CN102296111A - 基于rt-pcr测定混合肉制品中特定肉类成分含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于RT-PCR测定混合肉制品中特定肉类，特别是猪肉成分含量的方法。本发明提供了检测混合肉制品中猪肉成分含量的实时荧光PCR猪特异性寡核苷酸引物和探针以及脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针。另外，本发明还提供了含有上述猪特异性引物和探针以及脊椎动物通用引物和探针的检测试剂盒。采用本发明方法能够简便、快捷、准确地检出生肉或熟试样中猪源性DNA成分含量。本发明建立在猪特异性引物体系与通用引物体系扩增曲线的相关关系上，具有较高的准确性和抗干扰能力。此外，本发明具有较强的可移植性，通过更换特异性引物体系可检测混合肉样中其它物种成分的含量。

Description

基于RT-PCR测定混合肉制品中特定肉类成分含量的方法

技术领域

本发明涉及食品检验和生物技术领域，具体地说，涉及一种基于RT-PCR测定混合肉制品中特定肉类成分含量的方法。

背景技术

食品″掺杂使假″一直是消费者关注的焦点问题之一，有些不法企业和商家为了降低成本，在肉制品加工过程中以猪肉冒充牛羊肉，或以其它低价肉替代高价肉而未在标签上注明。这不仅严重侵害了消费者利益，而且如果清真食品中掺有猪肉成分还会涉及到民族和宗教等问题，造成恶劣的社会影响。此外，流行病学研究证明饲料中的动物源性成分是造成“疯牛病”等神经系统疾病传播的主要因素。

目前，用于肉种成分鉴定的技术大都建立在对蛋白质结构与DNA序列特异性分析的基本上，包括酶联免疫(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、电泳、色谱、生物传感分析等技术。其中Taqman实时荧光PCR(Taqman RT-PCR)法在灵敏度、准确性和重复性等重要性能参数上无可比拟的优势，成为该领域的主流技术，是作为仲裁方法和司法鉴定的理想技术类型，是现行国家和行业标准中指定的方法之一。

然而，现有的研究大多集中在对饲料中猪、牛、羊等动物源性成分的定性检测上，而用于食品掺假鉴别，特别是涉及有关核酸成分定量检测技术的研究较为滞后。单纯的定性检测已不能满足需求，如在肉、奶等食品“掺杂使假”案件的处理中，如何判定掺假成分是添加还是污染所致，如何确定掺假严重程度都需要有可靠的定量技术作为依托。生物样品的复杂性，如动物种别、年龄、性别、器官、肌肉类型差别等，导致DNA提取总量和扩增靶序列模板总量差异，给标准样品的选定和制备造成困难。因此急需系统误差小、可信度高的食品掺假行为性质判定技术的出现。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测混合肉制品中猪肉成分含量的实时荧光PCR猪特异性寡核苷酸引物和探针以及脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针。

本发明的另一目的是提供一种基于RT-PCR测定混合肉制品中特定肉类，特别是猪肉成分含量的方法。

本发明的进一步目的是提供含有脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针以及猪特异性寡核苷酸引物和探针的检测试剂盒及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针，其是根据脊椎动物线粒体DNA(16s rDNA)上的保守序列设计的，

上游引物为：5’-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’；

下游引物为：5’-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3’；

探针为：5’-F-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-M-3’；其中，F为荧光报告基团，M为荧光淬灭基团。

本发明还提供一种基于RT-PCR测定混合肉制品中特定肉类成分含量的方法，包括以下步骤：

1)根据上述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针设计待测肉类的特异性引物和探针，该待测肉类的特异性引物和探针序列是提供该待测肉类来源的动物的保守序列，且该待测肉类的特异性引物和探针与权利要求1所述的引物和探针的Tm值、扩增片段长度和扩增效率相似度为97％以上；所述探针的5’端连有荧光报告基团，3’端连有荧光淬灭基团；

2)以该待测肉类的纯肉样品的基因组DNA为模板，稀释至不同浓度梯度，采用步骤1)设计的引物和探针以及上述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针分别进行RT-PCR扩增；然后以lg(样品浓度)为横坐标，以(C_{t纯肉样品}-C_t通用)为纵坐标，绘制标准曲线，确定标准曲线的斜率为k₁、截距为C₁；

3)以混合肉制品的基因组DNA为模板，采用步骤1)设计的引物和探针以及上述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针分别进行RT-PCR扩增，得到C_{t待测肉类}和C_t通用′，通过下式计算得到该混合肉制品中待测肉类的成分百分含量：

