CN103344602A - 一种基于近红外光谱的水稻种质真伪无损检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于近红外光谱的水稻种质真伪无损检测方法，包括光谱采集，光谱预处理，聚类分析。本发明是利用不同遗传背景的水稻品种籽粒中含氢基团化学物质组成和比例不同，通过近红外光谱技术建立聚类分析模型，快速无损地检测区分种子真伪。该方法优点在于检测时，水稻样品不需要预处理、无损、快速、高效、简便，结果更客观、准确。

Description

一种基于近红外光谱的水稻种质真伪无损检测方法

技术领域

本发明涉及一种水稻种质真伪检测方法，尤其涉及的是一种基于近红外光谱（NIR）的水稻种质真伪无损检测方法。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国最重要的粮食作物之一。目前我国水稻的播种面积约占粮食作物总面积1/4，产量约占全国粮食总产量1/2，商品粮1/2以上，产区遍及全国各地，水稻的品种共有五万多种。我国是最早在生产上成功利用水稻杂种优势的国家，杂交水稻在我国粮食增产中发挥越来越重要的作用，杂交水稻年使用量已达到2.5×10⁸kg左右，但同时种子的质量纠纷也越来越多，每年因种子混杂问题造成很大的经济损失。目前杂交稻包括两系和三系杂交稻，收割杂交F1种子(F1)时就可能会因为多种原因混杂假杂种，其中亲本混杂是主要原因之一，即种子中混杂有F1种子的双亲种子，影响了F1种子的纯度。种子的真伪性一般通过种子形态观察、田间种植等方法来鉴定，近年发展起了分子鉴定方法，如SSR分子标记鉴定技术。但是上述方法都存在操作繁琐、耗时长等问题。探索新的无损、快速、高效技术来鉴别F1和其双亲种子尤为重要。

近红外光谱技术近年来广泛用于农业、化工、食品、生命科学、环境保护和质量监督等领域，它的优点是快速、高效、准确、无损检测，可以满足上述要求。与常规检测方法相比，近红外光谱技术更适用于农作物的品质检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于近红外光谱的水稻种质真伪无损检测方法，通过近红外光谱进行快速的检测。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

（1）建立已知水稻品种的校正集

a、光谱采集

将已知品种的种子放入样品杯，使用样品杯漫反射扫描参数，光谱扫描范围为4000～12000cm^-1，分辨率16cm^-1，扫描次数32次，作为背景光谱，背景扫描后，再对每粒种子进行扫描得到近红外漫反射光谱；

b、光谱预处理

对于近红外漫反射原光谱经过矢量归一化和二阶导数预处理后得到的最终分析光谱；

c、聚类分析

聚类分析首先通过标准法计算所有谱图间的光谱距离，将两张最小距离的谱图聚成一类，然后再计算该类与其它所有谱图的距离将最小距离的谱图再聚成一类，这个过程一直重复到只剩下一个大类；

（2）建立待测水稻品种的校正集

d、光谱采集

将待测产品的种子放入样品杯，使用样品杯漫反射扫描参数，光谱扫描范围为4000～12000cm^-1，分辨率16cm^-1，扫描次数32次，作为背景光谱，背景扫描后，再对每粒种子进行扫描得到近红外漫反射光谱；

e、光谱预处理

对于近红外漫反射原光谱经过矢量归一化和二阶导数预处理后得到的最终分析光谱；

f、聚类分析

聚类分析首先通过标准法计算所有谱图间的光谱距离，将两张最小距离的谱图聚成一类，然后再计算该类与其它所有谱图的距离将最小距离的谱图再聚成一类，这个过程一直重复到只剩下一个大类；

（3）比较校正集和预测集的分类正确率来评价水稻种质的真伪

建立已知检测种质的校正集数据库，在检测中被检测种质光谱特征落入校正集时，即预测集落入校正集时，则待测水稻为已知品种，否则判断为未知品种。

所述步骤a和d中，对每粒种子的扫描的方法为：将每粒种子在两个不同的水平位置上各扫描一次，然后将其翻转180°，使其背面在两个不同的水平位置也各扫描一次，即每粒种子共扫描四次，将四次测量的光谱求平均，作为该粒种子的近红外漫反射光谱。测量多个不同位置可以消除样品不均匀引起的散射误差。

所述步骤b和e中，平滑点数为25。矢量归一化的作用是保持光谱差的形式，利于光谱解析。二阶导数主要用于校正光谱基线，分离重叠峰，提高光谱分辨率；用导数处理时一般都会结合平滑处理，平滑可除去高频噪声的干扰，较大的平滑点数可使信噪比提高，但同时也会导致信号的失真。比较不同平滑点数对鉴别效果的影响，发现当平滑点数为25时鉴别效果最佳。

