和组成多样化。结合近年来发展的基质辅助激光解析电离的高通量质谱技术，糖基化肽段和磷酸化肽段的检测虽得到了进一步发展，但仍受到离子化效率低以及大量干扰蛋白及肽段的影响，很难对其进行分析。
近年来，研究者们发展了多种糖基化肽段和磷酸化肽段的分离富集方法，已较为有效的结合质谱技术进行糖基化肽和磷酸化肽的分析检测。目前，糖基化肽段的富集原理主要有亲水富集法、硼酸化学法和肼化学法等，磷酸化肽段的富集方法原理主要有固定金属离子亲和色谱法、金属氧化物亲和色谱法等。由于生物样品珍贵稀少，亟待多功能的材料可以双特异性的同时捕获磷酸化肽和糖基化肽，对于共修饰的肽段或具有更好的识别能力，若只选择性的富集一种后修饰肽段，则会造成另一种后修饰肽段上信息的丢失。根据报道，氨基修饰的纳米磁珠由于其酸碱条件下电性变化，可以用来富集磷酸化肽，其亲水性可以富集糖基化肽，但基于一种基团捕获两种后修饰的肽段，其负载量和选择性或具有一定的局限，而基于多官能团、多模式捕获磷酸化肽和糖基化肽的材料仍有待发展。
发明内容
本发明提出了一种双特异性多模式捕获、两步连续强洗脱糖基化肽和磷酸化肽的方法，首次合成了修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料并将其用于糖基化肽和磷酸化肽的富集分析中。钛离子和半胱氨酸在富集体系中可以分别捕获磷酸化肽和糖基化肽，并在外加强磁铁的帮助下携带目标物快速从复杂的样品体系中分离出来，洗脱液Ⅰ中糖基化肽占主要成分，在洗脱液Ⅱ中磷酸化肽占主要成分，多步洗脱使得所捕获的肽段较完全的洗脱下来，并进行MALDI测试。本发明目的在于提供一种金属离子修饰的亲水磁性纳米材料的合成方法及其在糖基化肽段和磷酸化肽段双特异性富集提纯并多步洗脱中的应用。
本发明提供一种双特异性多模式捕获、两步连续强洗脱糖基化肽和磷酸化肽的方法，具体步骤如下，称取10mg修饰钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料与1mL的富集缓冲液配置材料分散液，取8-15μL该材料分散液和目标糖基化肽段、磷酸化肽段混合在37℃下孵育40-50分钟，在磁铁的作用下，利用富集缓冲液洗涤材料，用洗脱液Ⅰ、洗脱液Ⅱ洗脱，将洗脱液Ⅰ、洗脱液Ⅱ分别点靶，再将洗脱液Ⅰ、洗脱液Ⅱ混合点靶，分别进行质谱分析；
其中，富集缓冲液为含有体积比85%-95%乙腈和体积比为0.1%-5%三氟乙酸；
洗脱液Ⅰ为含有1%-80%乙腈体积比和为0.1%-5%三氟乙酸（甲酸）体积比的缓冲溶液；
洗脱液Ⅱ是含有体积比为1-10%的氨水。
本发明中，所述的修饰钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料的合成方法，具体步骤如下：
（1）将六水合三氯化铁充分溶解于乙二醇里，加入无水醋酸钠，经过超声搅拌后，转移至反应釜中，在100-450℃下加热10-20小时，反应完毕后，待反应釜冷却到室温，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，并于30-60℃真空干燥；
（2）将步骤（1）中所得产物超声分散在含有三羟甲基氨基甲烷和多巴胺盐酸盐的溶剂中，常温下搅拌3-20小时，待反应结束，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，并于30-60℃真空干燥；
（3）将步骤（2）中所得产物超声分散在含有氯金酸的水溶液中，在50-95℃水浴搅拌下，反应经过3-15小时，待温度降低到常温，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，并于30-60℃真空干燥；
（4）将步骤（3）中所得产物超声分散在含有硫酸钛的水溶液中，在常温下搅拌0.5-5小时，将所得产物用去离子水和无水乙醇充分洗涤，并于30-60℃真空干燥；
（5）将步骤（4）中所得产物超声分散在含有半胱氨酸的水溶液中，在常温下搅拌5-30小时，将所得产物用去离子水和无水乙醇充分洗涤，并于30-60℃真空干燥。
本发明中，步骤（2）中的溶剂为乙醇，去离子水或乙醇/水混合溶液中的一种或几种。
本发明中，步骤（2）中步骤（1）所得产物与三羟甲基氨基甲烷的质量比为10:1-1:5，步骤（2）中步骤（1）所得产物与多巴胺盐酸盐的质量比为1:1-1:10。
本发明中，步骤（3）中步骤（2）所得产物与氯金酸的质量比为4:1-1:2。
本发明中，步骤（3）中的产物与步骤（4）中的硫酸钛的质量比为1:500-1:200。
