CN113046445A

CN113046445A - 用于鉴定脊椎动物的dna条形码、引物、试剂盒及其方法

Info

Publication number: CN113046445A
Application number: CN202110339183.XA
Authority: CN
Inventors: 蒋晓霞; 徐博文; 黄海超; 周傲白雪; 黎财慧; 邵建宏; 赵福振; 罗宝正
Original assignee: Gongbei Customs Technology Center
Current assignee: Gongbei Customs Technology Center
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2041-03-30
Also published as: CN113046445B

Abstract

本发明属于动物分子生物学领域，公开了一种用于鉴定脊椎动物的DNA条形码、引物、试剂盒及其方法。所述DNA条形码为脊椎动物线粒体16S rRNA基因片段，长度为286bp，可用于扩增所述的DNA条形码的引物的核苷酸序列为：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明能够同时鉴定大部分濒危脊椎动物，具有成本低、检测速度快、检测灵敏度高的特点，完全可作为濒危脊椎动物物种鉴定的方法进行广泛应用。

Description

用于鉴定脊椎动物的DNA条形码、引物、试剂盒及其方法

技术领域

本发明属于动物分子生物学领域，具体涉及一种用于鉴定脊椎动物的DNA条形码、引物、试剂盒及其方法。

背景技术

目前，针对动物物种鉴定的现行国家标准和行业标准均以既定物种的鉴定为目标，采用单一物种的鉴定方法，费时费力。因此，迫切需要建立一种能够快速、准确对濒危脊椎动物鉴定的非既定物种鉴定方法。

DNA条形码技术是2003年由Hebert等人提出的一种生物鉴定方法，该方法通过筛选、设计通用引物用以扩增目标样本DNA，将PCR扩增产物进行测序，并采用生物信息学的分析方法进行碱基序列比对，从而鉴定目标样本的物种，其应用领域涵盖濒危野生动物的保护、入侵物种的识别、食品和中药材的鉴定等。目前已有研究人员运用DNA条形码技术对穿山甲、麝香、羚羊角、梅花鹿、鱼翅、海龙、龟鳖目等动物及其制品进行鉴定。但是，目前不同的研究者根据其研究对象自身的生物学特性以及不同的研究目的独自建立适宜的条形码，尚无统一的濒危物种DNA鉴定系统，较难实现简易快速鉴定。

基于此难题，本发明建立一种能够快速、准确鉴定多种濒危的脊椎动物的非既定物种鉴定方法，从而为保护珍稀濒危动物遗传资源、调查生物多样性提供有力的技术支撑和依据。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于鉴定脊椎动物的DNA条形码、引物、试剂盒及其方法，能够同时鉴定大部分濒危脊椎动物，具有成本低、检测速度快、检测灵敏度高的特点(检测灵敏度可达到0.001ng/μL)，种内遗传距离为0％-0.5％，种间遗传距离为1.0％-39.9％，最小种间遗传距离大于种内最大遗传距离，存在着明显的条形码间隔，可用于濒危物种的鉴定，并弥补了当前以既定物种为目标的单一物种鉴定方法的缺陷，对保护濒危动物、打击非法行径具有重要意义完全可作为濒危脊椎动物物种鉴定的方法进行广泛应用。

本发明提出一种用于鉴定脊椎动物的DNA条形码，所述DNA条形码为脊椎动物线粒体 16S rRNA基因片段，长度为286bp。

本发明还提出一种用于鉴定脊椎动物的引物，可扩增所述DNA条形码，所述引物的核苷酸序列为：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。

上游引物：5’-ACAAATAAGACGAGAAGACCCT-3’(SEQ ID NO:1)，

下游引物：5’-TGATCCAACATCGAGGTCGTAA-3’(SEQ ID NO:2)。

采用所述引物扩增得到的目的片段长度为286bp。

本发明利用生物学软件Clustal X对哺乳纲、鱼纲、爬行纲、两栖纲、鸟纲在内的多类型野生脊椎动物的线粒体DNA(mtDNA)进行多序列比对，最终选择在脊椎动物线粒体16SrRNA基因处，利用生物学软件Oligo7.0进行PCR引物的设计，历经长期的筛选和优化，最终设计得到一对可用于鉴定濒危脊椎动物的通用引物。

本发明在进行引物设计的过程中有如下考量：1.采用所述引物进行扩增所得到的PCR扩增产物的片段长度不宜过长，既不利于扩增的进行，也不利于对PCR扩增产物进行快速测序，会造成成本的增加；2.所述引物应尽可能适用于更多濒危脊椎动物的扩增要求，如果只能实现少数几种动物的扩增，则该方案的实际用途会较为有限；3.所述引物所扩增的区域应高度保守，并表现出良好的种间特异性，以此能够区别和鉴别出不同的脊椎动物种类。

