CN106338488A - 一种转基因豆奶粉的快速无损鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种转基因豆奶粉的快速无损鉴别方法，包括步骤：(1)制备转基因和非专基因豆奶粉的测试样本，利用红外光谱仪进行红外光谱数据的采集。(2)对采集的红外光谱数据采用Savitzky‑Golay平滑预处理，进行主成分分析；(3)根据预处理后的红外吸收光谱，利用PCA‑loading的方法提取特征波长；(4)分别建立红外光谱和特征波长的判别分析模型，包括PLS‑DA判别分析模型和/或SVM判别分析模型；(5)对于待测转基因豆奶粉和非转基因样本，依次通过步骤(1)‑步骤(4)，将待测样本的红外光谱，利用所述的判别分析模型来估测类别。本发明相对于传统的分子检测方法来说，无需复杂的样本预处理，而且快速、无损、精度高。

Description

一种转基因豆奶粉的快速无损鉴别方法

技术领域

本发明属于转基因食品筛查的无损检测技术领域，尤其是涉及一种转基因豆奶粉的快速无损鉴别方法。

背景技术

随着现代生物技术的发展，转基因技术的研究得到飞速发展和推广。运用转基因技术能培育高产、高抗、优质，适应不良生态环境的优良品种，大大降低了农药化肥的施用量，有利于环境保护。然而，不能忽略的是，先进科学技术的不确定性使得转基因技术成为一把“双刃剑”。转基因食品与传统食品最主要的区别在于前者含有用基因工程技术导入的外源基因，并由其表达特定的外源蛋白质。近年来，转基因作物对生态环境的影响和转基因食品的食用安全性问题成为人们关注的焦点。从国际经验来看，各国政府管理部门对转基因产品采取了审慎的态度，实施系统、高效的转基因安全管理也是我国一个紧急而重大的战略性选择。其中的一项重要内容，就是加强转基因产品检测技术研究，以通过监督检查标识规范市场秩序。传统的转基因检测主要是针对转基因作物及其相关制品的外源DNA和蛋白质进行的，这些方法虽然具有较高的准确性和灵敏度，但是在制备检测所需DNA及蛋白质的样品时均需要对转基因作物极其加工品进行破坏提取，而且费时费力，程序复杂，成本较高，非专业人员难以胜任。转基因食物经过不同的加工程序(研磨、加热、微波、酸碱度、微生物发酵等)，其外源蛋白和外源基因会发生不同程度降解和断裂，从而影响到转基因成分在最终产品中的含量和作用，所以在分析评估转基因食品安全问题时需要充分考虑到食品加工过程。

我国是大豆的主要生产国，大豆资源的数量在社会上占有很大的比例。大豆是高蛋白食品，具有丰富的营养价值，在现代人们的生活中起到很重要的作用。大豆的成分中含有40％左右的蛋白质，17％的碳水化合物，具有多种维生素，而脂肪的含量较低，只有18％左右，因此，在人们的日常生活中，优质大豆制品能补充人体所需的营养成分，大豆制品的使用比较多，也在很大程度上促进了大豆种植业以及大豆制品的快速发展。作为市面上的豆奶系列产品不时被质疑为转基因大豆制品。因此寻求更好的无损鉴别方法来快速检测大豆制品中是否存在转基因成分，保障消费者的知情权，成为当务之急。

红外光谱可以捕捉到与基因变异相关的蛋白质分子的吸收光谱信息，这是因为蛋白质分子中含有大量的含氢基团X-H，红外光谱反映含氢基团的能量吸收信息，因此也就具备了捕捉农作物基因变异分子吸收信息的能力和进一步判断识别转基因与非转基因的理论基础。组成分子的各种基团都有自己特定的红外特征吸收峰，可以据此实现分子中某些化学键和官能团的“指纹鉴别”。随着光谱技术的发展和成熟，红外光谱的这一特性为转基因农产品的鉴别提供了一条有效的新途径。

发明内容

鉴于原有分子转基因检测的利弊现状，本发明应用红外光谱技术结合化学计量学方法对转基因豆奶粉进行鉴别，识别的精度高，为高效的转基因安全管理提供切实有效的检测手段。

为了实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

一种转基因豆奶粉的快速无损鉴别方法，包括步骤：

S1：获得转基因豆奶和非转基因豆奶在400cm^-1～4000cm^-1波数范围内的红外吸收光谱信息；

S2：采用Savitzky-Golay平滑(SG)预处理，进行主成分(PCA)分析。

S3：对经过预处理的光谱数据进行特征波长选择，分别采用主成分分析载荷(PCAloadings)方法进行特征波长选择。

S4：通过k-means方法建立建模集和预测集。分别基于原始光谱和选择的特征波长，建立PLS-DA，SVM判别分析模型。这些判别分析模型基于不同的原理，从不同的角度对数据进行判别分析，而从中选择合适的判别分析模型。