前述的方法，所述混合肉制品为混合生肉制品或混合熟肉制品。

本发明还提供上述方法在测定混合肉制品中猪、牛、羊、鸡、鸭、驴、兔、鹿、狗或鱼肉成分含量中的应用。

本发明还提供一种猪特异性寡核苷酸引物和探针，其是根据不同动物物种之间线粒体ND4基因上的DNA序列多态性设计的，

上游引物为：5’-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3’；

下游引物为：5’-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3’；

5’-GAACTAGTAGGGGTGCTGATAGTG-3’；或

5’-ATTAAGGCTGTTTTCGCCTAGT-3’；

探针为：5’-F-TCTCCTCATTAGCCTGATCAGTCTATCCC-M-3’；其中，F为荧光报告基团，M为荧光淬灭基团。

优选地，本发明的猪特异性寡核苷酸引物和探针，

所述上游引物为：5’-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3’；

所述下游引物为：5’-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3’；

所述探针为：5’-FAM-TCTCCTCATTAGCCTGATCAGTCTATCCC-TAMRA-3’。

本发明还提供一种基于RT-PCR测定混合肉制品中猪肉成分含量的方法，包括以下步骤：

1)以纯猪肉样品的基因组DNA为模板，稀释至不同浓度梯度，采用上述猪特异性寡核苷酸引物和探针以及上述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针分别进行RT-PCR扩增；然后以lg(纯猪肉样品浓度)为横坐标，以(C_t纯猪肉-C_t通用″)为纵坐标，绘制标准曲线，确定标准曲线的斜率为k₂、截距为C₂；

2)以混合肉制品的基因组DNA为模板，采用上述猪特异性寡核苷酸引物和探针以及上述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针分别进行RT-PCR扩增，得到C_{t待测猪肉}和C_t通用′″，通过下式计算得到该混合肉制品中猪肉的成分百分含量：

前述的方法，所述混合肉制品为混合生肉制品或混合熟肉制品。

本发明进一步提供含有上述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针以及上述猪特异性寡核苷酸引物和探针的检测试剂盒。所述试剂盒包括上述猪特异性寡核苷酸引物和探针以及上述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针、标准品、阳性对照质粒。

本发明还提供上述试剂盒在测定混合肉制品中猪肉成分含量中的应用。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

1、引物、探针序列

通过大量生物信息学比对、分析、试验筛选工作，本发明确定了脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针，

上游引物：5’-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’；

下游引物：5’-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3’；

探针：5’-FAM-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3’；

猪特异性寡核苷酸引物和探针，

上游引物：5’-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3’；

下游引物：5’-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3’；

探针：5’-FAM-TCTCCTCATTAGCCTGATCAGTCTATCCC-TAMRA-3’。

使用上述脊椎动物通用寡核苷酸引物对扩增的产物长度为125bp。本发明的两组引物对及探针具有相似属性，包括引物、探针Tm值、扩增产物长度、产物Tm值、起始效率等，保证了两组引物对和探针的热力学和扩增动力学特性相近，使得扩增效率和荧光信号动力学特性相同，从而使定量过程系统误差降到了最低。

2、样品处理方法

称取3～50g肉样至均浆杯中(根据样品量选择合适的匀浆杯)，按照1∶3.2～5.2的重量比加入去离子双蒸水，8000～12000r/min搅拌8～15分钟，用1000μl微量移液器吸取3～5毫升离心管中，用漩涡振荡器震荡1～3min，用100μl微量移液器吸取50～100μl匀浆液至1.5ml离心管中(建议取3个平行)，待后续处理。

样品处理的均匀性好坏直接决定了检测结果的准确与否，本发明人通过大量试验获得了经处理后均一性极好的样品匀浆方法，常规检测中肉样一般采取搅拌的方法(搅拌过程中不加水)，由于提取DNA所需量很小，给后续精确称量带来了困难，也严重限制了处理速度。本方法通过加入去离子双蒸水、匀浆将样品制作成均匀度极高的悬浊液，后续加样过程可通过微量移液器来完成，大大提高了操作便捷性和效率。

