CN108456676A - 从骨骼或牙齿中提取dna的提取缓冲液和提取方法 - Google Patents

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CN108456676A CN201810289817.3A CN201810289817A CN108456676A CN 108456676 A CN108456676 A CN 108456676A CN 201810289817 A CN201810289817 A CN 201810289817A CN 108456676 A CN108456676 A CN 108456676A
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Abstract

本发明公开了一种由TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠溶液、1mol/L的DTT溶液、10mg/mL的蛋白酶K溶液按4～5:1:1:1的体积比混合而成的DNA提取缓冲液。本发明还公开了利用DNA提取缓冲液从骨骼或牙齿样品中提取DNA的方法，该方法包括以下步骤：清理杂质，样品室温粉碎，加入提取缓冲液裂解，加入吸附液和吸附珠粒进行吸附，漂洗吸附珠粒，加入洗脱液洗脱；本发明还公开了一种在提取骨骼或牙齿的DNA的过程中对样品进行前处理的方法。本发明公开的DNA提取缓冲液和相应的使用方法对骨骼、牙齿DNA的提取效率高，提取出的DNA完整性好，纯度高，操作简便快速，可防止样品之间的交叉污染，成本低，操作安全。

Description

从骨骼或牙齿中提取DNA的提取缓冲液和提取方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种从骨骼或牙齿中提取DNA的DNA提取缓冲液。本发明还涉及一种从骨骼或牙齿中提取DNA的方法。
背景技术
从骨骼或牙齿样品中提取DNA一向是技术上的难题。骨骼、牙齿是比较特殊的生物检材。以骨组织为例，骨细胞外存在着大量的钙化基质，为骨骼提供了良好的机械强度，但这也导致在提取DNA的过程中骨细胞常常暴露不充分，无法良好地与裂解液接触，使得DNA提取效果不佳。类似地，从致密的牙体组织中提取DNA时，也存在提取效率低下的问题。
为了提高骨骼或牙齿中DNA的提取效率，现有技术中通常采取的方式主要有两种：一是脱钙脱脂处理法，二是机械破碎法。
脱钙脱脂处理法是将样品事先进行脱钙，通常的做法是将骨骼或牙齿样品置于pH约8.0的EDTA脱钙液中，进行数十小时的脱钙，然后用有机溶剂法进行数十小时的脱脂，以除去部分细胞外基质，暴露出骨细胞。这种方式的不足之处在于耗时极长，而且会导致DNA流失，这对于样本量小的宝贵样品是非常不利的。
现有的机械破碎法是在低温下进行机械破碎，通常的做法是将样品置于盛有液氮的研钵中手工研磨。这种方式操作繁琐费力，使用时需要液氮，有导致操作人员冻伤的危险性。或者，现有的其他机械破碎方法包括用电钻钻取骨粉，或者用砸的方法破碎牙齿，都存在一定的危险性及局限性。例如，美国SPEX公司的老牌产品6770等型号的冷冻研磨机，是将样品瓶浸入液氮中，以电磁为动力，带动钢制撞子粉碎研磨，该研磨器最大可容纳样品仅为25mm大小，适用性差，机器和研磨耗材价格非常昂贵，基层单位难以承受，而且样品瓶需要反复清洗，重复使用，存在样品之间容易交叉污染的问题。
另外，近年来Life Technologies公司推出了基于BTA法的DNA提取试剂盒，该试剂盒在提取速度上有所提高，但在提取质量上仍有不足之处，且价格昂贵。
引用文献列表
1.宋利军，田芳，苏芹，路志勇：3种骨骼DNA提取方法的应用效果比较。中国法医学杂志，2016年第31卷第1期，50-52页。
2.贾东涛，韩海军，张玉红，姚建，王林生：陈旧骨骼DNA提取方法的应用研究。中国法医学杂志，2007年第22卷第4期，260-261页。
发明内容
有鉴于现有技术中存在的问题，本公开提供了一种DNA提取缓冲液，其特征在于，所述DNA提取缓冲液由TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠溶液、1mol/L的DTT溶液、10mg/mL的蛋白酶K溶液按4～5:1:1:1的体积比混合而成。
本公开还提供了一种从骨骼或牙齿中提取DNA的方法，所述从骨骼或牙齿中提取DNA的方法利用本公开提供的DNA提取缓冲液从骨骼或牙齿中提取DNA，其特征在于，所述从骨骼或牙齿中提取DNA的方法包括以下步骤：