步骤S1中采用日本Jasco公司生产的Jasco FT/IR-4100红外光谱仪采集红外光谱信息，分辨率为8cm-¹，扫描次数为32，信噪比S/N为22000：1。

步骤S2中SG是一种有效的去除光谱数据中噪声、提高信噪比的有效方法。多项式次数以及平滑点数对其平滑效果具有决定性的影响。本发明SG平滑采用2次多项式7点平滑。具体算法如下：

$x_{k,smooth}={\stackrel{\‾}{x}}_k=\frac{1}{H}\underset{i=-w}{\overset{+w}{\Σ}}{x}_k+{\mathrm{ih}}_i$

式中，h_i为平滑系数，H为归一化因子，x_k为波长K处理后得到的值；

步骤S4中利用k-means方法建立建模集和预测集。随机选取K个聚类质心点(cluster centroids)为μ1，μ2，……μk，重复下面过程直到收敛：

对于每一个样例i，计算其应该属于的类

c⁽ⁱ⁾＝argargmin_j||x⁽ⁱ⁾-μ_j||2

对于每一个类j，重新计算该类的质心

${\mathrm{\μ}}_j=\frac{{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{m}1\{c^{\left(i\right)}=j\}{x}^{\left(i\right)}}{{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{m}1\{c^{\left(i\right)}=j\}}$

式中，x⁽ⁱ⁾为样例i与各类中距离最近的那个类，μ_j为质心代表我们对属于同一类的样本中心的猜测；

步骤S4中PLS-DA判别分析模型，以代表类别的整数值代替化学值进行分析，根据得到的预测结果进行判别分析。为了对样本的类别进行判定，也因为预测结果中预测值不是代表类别的整数而是实际数值，故需设定判别阈值。在本研究中，将0.5设定为判别阈值，即当实际值与预测值的差的绝对值大于0.5时，则判别错误，反之则视为判别正确。

步骤S4中SVM判别分析模型，是使用y＝sign(f(x))来推断任一输入x所对应的类别，输出值只允许取类别值。本发明在SVM建模中，采用径向基函数(RBF)作为核函数。SVM模型的参数惩罚系数c寻优范围为2-8到28。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明考虑到转基因食物深加工以后，其外源蛋白和外源基因会发生不同程度降解，以此基于红外光谱技术结合化学计量学方法，对转基因豆奶粉进行鉴别。相对于传统的分子检测方法来说，本发明无需复杂的样本预处理，而且快速、无损、精度高。因此，可以说具有广泛的应用前景和利用价值，为高效的转基因安全管理提供了切实有效的检测手段。

附图说明

图1是本发明基于红外光谱的转基因豆奶粉的识别流程图；

具体实施方式

下面结合附图和实施例，进一步详细描述。本具体实施方式是以本发明技术方案为前提下进行实施，应理解这些方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明以转cry1Ab基因的大豆为实施实例，其他的转基因作物加工品的识别可参照该实施例的方法进行，如图1所示，具体识别过程如下：

1、将转基因大豆和其亲本分别碾磨成粉；

2、配置转基因和非专基因豆奶粉，豆奶粉的比例包括：转基因大豆/非专基因大豆粉末50％，麦芽糖10％，食用盐5％，蜂皇浆冻干粉末13％，异构乳化糖7％，香精5％，添加剂10％。一共获得240份样本，其中包括转基因豆奶粉120份，非转基因豆奶粉120份。

3、应用Jasco FTIR 4100傅立叶变换光谱仪(Jsasco Analytical Instruments，Japan)采集中红外光谱数据，仪器参数设置分别：光谱扫描次数为32次，光谱分辨率为8cm^-1，光谱范围为400～4000cm^-1。在室温25℃下，将0.02g的豆奶粉末与0.98g的溴化钾(KBr)在研钵中研磨至充分混合，取适量粉末用压片机制成高透明度、厚度均匀的压片，并放置于光谱仪的样本槽中进行中红外光谱数据的采集。

4、采用Savitzky-Golay平滑(SG)预处理获得的光谱数据，进行主成分(PCA)分析。

SG是一种有效的去除光谱数据中噪声、提高信噪比的有效方法。多项式次数以及平滑点数对其平滑效果具有决定性的影响。本发明SG平滑采用2次多项式7点平滑。具体算法如下：

$x_{k,smooth}={\stackrel{\‾}{x}}_k=\frac{1}{H}\underset{i=-w}{\overset{+w}{\Σ}}{x}_k+{\mathrm{ih}}_i$