3、DNA提取方法

在取完样品的1.5ml离心管中，加入600～900μL裂解液，65℃孵育25～50min，期间不时振荡混匀。11000～13000g离心5～10min，转移600～900μL上清液于洁净离心管中，加入400～600μL CTAB蛋白沉淀液，振荡混匀后，11000～13000g离心5～10min，取300～500μL上清液于洁净离心管中，加200～400μL异丙醇，室温下沉淀1-2h。11000～13000g离心5min，弃掉上清液，然后用400～600μL 70％乙醇洗涤一次(11000～13000g离心5min)，弃掉上清液，晾干，加人50～200μL TE缓冲液，溶解沉淀，4℃过夜。

4、实时荧光PCR反应

1)实时荧光PCR反应体系(总体积为10μl，可根据使用仪器的需要该比例调整反应体系各组分的量)，见表1。

表1实时荧光PCR反应体系组分及配比(总体积10μl)

2)实时荧光PCR反应参数

预变性：95℃ 30秒；

变性：95℃ 10～15秒；

退火+延伸：58～62℃ 45～60秒，40个循环；

降温：40℃ 60秒。

3)标准曲线

标准样品：按照上述样品处理方法和DNA提取步骤，提取3～50g(根据待测样品量而定)纯猪肉的总DNA，用灭菌双蒸水稀释成浓度分别为100％、50％、20％、10％、1％、0.1％的DNA模板标准样品，用于制作标准曲线。

标准曲线设置方法：用猪特异性反应体系对系列浓度DNA模板标准样品和用通用反应体系对100％猪肉DNA模板标准样品进行RT-PCR扩增，lg(纯猪肉样品浓度)vs(C_t纯猪肉-C_t通用″)做图，即制得相对定量法标准曲线。标准曲线斜率为k₂、截距为C₂。

5、样品检测

将混合肉样按前述方法处理和提取DNA模板，按表1的试剂体系加样到RT-PCR板(每个样品都分别在平行孔内加入括猪反应体系和通用反应体系两种反应体系)，同时按照前述的标准曲线加样方法进行加样。按照上述反应条件进行RT-PCR扩增。

6、结果计算

式中：X——试样中猪肉成分的百分比含量(w/w)；

C_{t待测猪肉}——试样猪特异性反应体系扩增C_t值；

C_t通用′″——试样通用反应体系扩增C_t值；

C₂——标准曲线的截距；

k₂——标准曲线的斜率。

本发明的实时荧光PCR法采用完全封闭管检测，无须PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。本发明的猪特异性引物对、探针体系和脊椎动物通用引物对和探针体系具有相似属性，Tm值、扩增片段长度、扩增效率都极为接近，最大程度地降低了定量误差。本发明是基于猪特异性引物与脊椎动物通用引物同一反应体系下C_t值的相关关系确定肉制品中猪肉成分的百分比含量的，受外部条件(PCR仪品牌和型号、试剂、操作等)影响较小，具有较高的稳定性和可信度。本发明提供的样品处理方法能够获得高度均一的均浆体系，具有很好的稳定性和重复性。本发明提供的DNA提取方法时间短，提取率高，线性关系好，重复性好。内参法抗干扰性强、准确度高。另外，本发明提供的方法可移植性较好，可通过更换特异性引物，测定混合肉制品中牛、羊、鸡、鸭、驴、兔、鹿、狗或鱼等特定肉类成分含量。

图1为本发明猪特异性引物体系多物种RT-PCR扩增曲线，其中，1代表猪肉DNA提取物，2-10分别代表牛、羊、鸡、鸭、兔、驴、鹿、狗、驴肉DNA提取物，11代表阴性对照。

图2为本发明脊椎动物通用引物体系多物种扩增曲线，其中，1-10分别代表猪、牛、羊、鸡、鸭、兔、驴、鹿、狗、驴肉DNA提取物，11代表阴性对照。

图3为系列猪肉含量的猪-羊混肉样DNA提取物RT-PCR扩增曲线，其中，1：100％猪肉；2：50％猪肉；3：20％猪肉；4：10％猪肉；5：1％猪肉；6：0.1％猪肉，每组样品设有三个平行。

图4为系列猪肉含量的猪-羊混肉样C_t值的拟合曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 鉴定本发明猪特异性引物、探针体系的特异性和脊椎动物通用引物探针体系的通用性

主要仪器设备：

荧光定量PCR仪(Roche480 II，瑞士)、高速台式离心机(Eppendorf5417R，德国)、微量移液器(10μl、100μl、1000μ1)、均质机(ACE，日本)、紫外-可见分光光度计(UNIC 2800A，上海)等。