正是基于上述考虑，本发明在前期实验中，设计有多条引物对，但由于以上引物往往只能满足以上要求中的最多一项或两项，而无法全部满足。因而，本发明经过长期的筛选和优化，才最终确认得到所述的通用引物序列(SEQ ID NO:1-2)，该引物展现出了十分优良和令人满意的效果，能够适用于大部分濒危脊椎动物物种的鉴定，有效解决濒危脊椎动物物种鉴定时效低、成本高的难题。

本发明还提出一种用于鉴定脊椎动物的试剂盒，包括所述引物，还包括Taqbuffer、MgCl₂、 dNTP mix和Taq DNA聚合酶。

本发明还提出一种用于鉴定脊椎动物的方法，包括以下步骤：

(1)将待测动物样本进行除异物处理后，提取DNA；

(2)以步骤(1)所提取的DNA为模板，采用如SEQ ID NO:1-2所示的引物进行PCR 扩增，得到扩增产物；

(3)将所述扩增产物进行电泳分析，选取条带明亮的扩增产物，进行双向测序；

(4)将步骤(3)经测序后的序列信息与GenBank数据库进行BLAST相似性比对分析，鉴定得到所述待测动物样本所属物种。

进一步的，步骤(1)中所述动物样本为肌肉、皮毛、骨、角、牙或鳞片。在本发明中，所有可获取的动物样本基本都可作为检测材料，因而本发明的方案具备良好的适用性。

更进一步的，当所述动物样本为骨、角、牙或鳞片时，经步骤(1)所述除异物处理后，进行研磨，得到动物样本粉末。由于骨、角、牙、鳞片等动物组织较为坚硬，采用常规方法难以有效提取上述类型动物样本的DNA，因此可对其进行细化处理以便于水解消化，有助于后续的DNA提取操作。

再进一步的，对所述动物样本粉末进行脱钙处理，所述脱钙处理为采用金属螯合剂对所述动物样本粉末进行处理。在动物的骨、角、牙、鳞片等组织中，富含大量的钙质，虽然钙为动物本身所含有而非外源异物，但过量的钙也会在一定程度上影响DNA的提取和正常扩增，因此本发明还采用金属螯合剂对动物样本粉末进行脱钙处理，以避免其不利影响。

在实际应用中，EDTA作为一种优良的钙、镁离子螯合剂，其脱钙效果较为显著，但采用其他金属螯合剂(如羟基羧酸类螯合剂、有机多元磷酸类螯合剂)也能实现相同或相近的脱钙效果。

进一步的，步骤(1)所述除异物处理为：用无水乙醇擦拭样本表面，于22-28℃进行干燥，用紫外灯照射样本表面。DNA的成功提取是分子鉴定的基础，由于濒危脊椎动物样本种类较复杂，因而本发明通过进行除异物处理可以清除待测动物样本上所附着的可能影响检验结果的异物，从而提高检验结果的准确性。

进一步的，步骤(1)中所提取的DNA的A₂₆₀/A₂₈₀为1.8-2.0。当DNA的A₂₆₀/A₂₈₀值为1.8-2.0时，表明所提取DNA中所含杂质较少，纯度较高；而超出这一范围，则显示DNA样本被碳水化合物、盐类、蛋白质或有机溶剂所污染，会对后续的PCR扩增产生不良影响。因而当DNA样本未落入以上范围时，需重新进行提取DNA的操作。

进一步的，步骤(2)中所述PCR扩增的体系为：

2×Taq PCR Master mix 12.5μL，

10μmol/L SEQ ID NO:1所示的上游引物0.5μL，

10μmol/L SEQ ID NO:2所示的下游引物0.5μL，

模板2.0μL，

补水至25μL。

所述Taq PCR Master mix中包含有PCR扩增所需的Taq buffer，MgCl₂，dNTP mix和Taq DNA聚合酶。

进一步的，步骤(2)中所述PCR扩增的反应程序为：

94℃预变性4min；

94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，进行40个循环；

72℃延伸7min。

本发明还提出上述方法在鉴定脊椎动物中的应用。本发明所建立的鉴定方法可适用于大部分濒危脊椎动物物种鉴定，具有广阔的应用前景。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明所设计的通用引物能够适用于不同组织、不同状态动物样本的鉴定，甚至包括已经风化的标本动物，其检测可靠性高，适用范围广；