式中，h_i为平滑系数，H为归一化因子，

5、经SG-7预处理后得到的全谱光谱数据作为输入，分别建立PLS和SVM判别分析模型。在全谱的判别分析模型中，PLS判别模型效果要优于SVM判别模型。PLS建模集和预测集的准确率达到了91.27％和85.28％。

6、基于主成分分析载荷(PCAloadings)方法进行特征波长选择。PCA算法是对光谱数据进行主成分分析过程中得到。PCA算法可以去除数据中冗余信息，并转化生成包含有效光谱信息的贡献率(loading)，同时保留了大量的原始信息。当获得的前n个主成分的累计贡献率大于85％时，则可选取该主成分下贡献率的峰谷作为特征波段。利用PCA算法获取的特征波段包括：

基于PCA loadings方法提取的15个特征波长，分别为764cm^-1，881cm^-1，947cm^-1，993cm^-1，1012cm^-1，1518cm^-1，1726cm^-1，2362cm^-1，2959cm^-1，3477cm^-1，3657cm^-1，3666cm^-1，3713cm^-1，3821cm^-1，3868cm^-1。

7、PCA loadings方法提取特征波长建立的PLS和SVM模型

由上表可知，以PCA loadings方法提取的特征波长作为输入变量建模，两个模型的判别分析效果都较好。PLS模型的判别分析效果最好，对转基因豆奶粉的判别正确率建模集和预测集达到了93.63％和91.50％。上述结果说明应用本发明的方法能够快速有效的识别转基因豆奶粉，具有良好的应用前景和可观的市场价值。

Claims (6)

1.一种转基因豆奶粉的快速无损鉴别方法，其特征在于，包括步骤：

(1)制备转基因和非专基因豆奶粉的测试样本，利用红外光谱仪进行红外光谱数据的采集。

(2)对采集的红外光谱数据采用Savitzky-Golay平滑预处理，进行主成分分析；

(3)根据预处理后的红外吸收光谱，利用PCA-loading的方法提取特征波长；

(4)分别建立红外光谱和特征波长的判别分析模型，包括PLS-DA判别分析模型和/或SVM判别分析模型；

(5)对于待测转基因豆奶粉和非转基因样本，依次通过步骤(1)-步骤(4)，将待测样本的红外光谱，利用所述的判别分析模型来估测类别。

2.根据权利要求1所述的转基因豆奶粉的快速无损鉴别方法，其特征在于，采用JascoFT/IR-4100红外光谱仪采集400cm^-1～4000cm^-1波数范围内的红外光谱数据，分辨率为8cm^-1，扫描次数为32，信噪比S/N为22000：1。

3.根据权利要求1所述的转基因豆奶粉的快速无损鉴别方法，其特征在于，Savitzky-Golay平滑预处理采用2次多项式7点平滑，具体算法如下：

$x_{k,smooth}={\stackrel{\‾}{x}}_k=\frac{1}{H}\underset{i=-w}{\overset{+w}{\Σ}}{x}_k+{\mathrm{ih}}_i$

式中，h_i为平滑系数，H为归一化因子，x_k为波长K处理后得到的值。

4.根据权利要求1所述的转基因豆奶粉的快速无损鉴别方法，其特征在于，建立判别分析模型前，利用k-means方法建立建模集和预测集；随机选取K个聚类质心点为μ1，μ2，……μk，重复下面过程直到收敛：

对于每一个样例i，计算其应该属于的类

c⁽ⁱ⁾＝arg arg min_j||x⁽ⁱ⁾-μ_j||²

对于每一个类j，重新计算该类的质心

${\mathrm{\μ}}_j=\frac{{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{m}1\{c^{\left(i\right)}=j\}{x}^{\left(i\right)}}{{\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{m}1\{c^{\left(i\right)}=j\}}$

式中，x⁽ⁱ⁾为样例i与各类中距离最近的那个类，μ_j为质心代表我们对属于同一类的样本中心的猜测。

5.根据权利要求4所述的转基因豆奶粉的快速无损鉴别方法，其特征在于，提取的特征波长分别为764cm^-1，881cm^-1，947cm^-1，993cm^-1，1012cm^-1，1518cm^-1，1726cm^-1，2362cm^-1，2959cm^-1，3477cm^-1，3657cm^-1，3666cm^-1，3713cm^-1，3821cm^-1和3868cm^-1。

6.根据权利要求5所述的转基因豆奶粉的快速无损鉴别方法，其特征在于，所述测试样本中豆奶粉的比例包括：转基因大豆或非专基因大豆粉末50％，麦芽糖10％，食用盐5％，蜂皇浆冻干粉末13％，异构乳化糖7％，香精5％，添加剂10％；一共获得240份样本，其中包括转基因豆奶粉120份，非转基因豆奶粉120份。