主要试剂：

氯仿、异丙醇、EDTA、Tris、购于国药集团，TE缓冲液(Tris-HCl，EDTA缓冲液)：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0，1％ CTAB裂解液(0.05mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.7mol/L NaCl，0.01mol/L EDTA(pH 8.0))、CTAB沉淀液(三氯甲烷+异戊醇(24∶1))均为实验室常用试剂；Premix Ex Taq^TM预混液购于宝生物工程(大连)有限公司；引物及探针由生工生物工程(上海)有限公司合成等。

检测步骤：

1、引物、探针序列

脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针，

上游引物：5’-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’；

下游引物：5’-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3’；

探针：5’-FAM-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3’；

猪特异性寡核苷酸引物和探针，

上游引物：5’-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3’；

下游引物：5’-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3’；

探针：5’-FAM-TCTCCTCATTAGCCTGATCAGTCTATCCC-TAMRA-3’。

2、样品处理方法

分别称取0.2g猪、牛、羊、鸡、鸭、驴、兔、鹿、狗、鱼10种常见肉种样品至1.5ml离心管。

3、DNA提取方法

在步骤2取完样品的1.5ml离心管中，加入800μL裂解液，65℃孵育30min，期间不时振荡混匀。12000g离心5min，转移600μL上清液于洁净离心管中，加入400μL CTAB蛋白沉降液，振荡混匀后，12000g离心5min，取400μL上清液于洁净离心管中，加320μL异丙醇，室温下沉淀1h。12000g离心5min，弃掉上清液，然后用500μL 70％乙醇洗涤一次(12000g离心5min)，弃掉上清液，晾干，加人50μL TE缓冲液，溶解沉淀，4℃过夜。将各DNA提取样品稀释至10ng/μl，进行后续试验。

4、实时荧光PCR反应

1)实时荧光PCR反应体系(总体积为10μl)，见表2。

表2RT-PCR反应各组分加样方案

2)实时荧光PCR反应参数

预变性：95℃ 30秒；

变性：95℃ 10秒；

退火+延伸：60℃ 45秒，35个循环；

降温：40℃ 60秒。

猪特异性引物体系的实时荧光PCR的扩增结果如图1所示，脊椎动物通用引物体系的实时荧光PCR的扩增结果如图2所示。各反应体系含有模板DNA 20ng。

从图1和图2中可以看出，利用本发明提供的猪特异性引物、探针可特异性扩增出猪肉成分，而对其它肉种成分在35个循环内无典型扩增曲线出现，脊椎动物通用引物体系对10种肉品DNA提取物均有典型扩增曲线出现，且扩增曲线属性极为接近，C_t值分布在较窄的区间内，为猪肉成分定量检测提供了良好的基础。

实施例2本发明检测方法体系的线性关系

主要仪器设备：

荧光定量PCR仪(Roche480 II，瑞士)、高速台式离心机(Eppendorf5417R，德国)、微量移液器(10μl、100μl、1000μl)、均质机(ACE，日本)、紫外-可见分光光度计(UNIC 2800A，上海)等。

主要试剂：

氯仿、异丙醇、EDTA、Tris、购于国药集团，TE缓冲液(Tris-HCl，EDTA缓冲液)：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0，1％ CTAB裂解液(0.05mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.7mol/L NaCl，0.01mol/L EDTA(pH 8.0))、CTAB沉淀液(三氯甲烷+异戊醇(24∶1))均为实验室常用试剂；Premix Ex Taq^TM预混液购于宝生物工程(大连)有限公司；引物及探针由生工生物工程(上海)有限公司合成等。

检测步骤：

1、引物、探针序列

同实施例1。

2、系列浓度样品准备

称取30g猪肉至匀浆杯中，加入120g去离子双蒸水，12000r/min匀浆8min得到猪肉匀浆液。称取30g羊肉至匀浆杯中，加入120g去离子双蒸水，12000r/min匀浆8min得到羊肉匀浆液。用分析天平(精确到0.0001g)精确称量猪肉和羊肉匀浆液，得到猪肉含量为0.1％、1.0％、10.0％、20.0％、50.0％、100.0％的猪-羊混合肉样3g于5ml离心管中，每组样品设有三个平行，用漩涡振荡器震荡1min，用100μl微量移液器吸取50μl匀浆液至1.5ml离心管中，待后续处理。