本发明中，步骤（4）中的产物与步骤（5）中的半胱氨酸的质量比为1:50-2:1。
本发明所述的双特异性多模式捕获、两步连续强洗脱糖基化肽和磷酸化肽的方法具有以下优点：
１、修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料具有良好的磁响应性和亲水性，与目标性糖基化肽和磷酸化肽有强烈的相互作用，可以在较为复杂的标准蛋白酶解液中灵敏度高，选择性高的分别富集糖基化肽和磷酸化肽。
２、修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料应用于标准蛋白酶解中，通过调控富集体系，可同时捕获磷酸化肽和糖基化肽，通过调控洗脱体系，并利用洗脱液Ⅰ、Ⅱ多步洗脱磷酸化肽和糖基化肽，实现了较为有效的分离洗脱。MALDI分析中，洗脱液Ⅰ、Ⅱ分别点靶，并且混合点靶。
３、修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料应用于蛋白质翻译后修饰的研究中，通过固定金属离子亲和色谱法和亲水相互作用同时富集磷酸化肽和糖基化肽两种蛋白质后修饰肽段，并结合nano-LC MS/MS可以大规模鉴定磷酸化蛋白和糖基化蛋白，并进一步确定磷酸化位点和糖基化位点。
附图说明
图1为实施例1的修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料的透射电子显微镜照片；
图2为实施例1的修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料的磁滞回线示意图；
图3为实施例1的经各步修饰的强磁响应性纳米材料的傅里叶红外曲线示意图。其中，线a是Fe3O4@PDA的傅里叶红外曲线示意图，线b是Fe3O4@PDA@Au的傅里叶红外曲线示意图，线c是Fe3O4@PDA@Au@Ti4+@L-Cys的傅里叶红外曲线示意图；
图4为实施例2的修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料对100fmol/μL标准糖基化蛋白HRP酶解液中糖肽进行分离富集的质谱图。其中，图A是未经富集的HRP酶解液图，图B是实施示例1中材料富集后的糖基化肽段的质谱图。
图5为实施例3的修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料对100fmol/μL标准磷酸化蛋白β-casein酶解液中磷酸化肽进行分离富集的质谱图。其中，图A是未经富集的β-casein酶解液图，图B是实施示例1材料富集后的磷酸化肽段的质谱图。
图6为实施例4的修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料对100fmol/μL标准糖基化蛋白HRP和标准磷酸化蛋白β-casein酶解液中糖基化肽和磷酸化肽进行同时富集并分步洗脱的质谱图。其中，图A是未经富集的HRP和β-casein酶解液图，图B是实施示例1中材料富集后的洗脱液Ⅰ中肽段的质谱图，图C是实施示例1中材料富集后的洗脱液Ⅱ中肽段的质谱图。图D是洗脱液Ⅰ和洗脱液Ⅱ混合点靶的质谱图。
图7为实施例5的修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料对1fmol/μL标准糖基化蛋白HRP和标准磷酸化蛋白β-casein混合酶解液中糖基化肽和磷酸化肽进行分离富集的质谱图。其中，图A是经本材料富集后的洗脱液Ⅰ中肽段的质谱图，图B是经本材料富集后的洗脱液Ⅱ中肽段的质谱图。
图8为实施例6的修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料对100fmol/μL标准磷酸化蛋白β-casein酶解液中磷酸化肽进行分离富集的质谱图。其中，图A是实施示例6中材料富集后的糖基化肽的质谱图，图B是实施示例6中材料富集后的磷酸化肽的质谱图。
具体实施方式
本发明利用修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料与糖基化肽和磷酸化肽的相互作用实现对两种翻译后修饰的同时捕获并多步洗脱，以下介绍具体实施方式。
实施例1：修饰钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料的合成