所述水稻种质为杂交水稻F1组合种子、杂交组合的双亲本或常规水稻品种。

近红外区域是指波长在780nm～2526nm范围内(波数为12820cm^-1～3959cm^-1)的电磁波，介于可见光和中红外光之间，具有波粒二象性。近红外的光子能量可以使用公式E=hv(h表示普朗克常数，v表示光的频率)描述。近红外光谱吸收是分子振动能级跃迁产生的(伴随转动能级的跃迁)，而分子振动能级跃迁包括基频跃迁，倍频跃迁以及合频跃迁。光源发出的红外光照射到由分子组成的物质上，若分子吸收红外光的能量发生振动状态变化或振动状态在不同能级间的跃迁等于近红外光谱区某波长处光子的能量，则会产生近红外光谱吸收。近红外光谱区与有机化合物以及混合物中含氢基团(C-H、N-H、O-H)振动的合频和各级倍频的吸收区一致，通过样品光谱扫描，可以得到样品中有机分子含氢基团的化学键信息，这是近红外光谱技术应用的理论基础。因为不同物质中由于含氢基团的分子含量差异，所以在近红外区的吸收光谱有各自的特征，这就使近红外光谱技术的分析应用成为可能。根据这一特点就可用于检测农产品中淀粉、蛋白质、脂肪、水分等含氢基团的有机分子含量。在农业领域该技术不但可用于谷物营养成分的分析，还适用于其他各种农副产品品质分析，如饲料、食品、蔬菜、烟叶等。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明是利用不同遗传背景的水稻品种籽粒中含氢基团化学物质组成和比例不同，通过近红外光谱技术建立聚类分析模型，快速无损地检测区分种子真伪。该方法优点在于检测时，水稻样品不需要预处理、无损、快速、高效、简便，结果更客观、准确。

附图说明

图1为采集的水稻种子的F1种子近红外漫反射原始光谱；

图2为有效光谱范围选择后的近红外漫反射光谱；

图3为光谱预处理后建立的模型校正集聚类分析树形图；

图4为F1种子、F1父本种子的模型预测集聚类分析树形图；

图5为F1种子、F1父本种子、F1母本种子的模型预测集聚类分析树形图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本实施例对近红外光谱法预测F1种子“03S/0412”，父本种子“0412”以及母本种子“03S”真伪性：取完全成熟、形态完整的F1种子“03S/0412”，父本种子“0412”以及母本种子“03S”各100粒，样品在室温下自然风干后，平衡水分。

检测的具体步骤如下：

a、光谱采集

使用仪器为德国Bruker公司MPA型傅立叶变换近红外光谱仪，配有积分球、PbS检测器和OPUS 6.5数据处理与分析软件。

使用样品杯漫反射扫描参数，光谱扫描范围为4000～12000cm^-1，分辨率16cm^-1，扫描次数32次，进行背景扫描后，将每粒种子在两个不同的水平位置上各扫描一次，然后将其翻转180°，使其背面在两个不同的水平位置也各扫描一次，即每粒种子共扫描四次，将四次测量的光谱求平均，作为该粒种子的近红外漫反射光谱。测量多个不同位置可以消除样品不均匀引起的散射误差。

b、光谱预处理

对于各个品种测定的光谱，首先进行样品统计，比较分析每一条光谱与所有样品平均光谱的差，然后结合主成分分析技术，去除离散型大、有明显异常的样品，对样品群体的代表性进行优化，经过光谱筛选,从各自100粒种子中筛选出80粒用于聚类分析方法的建立，该过程排除了如光谱采集漏光、样品霉变虫蚀或操作不当等多种干扰因素引起的不正常扫描数据。

对于近红外漫反射原光谱经过矢量归一化和二阶导数预处理后得到的光谱用于聚类分析模型，矢量归一化的作用是保持光谱差的形式，利于光谱解析。二阶导数主要用于校正光谱基线，分离重叠峰，提高光谱分辨率；用导数处理时一般都会结合平滑处理，平滑可除去高频噪声的干扰，较大的平滑点数可使信噪比提高，但同时也会导致信号的失真。比较不同平滑点数对鉴别效果的影响，发现当平滑点数为25时鉴别效果最佳。

c、聚类分析

聚类分析用于判定一系列FT-IR谱图的相似性，光谱的距离表明了谱图的相似度。聚类算法首先通过计算所有谱图间的光谱距离将两张最小距离的谱图聚成一类，然后计算该类与其它所有谱图的距离将最小距离的谱图再聚成一类，这个过程一直重复到只剩下一个大类。试验中选择标准法计算光谱距离，标准法是用欧氏距离表示光谱距离，Ward’s（离差平方和）法计算新创建类与其他类之间距离，探索建立聚类分析模型。将所有的样品按3:1划分校正集和预测集，聚类效果用校正集和预测集的分类正确率来评价。

分析近红外光谱得到样品中有机分子含氢基团的特征信息。如图1所示，图1为单粒水稻种子光谱图，在波数为8250，6850，6300，5500，5150，4700，4200cm^-1处都有吸收峰，这些吸收峰与主要有机成分如蛋白质、脂肪、淀粉和水分等有关，因为这些化合物中都有含氢基团。