3、DNA提取方法

在步骤2取完样品的1.5ml离心管中，加入800μL裂解液，65℃孵育30min，期间不时振荡混匀。12000g离心5min，转移600μL上清液于洁净离心管中，加入400μL CTAB蛋白沉降液，振荡混匀后，12000g离心5min，取400μL上清液于洁净离心管中，加320μL异丙醇，室温下沉淀1h。12000g离心5min，弃掉上清液，然后用500μL 70％乙醇洗涤一次(12000g离心5min)，弃掉上清液，晾干，加人50μL TE缓冲液，溶解沉淀，4℃过夜。将各DNA提取样品稀释至10ng/μl，进行后续试验。

4、实时荧光PCR反应

1)实时荧光PCR反应体系(总体积为10μl)

见表2。

2)实时荧光PCR反应参数

预变性：95℃ 30秒；

变性：95℃ 10秒；

退火+延伸：60℃ 45秒，40个循环；

降温：40℃ 60秒。

猪-羊混肉样DNA提取物RT-PCR扩增结果如图3所示，系列样品Ct值的拟合曲线如图4所示。

从图3和图4中可以看出，无论从平行样品的一致性和梯度浓度样品扩增Ct值的线性关系上，本发明提供的方法体系(包括样品处理方法、DNA提取方法和RT-PCR体系)都具有很好的表现。为实现肉制品中猪肉成分定量检测提供了很好的解决方案。

实施例3用本发明提供的方法体系检测已知猪肉含量的混合生肉样中猪肉成分含量以检验该方法体系的准确性

主要仪器设备：

荧光定量PCR仪(Roche480 II，瑞士)、高速台式离心机(Eppendorf5417R，德国)、微量移液器(10μl、100μl、1000μl)、均质机(ACE，日本)、紫外-可见分光光度计(UNIC 2800A，上海)等。

主要试剂：

氯仿、异丙醇、EDTA、Tris、购于国药集团，TE缓冲液(Tris-HCl，EDTA缓冲液)：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0，1％ CTAB裂解液(0.05mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.7mol/L NaCl，0.01mol/L EDTA(pH 8.0))、CTAB沉淀液(三氯甲烷+异戊醇(24∶1))均为实验室常用试剂；Premix Ex Taq^TM预混液购于宝生物工程(大连)有限公司；引物及探针由生工生物工程(上海)有限公司合成等。

检测步骤：

1、待测样品准备

将猪、牛、羊、鸡、鸭肉用绞肉机(孔径不超过4mm)分别绞成肉馅，按表3所示猪肉成分含量制成混合肉样，样品10、11、12、13用包装袋真空包装后经115℃，20min高温高压处理。

2、引物、探针序列

同实施例1。

3、样品处理方法

称取30g样品至均浆杯中，加入120g去离子双蒸水，12000r/min匀浆8分钟，用1000μl微量移液器吸取1ml*3共3ml匀浆液至5ml离心管中，用漩涡振荡器震荡1min，用100μl微量移液器吸取50μl匀浆液至1.5ml离心管中(取3个平行)，待后续处理。

3、DNA提取方法

在步骤2取完样品的1.5ml离心管中，加入800μL裂解液，65℃孵育30min，期间不时振荡混匀。12000g离心5min，转移600μL上清液于洁净离心管中，加入400μL CTAB蛋白沉降液，振荡混匀后，12000g离心5min，取400μL上清液于洁净离心管中，加320μL异丙醇，室温下沉淀1h。12000g离心5min，弃掉上清液，然后用500μL 70％乙醇洗涤一次(12000g离心5min)，弃掉上清液，晾干，加人50μL TE缓冲液，溶解沉淀，4℃过夜。将各DNA提取样品稀释至10ng/μl，进行后续试验。

4、实时荧光PCR反应

1)实时荧光PCR反应体系(总体积为10μl)

见表2。

2)实时荧光PCR反应参数

预变性：95℃ 30秒；

变性：95℃ 10秒；

退火+延伸：60℃ 45秒，40个循环；

降温：40℃ 60秒。

3)标准曲线

标准样品：按照上述样品处理方法和DNA提取步骤，提取30g纯猪肉DNA，用灭菌双蒸水稀释成浓度分别为100％、50％、20％、10％、1％、0.1％的DNA模板标准样品，用于制作标准曲线。

标准曲线设置方法：用猪特异性反应体系对系列浓度DNA模板标准样品和用通用反应体系对100％猪肉DNA模板标准样品进行RT-PCR扩增，lg(纯猪肉样品浓度)vs(C_t纯猪肉-C_t通用″)做图，即制得相对定量法标准曲线。标准曲线斜率为k₂、截距为C₂。混合肉样中猪肉成分含量检测结果如表3所示。