（１）称取1.35 g FeCl3·6H2O通过磁力搅拌溶解在75 mL的乙二醇中，至溶液澄清后加入3.6 g NaAc,继续搅拌后超声10 min，转移至水热反应釜中，在200 ℃下加热16 h，待反应釜冷却后，用去离子水和无水乙醇分别清洗三次，在50 ℃下真空干燥；
（２）将（1）中所得产物称取100 mg超声分散在200 mL乙醇中，称取0.117 g三羟甲基氨基甲烷溶解在100 mL水中，加入超声的产物中，在搅拌过程中加入溶解在150 mL水中的0.32 g的多巴胺盐酸盐，经常温下搅拌10 h，用去离子水和无水乙醇分别清洗三次，在50℃下真空干燥。
（３）将（2）中所得产物超声分散在92 mL水中，在搅拌的条件下油浴升温至70 ℃，滴入8 mL、1 mg/mL HAuCl4溶液，继续反应10 h，停止加热，待温度降至常温，用去离子水和无水乙醇分别清洗三次，在50℃下真空干燥。
（４）将（3）中所得产物超声分散在100 mL水中，在搅拌的过程中加入溶解6 g Ti(SO4)2的400 mL水，在常温下搅拌2h，用去离子水和无水乙醇分别清洗三次，在50 ℃下真空干燥。
（５）将（4）中所得产物超声分散在10 mL水中，在搅拌的过程中加入溶解0.7 g L-Cys的20 mL水，在常温下搅拌20 h，用去离子水和无水乙醇分别清洗三次，在50 ℃下真空干燥。
将制得的修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料用透射电子显微镜检测，检测条件是：200 kV工作电压下，取少量干燥的材料均匀分散在无水乙醇中，并滴加在铜网上，干燥后插入仪器抽真空，在200纳米比例尺下观察透射电子显微镜图，检测结果如图1所示。将制得的修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料用傅利叶红外光谱仪检测，检测条件是：将材料与KBr压片制成半透明薄膜，扣除背景后插入测试槽，在4000cm-1到400cm-1的范围内扫描，检测结果如图3所示。
图2为修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料磁滞回线示意图。
图3为修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料傅里叶红外曲线示意图。
实施例2：将实施例1得到的修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料作为固相吸附相用于糖蛋白HRP酶解产物中糖基化肽的分离富集
（１）试样的制备：1 mg HRP在25 mM NH4HCO3溶液中经37℃酶解16h。
（２）称取10mg修饰钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料与1mL的富集缓冲液配置成材料分散液，富集缓冲液为含有体积比85%-95%乙腈和体积比为0.1%-5%三氟乙酸（甲酸）的缓冲溶液；将100 μg修饰钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料分散在100 μL含有100 fmoL/μL步骤（1）的HRP酶解产物的富集体系中，在37℃下孵育40min。在磁铁的作用下，用300 μL富集缓冲液分三次冲洗样品。用10 μL ACN/H2O/TFA （50/49.9/0.1，v/v/v）洗脱30 min。
（３）质谱分析：取1 μL步骤（2）中的洗脱液点靶，在常温下干燥后送入质谱分析，所得图谱如图4所示。
分析结果：由图4可得，HRP酶解产物中的糖基化肽被本材料捕获，而原液中的非糖肽所造成的干扰可以看到被消除了大部分。
实施例3：将实施例1所得的修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料作为固相吸附相用于磷酸化蛋白β-casein酶解产物中磷酸化肽的分离富集。
（１）试样的制备：1mg β-casein在25 mM NH4HCO3溶液中经37℃酶解16h。
（２）称取10mg修饰钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料与1mL的富集缓冲液配置成材料分散液，富集缓冲液为含有体积比85%-95%乙腈和体积比为0.1%-5%三氟乙酸（甲酸）的缓冲溶液；将100 μg修饰钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料分散在在100 μL含有100 fmoL/μL步骤（1）的β-casein酶解产物的富集体系中，在37 ℃下孵育40 min。在磁铁的作用下，用300 μL富集缓冲液分三次冲洗样品。用10 μL 1%的氨水洗脱30 min。