(1)取骨骼样品或牙齿样品，清理表面杂质后干燥；
(2)将所述骨骼样品或牙齿样品放入旋转刀片式粉碎器的粉碎杯中，粉碎成粉状；
(3)取粉碎后的粉状样品0.1～0.5g，置于试管中；
(4)向粉状样品中加入DNA提取缓冲液100～400μL，浸没粉状样品，在55～58℃下裂解2～4小时；
(5)将粉状样品的固体残渣与DNA提取缓冲液分离，向分离后的DNA提取缓冲液中加入吸附液900～1200μL，混匀，再加入吸附珠粒悬液10～20μL，室温下静置15～20分钟；
(6)将吸附珠粒与上清液分离，弃去上清液，然后向吸附珠粒添加预冷的漂洗液700～800μL，混合均匀；
(7)除去漂洗液，将吸附珠粒干燥；
(8)向吸附珠粒中加入洗脱液15～100μL，充分混匀，在55～58℃下保温15～20分钟；
(9)将吸附珠粒悬液冷冻保存，或者取0.5～20μL吸附珠粒悬液，进行PCR反应。
在本公开进一步的实施方案提供的从骨骼或牙齿中提取DNA的方法中，所述步骤(2)按下列方式进行：
将所述骨骼样品或牙齿样品放入旋转刀片式粉碎器的粉碎杯中，盖上杯盖，使刀片旋转5～15秒，然后暂停2～10秒，重复旋转-暂停循环3～4次，将样品粉碎成粉状。
在本公开进一步的实施方案提供的从骨骼或牙齿中提取DNA的方法中，在所述步骤(2)中，粉碎时不向样品中添加介质，粉碎过程在室温下进行。
在本公开进一步的实施方案提供的从骨骼或牙齿中提取DNA的方法中，在所述步骤(2)中，骨骼样品或牙齿样品粉碎成粉状后，粉状样品中包含粒径为50～200μm的颗粒。
在本公开进一步的实施方案提供的从骨骼或牙齿中提取DNA的方法中，在所述步骤(1)和所述步骤(2)之间插入步骤(1.1)：用一次性无菌锯条将干燥后的所述骨骼样品或牙齿样品锯成体积约1cm3的小块；
在所述步骤(2)中，取步骤(1.1)得到的锯成小块的骨骼样品或牙齿样品，放入粉碎杯中，粉碎成粉状。
在本公开进一步的实施方案提供的从骨骼或牙齿中提取DNA的方法中，所述粉碎杯为一次性粉碎杯。
在本公开进一步的实施方案提供的从骨骼或牙齿中提取DNA的方法中：
在所述步骤(3)中，所述试管为离心套管，所述离心套管包括内管和外管，所述粉状样品置于内管中；
在所述步骤(4)中，向内管中的粉状样品滴加DNA提取缓冲液100～400μL，在56℃下裂解2小时；
在所述步骤(5)中，将离心套管置于离心机中，13000～17000rpm离心1～2分钟，然后开盖，向内管中加入吸附液100～200μL，盖上离心套管的管盖，13000～17000rpm离心1～2分钟，除去内管，向外管中加入吸附液800～1000μL，混匀，再加入吸附珠粒悬液15μL，室温下静置15～20分钟；
在所述步骤(6)中，将外管置于离心机中，7000～9000rpm离心0.5～1分钟，除去上清液体，然后向吸附珠粒添加预冷的漂洗液800μL，混合均匀；
在所述步骤(7)中，将外管置于离心机中，7000～9000g离心0.5～1分钟，除去液体，将吸附珠粒干燥。
过去，技术人员认为如果采用机械的方法对骨骼、牙齿等样品进行破碎，必须采用超低温，因此在研磨时通过添加液氮等各种方式来进行冷却。然而本发明人发现，在骨骼或牙齿的DNA提取中，不必固守破碎时必须采用超低温的观念。选择适当的室温破碎条件来处理骨骼、牙齿样品，可以达到破碎细胞但不损伤DNA的效果，既有利于提高样品中DNA抽提的效率，又能保证提取出的DNA的质量，而且操作简便快速。本发明人还优化了DNA提取缓冲液的配方，该配方的DNA提取缓冲液不但能保证优良的提取效果，还可以简化骨骼或牙齿DNA提取的步骤，减少样品转移次数，由此避免了DNA样本的流失。
与现有技术相比，本发明具有以下一方面或几方面的有益效果：
1.对骨骼、牙齿DNA的提取效率高，提取出的DNA完整性好，纯度高，样品流失少，有利于进行后续PCR处理或分析；特别地，对陈旧或微量骨骼、牙齿样品的处理效果非常突出；
2.操作简便快速，大大降低了实验人员的工作强度；
3.防止样品之间的交叉污染；
4.成本低廉。
5.操作安全性高，避免冻伤、机械损伤等易发生的其他意外性损伤。
附图说明
图1是本申请实施例中将牙齿样品粉碎后得到的粉末的一幅电镜图像。
图2是本申请实施例中将牙齿样品粉碎后得到的粉末的另一幅电镜图像。
图3是本申请实施例和比较例所提取的DNA样品、标准品进行PCR定量检测的扩增灵敏度图像。
图4是标准品得出的标准曲线和样品测得的数值在标准曲线上的标绘。