表3混合肉样中猪肉成分含量检测结果

从表3可以看出，用本发明提供的方法体系无论对生肉还是熟肉样品都有较好的适用性，检测值与真实值之间的误差较小。能够满足实际检测需求，为牛、羊等高价肉中掺有的猪肉成分含量检测提供了可靠的方法，并能判定掺假行为的严重程度。

经检测结果验证，当猪特异性寡核苷酸引物采用5’-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3’为上游引物时，分别以5’-GAACTAGTAGGGGTGCTGATAGTG-3’或5’-ATTAAGGCTGTTTTCGCCTAGT-3’为下游引物，与采用下游引物5’-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3’的扩增结果相似，能够达到相同的检测目的。

实施例4用于肉制品中猪肉成分定量检测的PCR检测试剂盒

所述试剂盒包括实施例1-3中的猪特异性寡核苷酸引物和探针以及脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针、标准品、阳性对照质粒。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针，其特征在于，

上游引物为：5’-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’；

下游引物为：5’-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3’；

探针为：5’-F-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-M-3’；其中，F为荧光报告基团，M为荧光淬灭基团。

2.一种基于RT-PCR测定混合肉制品中特定肉类成分含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据权利要求1所述的脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针设计待测肉类的特异性引物和探针，该待测肉类的特异性引物和探针序列是提供该待测肉类来源的动物的保守序列，且该待测肉类的特异性引物和探针与权利要求1所述的引物和探针的Tm值、扩增片段长度和扩增效率相似度为97％以上；所述探针的5’端连有荧光报告基团，3’端连有荧光淬灭基团；

2)以该待测肉类的纯肉样品的基因组DNA为模板，稀释至不同浓度梯度，采用步骤1)设计的引物和探针以及权利要求1所述的引物和探针分别进行RT-PCR扩增；然后以lg(样品浓度)为横坐标，以(C_{t 纯肉样品}-C_t通用)为纵坐标，绘制标准曲线，确定标准曲线的斜率为k₁、截距为C₁；

3)以混合肉制品的基因组DNA为模板，采用步骤1)设计的引物和探针以及权利要求1所述的引物和探针分别进行RT-PCR扩增，得到C_{t待测肉类}和C_t通用′，通过下式计算得到该混合肉制品中待测肉类的成分百分含量：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述混合肉制品为混合生肉制品或混合熟肉制品。

4.权利要求2或3所述的方法在测定混合肉制品中猪、牛、羊、鸡、鸭、驴、兔、鹿、狗或鱼肉成分含量中的应用。

5.猪特异性寡核苷酸引物和探针，其特征在于，

上游引物为：5’-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3’；

下游引物为：5’-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3’；

5’-GAACTAGTAGGGGTGCTGATAGTG-3’；或

5’-ATTAAGGCTGTTTTCGCCTAGT-3’；

探针为：5’-F-TCTCCTCATTAGCCTGATCAGTCTATCCC-M-3’；其中，F为荧光报告基团，M为荧光淬灭基团。

6.根据权利要求5所述的引物和探针，其特征在于，

所述上游引物为：5’-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3’；

所述下游引物为：5’-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3’；

所述探针为：5’-FAM-TCTCCTCATTAGCCTGATCAGTCTATCCC-TAMRA-3’。

7.一种基于RT-PCR测定混合肉制品中猪肉成分含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以纯猪肉样品的基因组DNA为模板，稀释至不同浓度梯度，采用权利要求6所述的引物和探针以及权利要求1所述的引物和探针分别进行RT-PCR扩增；然后以lg(纯猪肉样品浓度)为横坐标，以(C_{t 纯猪肉}-C_t通用″)为纵坐标，绘制标准曲线，确定标准曲线的斜率为k₂、截距为C₂；

2)以混合肉制品的基因组DNA为模板，采用权利要求8所述的引物和探针以及权利要求1所述的引物和探针分别进行RT-PCR扩增，得到C_{t待测猪肉}和C_t通用′″，通过下式计算得到该混合肉制品中猪肉的成分百分含量：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述混合肉制品为混合生肉制品或混合熟肉制品。

9.含有权利要求1所述脊椎动物通用寡核苷酸引物和探针以及权利要求6所述猪特异性寡核苷酸引物和探针的检测试剂盒。

10.权利要求9所述的试剂盒在测定混合肉制品中猪肉成分含量中的应用。

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