(2)本发明所采用的方法具有检测灵敏度高的突出特点，其PCR检测灵敏度可达到0.001ng/μL；

(3)本发明所采用的方法可以适用于大部分濒危脊椎动物的物种鉴定，种内遗传距离为0％-0.5％，种间遗传距离为1.0％-39.9％，最小种间遗传距离大于种内最大遗传距离，存在着明显的条形码间隔，可以鉴定到属有些甚至可以鉴定到种，具备检测准确度高、检测速度快和成本低的优势。

附图说明

图1为实施例4中部分待测动物样本的PCR扩增结果；

图2为实施例5中不同浓度牛肉DNA的PCR扩增结果。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实验试剂：E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit(OMEGA，美国)DNA提取试剂盒，Taq PCRMaster mix(TIANGEN，天根生化科技(北京)有限公司)PCR反应体系，DNA Marker DL 2000(TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司)。

实验仪器：Veriti 96-Well Thermal Cycler(Applied Biosystems，美国)PCR仪；Alpha Imager HP(Alpha Innotech，美国)凝胶成像系统；Sigma 3-18 K(Sartorius，德国)高速离心机；NanoDrop-1000Spectrophotometer(NanoDrop Technologies，美国)分光光度计；Dry Block Heater 4(IKA，美国)干浴器；Sanger Sequencing 3500 Series GeneticAnalyzers(Applied Biosystems，美国)基因测序仪。

实施例1

本实施例提供一种用于鉴定脊椎动物的DNA条形码及扩增该DNA条形码的通用引物。本实施例根据GenBank中公布的脊椎动物线粒体全基因或16S rRNA基因序列，应用生物学软件Clustal X进行多序列比对，在高度保守区域使用Oligo7.0设计濒危脊椎动物的通用PCR 引物，在对所设计的多对引物进行不断筛选和优化后，最终确认和得到一对性能优良，能够很好用于扩增该DNA条形码的通用引物(由上海辉睿生物科技有限公司合成)，该引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-ACAAATAAGACGAGAAGACCCT-3’(SEQ ID NO:1)，

下游引物：5’-TGATCCAACATCGAGGTCGTAA-3’(SEQ ID NO:2)。

该引物的Tm值为55℃。

实施例2

本实施例提供一种用于鉴定脊椎动物的试剂盒，包括有实施例1中的引物(SEQ IDNO:1-2)，还包括有Taq buffer、MgCl₂、ddH₂O、dNTP mix和Taq DNA聚合酶等试剂。采用将实施例1中引物制备成试剂盒的形式，有助于保存、携带和使用，可为实际检测提供便利。

实施例3

本实施例提供一种用于鉴定脊椎动物的方法，具体包括以下步骤：

1.除异物处理

当待测动物样本为肌肉、皮毛、骨、角、牙或鳞片时，使用酒精棉仔细擦拭待测动物样本的表面，采用室温(25℃)进行干燥，再使用紫外灯照射30min，通过进行除异物处理可以清除待测动物样本上所附着的可能影响检验结果的异物，从而提高检验结果的准确性。

2.动物样本粉末的制备

当所述动物样本为骨、角、牙或鳞片时，经除异物处理后，还需使用无菌手术刀或电钻取角、牙、骨骼或鳞片粉末约30mg，由于骨、角、牙、鳞片等动物组织较为坚硬，采用常规方法难以有效提取上述类型动物样本的DNA，因此需要将其进行处理得到动物样本粉末。

在制得的粉末置于1.5mL离心管中，加入1.0mL 0.5mol/L金属螯合剂乙二胺四乙酸 (Ethylene Diaminete Traacetic Acid，EDTA)，充分混匀，室温(25℃)放置15h脱钙处理， 12000×g离心5min，丢弃上清液，保留沉淀物，即为脱钙处理后的动物样本粉末。在动物的骨、角、牙、鳞片等组织中，富含大量的钙质，虽然钙为动物本身所含有而非外源异物，但过量的钙也会在一定程度上影响DNA的提取效果，因此本实施例采用金属螯合剂EDTA对动物样本粉末进行脱钙处理，以避免其不利影响。

3.DNA提取

将动物样本血液或上述所制得的脱钙处理后的动物样本粉末均采用常规方法进行DNA 提取(如人工手动提取或试剂盒提取)，采用试剂盒提取时的具体提取方法可参考试剂盒说明书。其中对于皮毛、骨、角、牙和鳞片等动物样本的水解消化时间可延长至12h以上，所提取的DNA的A₂₆₀/A₂₈₀应为1.8-2.0，否则需进行重新提取。将提取后的DNA置于-20℃备用。