图5是本申请实施例中2018-0801-5A1号样品STR检测结果图。
图6是本申请实施例中2018-0801-5A2号样品STR检测结果图。
图7是本申请实施例中2018-0801-5A3号样品STR检测结果图。
图8是本申请实施例中2018-0801-5B1号样品STR检测结果图。
图9是本申请实施例中2018-0801-5B2号样品STR检测结果图。
图10是本申请实施例中2018-0801-5B3号样品STR检测结果图。
图11是本申请实施例中2018-0801-5C1号样品STR检测结果图。
图12是本申请实施例中2018-0801-5C2号样品STR检测结果图。
图13是本申请比较例中2018-0801-5A4号样品STR检测结果图。
图14是本申请比较例中2018-0801-5A5号样品STR检测结果图。
图15是本申请比较例中2018-0801-5B4号样品STR检测结果图。
图16是本申请比较例中2018-0801-5B5号样品STR检测结果图。
图17是本申请比较例中2018-0801-5C3号样品STR检测结果图。
具体实施方式
以下将详细说明本公开的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。在一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段未作详细描述，以便于凸显本公开的主旨。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本公开同样可以实施。
本公开示例性的从骨骼或牙齿中提取DNA的方法包括以下步骤：
(1)选取任意部位的骨骼样品或牙齿样品，清理表面杂质后干燥；可选地，如果样品体积较大，可用一次性无菌锯条将样品锯成体积约为1cm3(例如0.5～1.5cm3)的小块；
(2)将干燥的骨骼或牙齿样品放入旋转刀片式粉碎器的粉碎杯中，粉碎成粉状；
步骤(2)中使用的粉碎器为旋转刀片式粉碎器，将样品置于旋转刀片式粉碎器的粉碎杯中，盖上杯盖，通过合金钢刀片的高速旋转将样品粉碎。粉碎的具体条件没有特别限制，但本发明人通过反复试验，给出优选的粉碎方式如下：在每个旋转-暂停循环中，刀片旋转不超过15秒(例如旋转5～15秒)，然后暂停2～10秒；重复上述旋转-暂停循环3～4次，即完成样品粉碎。旋转刀片式粉碎器在工作时的功率为200W。在粉碎过程中，不需要向样品中添加诸如液氮、干冰等任何介质，粉碎过程在室温(例如15～25℃)下进行。粉碎过程完成后，样品被粉碎成粉状的细颗粒，细颗粒中包含粒径为50～200μm的颗粒。上述优选的粉碎方式对粉碎的条件进行了优化，以适当速度旋转的刀片能够将样品充分粉碎，得到的样品粒径足以保证样品中的DNA在后续步骤中被提出缓冲液充分浸出，同时粉碎过程足够快，即使在常温下不添加介质进行粉碎，也不会导致样品中的DNA在粉碎时发生明显降解，打破了过去认为骨骼/牙齿DNA提取必须用液氮冷却的技术偏见。
(3)取粉碎后的粉状样品0.1～0.5g，置于试管中；
(4)向粉状样品中加入DNA提取缓冲液100～400μL，浸没粉状样品，在55～58℃下裂解2～4小时；
本步骤中，可视检材的新鲜程度加入DNA提取缓冲液100～400μL，即加入的DNA提取缓冲液体积最多可达400μL，可以充分地对样品中的DNA进行浸出，改善提取效率，优于现有的最多只能加约200μL缓冲液的其它方法。
(5)将粉状样品的固体残渣与DNA提取缓冲液分离，向分离后的DNA提取缓冲液中加入吸附液900～1200μL，混匀；再加入吸附珠粒悬液10～20μL，室温下静置15～20分钟；
(6)将吸附珠粒与上清液分离，弃去上清液，然后向吸附珠粒添加预冷的漂洗液700～800μL，混合均匀；
(7)除去漂洗液，将吸附珠粒干燥；
(8)向吸附珠粒中加入洗脱液15～100μL，充分混匀，在55～58℃下保温10～20分钟；
(9)将吸附珠粒悬液冷冻保存，或者取0.5～20μL吸附珠粒悬液进行PCR反应。
优选地，在步骤(2)中，旋转刀片式粉碎器的粉碎杯为一次性粉碎杯，既方便操作，又可防止样品之间交叉污染。