（３）质谱分析：取1 μL步骤（2）中的洗脱液点靶，在常温下干燥后送入质谱分析，所得图谱如图5所示。
分析结果：由图5可得，β-casein酶解产物中的磷酸化肽被本材料捕获，而原液中的非磷酸化肽造成的干扰可以看到被削除了大部分。
实施例4：将实施例1所得的修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料作为固相吸附相用于糖蛋白HRP酶解产物中糖基化肽和磷酸化蛋白β-casein酶解产物中磷酸化肽的同时捕获和多步洗脱。
（１）试样的制备：1mg β-casein在25 mM NH4HCO3溶液中经37℃酶解16h，1mg HRP在25 mM NH4HCO3溶液中经37℃酶解16h。
（２）称取10mg修饰钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料与1mL的富集缓冲液配置成材料分散液，富集缓冲液为含有体积比85%-95%乙腈和体积比为0.1%-5%三氟乙酸（甲酸）的缓冲溶液；将150 μg 修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料分散在100 μL 含有100 fmol/μL 的HRP酶解产物和β-casein酶解产物的富集体系中，在37 ℃条件下孵育40min。在磁铁的作用下，用100 μL 富集体系清洗样品三次。用10 μL 的ACN/H2O/TFA （50/49.9/0.1，v/v/v）洗脱30min，得洗脱液Ⅰ，用10 μL的1%的氨水洗脱30 min，得洗脱液Ⅱ。
（３）质谱分析：取1 μL步骤（2）中的洗脱液Ⅰ、Ⅱ分别点靶，并混合点靶，在常温下干燥后送入质谱分析，所得图谱如图6所示。
分析结果：由图6可得，β-casein酶解产物中的磷酸化肽和HRP酶解产物中的糖基化肽被本材料捕获，而原液中的非磷酸化肽和非糖基化肽造成的干扰可以看到被削除了大部分。对比单独富集β-casein和HRP的富集效果，可发现共捕获、连续强洗脱的流程检测到更多的磷酸化肽条数。
实施例5：将实施例1中得到的修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料作为固相吸附相用于糖蛋白HRP酶解产物中糖基化肽和磷酸化蛋白β-casein酶解产物中磷酸化肽的检测限实验中。
（１）称取10mg修饰钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料与1mL的富集缓冲液配置成材料分散液，富集缓冲液为含有体积比85%-95%乙腈和体积比为0.1%-5%三氟乙酸（甲酸）的缓冲溶液；将150 μg 修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料分散在100 μL 含有1 fmol/μL 的HRP酶解产物和β-casein 酶解产物的富集体系中，在37℃环境下孵育40 min。在磁铁的作用下，用300 μL 富集缓冲液分三次洗涤样品。用10 μL 的ACN/H2O/TFA （50/49.9/0.1，v/v/v）洗脱30min，得洗脱液Ⅰ，用10 μL的1%的氨水洗脱30min，得洗脱液Ⅱ。
（２）质谱分析：取1 μL 步骤（1）中的洗脱液Ⅰ和洗脱液Ⅱ分别点靶，在常温下干燥后送入质谱分析，质谱图如图7所示。
分析结果：由图7可以看出，在酶解液浓度降低至1 fmol/μL 条件下，本材料仍能富集到糖基化肽和磷酸化肽，说明本材料对糖基化肽和磷酸化肽在低浓度条件下仍有较好的富集能力。
实施例6：修饰了钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料的合成
（１）称取1.35 g FeCl3·6H2O通过磁力搅拌溶解在75 mL的乙二醇中，至溶液澄清后加入3.6 g NaAc,继续搅拌后超声10 min，转移至水热反应釜中，在200 ℃下加热16 h，待反应釜冷却后，用去离子水和无水乙醇分别清洗三次，在50 ℃下真空干燥；
（２）将（1）中所得产物称取100 mg超声分散在200 mL乙醇中，称取0.117 g三羟甲基氨基甲烷溶解在100 mL水中，加入超声的产物中，在搅拌过程中加入溶解在150 mL水中的0.32 g的多巴胺盐酸盐，经常温下搅拌10 h，用去离子水和无水乙醇分别清洗三次，在50℃下真空干燥。