4.PCR扩增

以上述所提取的DNA为模板，采用实施例1中SEQ ID NO:1-2所示的上下游引物进行 PCR扩增，得到扩增产物。

其中PCR扩增的体系为：

2×Taq PCR Master mix 12.5μL，

10μmol/L SEQ ID NO:1所示的上游引物0.5μL，

10μmol/L SEQ ID NO:2所示的下游引物0.5μL，

模板2.0μL，

补水至25μL。

Taq PCR Master mix中包含有PCR扩增所需的Taq buffer，MgCl₂，dNTP mix和TaqDNA 聚合酶。

PCR扩增的反应程序为：

94℃预变性4min；

94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，进行40个循环；

72℃延伸7min。

5.扩增产物的电泳及测序

将得到的扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶和TBE缓冲溶液中进行电泳检测，电压100V， 30min。电泳结束后，用Alpha Imager HP凝胶成像分析系统观察电泳后的结果，选取条带明亮的PCR扩增产物作为测序引物，采用Sanger法进行双向测序，测序步骤由上海生工生物工程有限公司和拱北海关技术中心的实验室共同完成。

6.序列比对

将所测得的序列在美国国家生物技术中心(NCBI)GenBank数据库搜索工具BasicLocal Alignment Search Tool(BLAST)进行同源性比较，以确定测出来的序列是否正确。从GenBank 数据库下载相似性相同的16S rRNA基因序列，用MEGA7.0软件进行比对，基于Kimura-2-parameter(K2P)模型，选择Transition substitution(Ts)替换类型计算各物种的种内和种间遗传距离。

实施例4

涉案脊椎动物样本鉴定

本实施例以哺乳纲、鱼纲、爬行纲、两栖纲中的24科28属40种共71份涉案濒危脊椎动物样本为研究对象，采用实施例3中用于鉴定脊椎动物的方法进行检测和测定，所用濒危脊椎动物样本的类型包括肌肉组织、动物角、动物牙、动物皮毛、动物骨骼和鳞片，均来源于海关走私罚没的已知物种，详细信息见表1所示。

表1涉案脊椎动物样本信息

注：Ⅰ、Ⅱ表示该物种被列入《国家重点保护野生动物名录》一级、二级。附录Ⅰ、附录Ⅱ、附录Ⅲ表示该物种被列入2019年《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录 Ⅰ、附录Ⅱ、附录Ⅲ。

最终共有62份涉案脊椎动物样本成功实现DNA的扩增，扩增产物的大小约为286bp，而其余9份涉案脊椎动物样本未能成功扩增(包含8份象牙样本和1份绿鬣蜥皮张样本)，图1所示为40种脊椎动物PCR凝胶电泳结果。

基于Blast比对的物种鉴定

将测序所得62条基因片段在GenBank数据库进行BLAST相似性比对分析。结果表明：其中57条测序比对结果与GenBank数据库中的参考序列具有较高相似度(98.21％-100％)，测得的序列为16S rRNA基因真实的序列。而东方狍基因片段与西方狍基因片段两者的参考序列，射纹龟基因片段与射纹龟和安哥洛卡陆龟两者的参考序列，阿氏前口蝠鲼基因片段与阿氏前口和双吻前口蝠鲼两者的参考序列，灰色真鲨基因片段与直齿真鲨和灰色真鲨两者的参考序列，吻海马基因片段与吻海马和管海马两者的参考序列相似性相同，5个样本基因测序结果在属内种间高度一致，只能鉴定到属的水平。

基于遗传距离分析

在两两个体遗传距离比较中，从GenBank数据库下载与所测序列相似性相同的16SrRNA 基因序列84条，与测序所得基因序列57条，共有141条286bp的16S rRNA基因序列参与遗传距离比较。结果表明，种内遗传距离0％-0.5％，种间遗传距离1.0％-39.9％，最小种间遗传距离大于种内最大遗传距离，存在明显的条形码间隔。鹿属的种间遗传距离为1.1％-4.4％，最小种间遗传距离为梅花鹿与马鹿，为1.1％；熊属的种间遗传距离为1.6％-2.7％；鹿科的属间遗传距离为2.7％-6.8％；牛科的属间遗传距离为2.7％-5.6％。可见，分类阶元高的种间遗传距离平均值较分类阶元低的大。统计结果见表2所示。