图1显示光谱的扫描范围为4000～12000cm^-1，其中在8900～12000cm^-1光谱范围内几乎没有吸收信号，影响建模结果准确性。故选择4000～8900cm^-1光谱范围为分析区间，见图2。

以F1种子“03S/0412”及其父本种子“0412”为校正集。将采集的F1种子“03S/0412”和其父本种子“0412”光谱经各种预处理方法优化后所建模型，鉴别正确率均高于未经优化的原始光谱所建模型，如表1所示；比较不同平滑点数对鉴别效果的影响，发现当平滑点数为25时鉴别效果最佳；其中用“二阶导数（25点平滑）+矢量归一化”处理建立的模型最好，结果见图3，每条F1光谱都用“1”表示，每条父本光谱都用“2”表示，校正集分类正确率100%。

表1“03S/0412”和“0412”光谱经不同预处理方法处理后校正集分类正确率

用“二阶导数（25点平滑）+矢量归一化”处理建立的聚类分析模型对预测集进行预测，结果见图4，聚类模型把F1种子和其父本种子的光谱很好的区分为不同的两大类，两个种质的预测集分类正确率100%。依据待检测种质的校正集与预测集一致性差异，判断出待测的产品哪个是F1种子和其父本种子。

用该方法在此基础上加入F1母本种子“03S”进一步研究分类效果，结果显示用“03S/0412”，“0412”和“03S”建立的聚类分析模型校正集和预测集的分类正确率也均为100%，图5为其预测集聚类分析树形图，每条“03S/0412”光谱都用“1”表示，每条“0412”光谱都用“2”表示，每条“03S”光谱都用“x”表示，可见聚类模型把F1种子、其父本种子和其母本种子的光谱很好的区分为不同的三大类。

结果表明，近红外漫反射光谱法结合聚类分析可以将单粒水稻杂交F1种子，F1父本种子以及F1母本种子区分开，这也说明了近红外光谱技术能够在水稻种子品种真伪性鉴别方面发挥很大的作用。

根据本发明方法，可进行水稻品种和组合的种子真伪鉴别。进一步研究可以设计、建立一套近红外无损鉴别自动分选装置，将假种子从混合群体中分离。该方法可应用扩展到小麦、玉米、棉花等种子真伪鉴别中。

Claims (4)

1.一种基于近红外光谱的水稻种质真伪无损检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）建立已知水稻品种的校正集

a、光谱采集

将已知品种的种子放入样品杯，使用样品杯漫反射扫描参数，光谱扫描范围为4000～12000cm^-1，分辨率16cm^-1，扫描次数32次，作为背景光谱，背景扫描后，再对每粒种子进行扫描得到近红外漫反射光谱；

b、光谱预处理

对于近红外漫反射原光谱经过矢量归一化和二阶导数预处理后得到的最终分析光谱；

c、聚类分析

聚类分析首先通过标准法计算所有谱图间的光谱距离，将两张最小距离的谱图聚成一类，然后再计算该类与其它所有谱图的距离将最小距离的谱图再聚成一类，这个过程一直重复到只剩下一个大类；

（2）建立待测水稻品种的校正集

d、光谱采集

将待测产品的种子放入样品杯，使用样品杯漫反射扫描参数，光谱扫描范围为4000～12000cm^-1，分辨率16cm^-1，扫描次数32次，作为背景光谱，背景扫描后，再对每粒种子进行扫描得到近红外漫反射光谱；

e、光谱预处理

对于近红外漫反射原光谱经过矢量归一化和二阶导数预处理后得到的最终分析光谱；

f、聚类分析

聚类分析首先通过标准法计算所有谱图间的光谱距离，将两张最小距离的谱图聚成一类，然后再计算该类与其它所有谱图的距离将最小距离的谱图再聚成一类，这个过程一直重复到只剩下一个大类；

（3）比较校正集和预测集的分类正确率来评价水稻种质的真伪

建立已知检测种质的校正集数据库，在检测中被检测种质光谱特征落入校正集时，则待测水稻为已知品种，否则判断为未知品种。

2.根据权利要求1所述的一种基于近红外光谱的水稻种质真伪无损检测方法，其特征在于，所述步骤a和d中，对每粒种子的扫描的方法为：将每粒种子在两个不同的水平位置上各扫描一次，然后将其翻转180°，使其背面在两个不同的水平位置也各扫描一次，即每粒种子共扫描四次，将四次测量的光谱求平均，作为该粒种子的近红外漫反射光谱。

3.根据权利要求1所述的一种基于近红外光谱的水稻种质真伪无损检测方法，其特征在于，所述步骤b和e中，平滑点数为25。

4.根据权利要求1所述的一种基于近红外光谱的水稻种质真伪无损检测方法，其特征在于，所述水稻种质为杂交水稻F1组合种子、杂交组合的双亲本或常规水稻品种。

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