（３）将（2）中所得产物超声分散在92 mL水中，在搅拌的条件下油浴升温至70 ℃，滴入8 mL、1 mg/mL HAuCl4溶液，继续反应10 h，停止加热，待温度降至常温，用去离子水和无水乙醇分别清洗三次，在50 ℃下真空干燥。
（４）将（３）中所得产物超声分散在10 mL水中，在搅拌的过程中加入溶解了0.7 gL-Cys的20 mL水，在常温下搅拌20 h，用去离子水和无水乙醇分别清洗三次，在50 ℃下真空干燥。
（５）将（４）中所得产物超声分散在100 mL水中，在搅拌的过程中加入溶解6 g Ti(SO4)2的400 mL水，在常温下搅拌2 h，用去离子水和无水乙醇分别清洗三次，在50 ℃下真空干燥。
（６）重复实施例3和实施例4中的操作步骤对以上合成的材料进行生物测试，质谱图如图8所示。
分析结果：由图8可得，HRP酶解产物中的糖基化肽一部分被本材料捕获，β-casein酶解产物中的磷酸化肽大部分可被本材料捕获，原液中的干扰肽段消除能力差。
Claims (7)
1.一种多模式捕获、连续强洗脱糖基化肽和磷酸化肽的方法，其特征在于具体步骤如下：称取10mg修饰钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料与1mL的富集缓冲液配置材料分散液，取8-15μL该材料分散液、目标糖基化肽段和磷酸化肽段在37℃下混合并孵育40-50分钟，在磁铁的作用下，利用富集缓冲液洗涤材料，用洗脱液Ⅰ、洗脱液Ⅱ洗脱，将经洗脱液Ⅰ、洗脱液Ⅱ洗脱的溶液分别点靶，再将经洗脱液Ⅰ、洗脱液Ⅱ洗脱的溶液混合点靶，分别进行质谱分析；
其中，富集缓冲液为含有体积比85%-95%乙腈和体积比0.1%-5%三氟乙酸；
洗脱液Ⅰ为含有1%-80%乙腈体积比和为0.1%-5%三氟乙酸体积比的缓冲溶液；
洗脱液Ⅱ是含有体积比为1-10%的氨水。
2.根据权利要求1所述的一种多模式捕获、连续强洗脱糖基化肽和磷酸化肽的方法，其特征在于，所述的修饰钛离子和半胱氨酸功能基团的强磁响应性纳米材料的合成方法，具体步骤如下：
（1）将六水合三氯化铁充分溶解于乙二醇里，加入无水醋酸钠，经过超声搅拌后，转移至反应釜中，在100-450℃下加热10-20小时，反应完毕后，待反应釜冷却到室温，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，并于30-60℃真空干燥；
（2）将步骤（1）中所得产物超声分散在含有三羟甲基氨基甲烷和多巴胺盐酸盐的溶剂中，常温下搅拌3-20小时，待反应结束，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，并于30-60℃真空干燥；
（3）将步骤（2）中所得产物超声分散在含有氯金酸的水溶液中，在50-95℃水浴搅拌下，反应经过3-15小时，待温度降低到常温，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，并于30-60℃真空干燥；
（4）将步骤（3）中所得产物超声分散在含有硫酸钛的水溶液中，在常温下搅拌0.5-5小时，将所得产物用去离子水和无水乙醇充分洗涤，并于30-60℃真空干燥；
（5）将步骤（4）中所得产物超声分散在含有半胱氨酸的水溶液中，在常温下搅拌5-30小时，将所得产物用去离子水和无水乙醇充分洗涤，并于30-60℃真空干燥。
3.根据权利要求2所述的一种多模式捕获、连续强洗脱糖基化肽和磷酸化肽的方法，其特征在于，步骤（2）中的溶剂为乙醇，去离子水或乙醇/水混合溶液中的一种或几种。
4.根据权利要求2所述的一种多模式捕获、连续强洗脱糖基化肽和磷酸化肽的方法，其特征在于，步骤（2）中所述步骤（1）所得产物与三羟甲基氨基甲烷的质量比为10:1-1: 5，步骤（2）中所述步骤（1）所得产物与多巴胺盐酸盐的质量比为1:1-1:10。
5.根据权利要求2所述的一种多模式捕获、连续强洗脱糖基化肽和磷酸化肽的方法，其特征在于，步骤（3）中所述步骤（2）所得产物与氯金酸的质量比为4:1-1:2。
6.根据权利要求2中所述的一种多模式捕获、连续强洗脱糖基化肽和磷酸化肽的方法，其特征在于，步骤（3）中的产物与步骤（4）中的硫酸钛的质量比为1:500-1:200。
7.根据权利要求2中所述的一种多模式捕获、连续强洗脱糖基化肽和磷酸化肽的方法，其特征步骤在于步骤（4）中的产物与步骤（5）中的半胱氨酸的质量比为1:50-2:1。
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