表2不同分类阶元遗传距离(K2P)统计

本实施例所用的71份样本中有62份样本(涉及39种脊椎动物)能够成功测序比对，表明本研究设计的通用引物能够适用于不同组织、不同状态的样本鉴定，包括已经风化的标本动物。然而，部分工艺品尤其深加工品在加工过程中受高温、高压、辐射等物理因素及酸碱、添加剂等化学因素的影响，如上述9份未能成功扩增的象牙工艺品、绿鬣蜥皮张样本，其DNA 已发生不同程度的、不可逆转的变性、断裂或降解，客观上已经决定该类样本基本不可能实现DNA的提取，而并非是本发明技术方案存在缺陷造成的PCR扩增失败。需要注意的是，由于通用引物扩增极易发生DNA交叉污染，若未采取有效的防交叉污染措施，将可能导致错误的鉴定结论。

GenBank数据库中DNA信息储备庞大、内容丰富，能够为相关研究提供必要的支撑。对经测序获得的DNA序列进行Blast同源搜索比对，能够实现动物的种属鉴定。本发明所建立的DNA条形码技术能够区分近缘脊椎动物的物种，如梅花鹿和马鹿等，但其中5份样本进行序列比对后分别得出两种结果可能性，即射纹龟或安哥洛卡陆龟，阿氏前口蝠鲼或双吻前口蝠鲼，吻海马或管海马，东方袍或西方狍，直齿真鲨或灰色真鲨，只能定义到属而无法明确区分到种。但采用本发明的方法已经能够满足于大部分濒危脊椎动物物种的检测和鉴定的需求。

近年来，种间的最小差异和种内的最大差异被用作DNA条形码间隔，比平均种内和种间差异更加有效。本研究中，种内的最大K2P遗传距离为0.5％，种间的最小K2P遗传距离为1.0％，两者存在间隔区域，且种间遗传距离随着分类阶元的上升而逐步增大，表明该序列可以用于濒危脊椎动物的物种鉴定。

实施例5

灵敏性测试

以新鲜牛肉为代表样本测试本发明方法的灵敏度，采用实施例3中的方法提取DNA后，使用NanoDrop-1000分析仪测定得到新鲜牛肉的DNA浓度为266ng/μL(A₂₆₀/A₂₈₀＝1.91)，将其稀释为100ng/μL，然后进行10倍梯度稀释，共配制得到7个不同的浓度：10ng/μL、1ng/μL、 0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL和0.00001ng/μL，然后分别以其为DNA模板，采用实施例3中方法进行PCR扩增和电泳检测。

检测结果如图2所示，其中M：DNA Maker DL 2000；N：阴性对照；B：空白对照；泳道1-7：DNA浓度依次为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL、0.00001ng/μL。图2中电泳结果显示：扩增产物的电泳条带亮度随着DNA模板浓度的降低逐渐下降，但浓度为0.001ng/μL的DNA也可见较为清晰、长度为286bp的明亮条带，表明本发明所提出的方法具备较高的灵敏度，具有十分突出的特点和优势。

SEQUENCE LISTING

<110> 拱北海关技术中心

<120> 用于鉴定脊椎动物的DNA条形码、引物、试剂盒及其方法

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acaaataaga cgagaagacc ct 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgatccaaca tcgaggtcgt aa 22

Claims

1.一种用于鉴定脊椎动物的DNA条形码，其特征在于，所述DNA条形码为脊椎动物线粒体16S rRNA基因片段，长度为286bp。

2.一种用于鉴定脊椎动物的引物，其特征在于，可扩增权利要求1所述的DNA条形码，所述引物的核苷酸序列为：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种用于鉴定脊椎动物的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物，还包括Taq buffer、MgCl₂、dNTP mix和Taq DNA聚合酶。

4.一种用于鉴定脊椎动物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将待测动物样本进行除异物处理后，提取DNA；

(2)以步骤(1)所提取的DNA为模板，采用权利要求2所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述动物样本为肌肉、皮毛、骨、角、牙或鳞片。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当所述动物样本为骨、角、牙或鳞片时，经步骤(1)所述除异物处理后，进行研磨，得到动物样本粉末。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对所述动物样本粉末进行脱钙处理，所述脱钙处理为采用金属螯合剂对所述动物样本粉末进行处理。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述除异物处理为：用无水乙醇擦拭样本表面，于22-28℃进行干燥，用紫外灯照射样本表面。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的体系为：

2×Taq PCR Master mix 12.5μL，

10μmol/L SEQ ID NO:1所示的上游引物0.5μL，

10μmol/L SEQ ID NO:2所示的下游引物0.5μL，

模板2.0μL，

补水至25μL。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的反应程序为：

94℃预变性4min；

94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，进行40个循环；

72℃延伸7min。

11.权利要求4-10中任一项所述方法在鉴定脊椎动物中的应用。