虽然DNA提取缓冲液可以选择现有技术中常用的DNA提取液，但从优化提取效果的角度出发，优选DNA提取缓冲液由TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠溶液、1mol/L的DTT溶液、10mg/mL的蛋白酶K溶液按4～5:1:1:1的体积比混合而成。其中，TES缓冲液为生化实验手册列出的普通配方，例如配方可以是10mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.1％SDS，pH 7.0-7.5。十二烷基肌氨酸钠溶液可以是十二烷基肌氨酸钠的20％(w/v)水溶液。该DNA提取缓冲液的配方是发明人经反复试验得出的优化配方，突破常规配方，优化了DNA提取缓冲液中DTT的用量，并按适当的比例与其他组分配合，可以使骨骼、牙齿的DNA提取免去现有技术中脱钙脱脂的提取消化环节，不但使提取步骤简单、耗时大大减少，而且减少提取过程中转移样品的次数，很大程度地减少了DNA的流失。本优化配方对各种骨骼/牙齿样品的提取稳定可靠，更特别地，本优化配方对于原始样本DNA量少，或者原始样本已开始降解的情况是非常有利的，特别是在一些法医检验的场合，样品仅此一份，非常宝贵，本优化配方对提高检测成功率可起到很大的促进作用，可以对过去难以处理的样品进行高质量的提取。
优选地，在步骤(5)中，将吸附液分多次小心加入，以便使吸附液与溶解有DNA的DNA提取缓冲液充分接触。
优选地，从便利操作的角度出发，步骤(3)～(7)以吸附珠粒(例如硅珠)结合离心套管的方式进行。具体地：
在步骤(3)中，所述的试管为离心套管，例如为中国专利文献CN103146569B中公开的离心套管；离心套管包括内管和外管，所述粉状样品置于离心套管的内管中；
在步骤(4)中，向粉状样品中加入DNA提取缓冲液100～400μL的具体方式为：将DNA提取缓冲液缓慢滴加在内管中的粉状样品上，将粉状样品浸没；
步骤(5)的具体操作方式为：将整个离心套管置于离心机中，13000～17000rpm离心1～2分钟，此时DNA提取缓冲液被离心到离心套管的外管中，而粉状样品的固体残渣留在离心套管的内管中，实现了固体残渣和液体的分离；然后开盖，向离心套管的内管中加入吸附液100～200μL，盖上离心套管的管盖，13000～17000rpm离心1～2分钟，除去离心套管的内管，向外管加入吸附液800～1000μL，混匀；再加入吸附珠粒悬液10～20μL，室温下静置15～20分钟；
在步骤(6)中，将吸附珠粒与上清液分离的方式为：将离心套管的外管置于离心机中，7000～9000rpm离心0.5～1分钟，除去上清液体；
在步骤(7)中，除去漂洗液的方式为：将离心套管的外管置于离心机中，7000～9000rpm离心0.5～1分钟，除去液体。
以下将通过实施例和比较例的方式，进一步说明本发明的有利技术效果。
实施例
1、取一具地埋时间为4年的男性尸体的二颗磨牙及一颗尖牙，属于已发生降解的陈旧性检材。清理其表面杂质后晾干。二颗磨牙分别编为A、B号、尖牙编为C号。
2、将A号牙齿放入旋转刀片式粉碎器的不锈钢样品杯中，盖上杯盖，下压杯盖开始粉碎，粉碎时间每次5秒，暂停2秒后再次下压杯盖触发粉碎，反复3次，不需添加任何介质，粉碎器使用环境为室温22℃。粉碎过程完成后，样品被粉碎成粒径为50～200μm的颗粒(参见图1、图2)。将粉碎好的骨粉称量3份，每份0.5g，分别编为2018-0801-5A1号、2018-0801-5A2号、2018-0801-5A3号检材；另外再称量2份骨粉，每份0.25g，分别编为2018-0801-5A4号、2018-0801-5A5号检材。
将B号牙齿放入旋转刀片式粉碎器的不锈钢样品杯中，同上述方法粉碎。将粉碎好的骨粉称量3份，每份0.5g，分别编为2018-0801-5B1号、2018-0801-5B2号、2018-0801-5B3号检材；另外再称量2份骨粉，每份0.25g，分别编为2018-0801-5B4号、2018-0801-5B5号检材。
将C号牙齿放入旋转刀片式粉碎器的不锈钢样品杯中，同上述方法粉碎。将粉碎好的骨粉称量3份，每份0.5g，分别编为2018-0801-5C1号、2018-0801-5C2号检材；另外再称量1份骨粉0.25g，编为2018-0801-5C3号检材。
3、取2018-0801-5A1号、2018-0801-5A2号2018-0801-5A3号、2018-0801-5B1号、2018-0801-5B2号、2018-0801-5B3号、2018-0801-5C1号、2018-0801-5C2号检材，放入D盾超敏DNA提取试剂盒(上海惠文生物技术有限公司)提供的1.5mL离心套管内管中。
4、准备1mol/L DTT溶液和10mg/mL蛋白酶K溶液。将试剂盒里的裂解液A(TES缓冲液)、裂解液B(十二烷基肌氨酸钠溶液)、1mol/L DTT溶液和10mg/mL蛋白酶K溶液按5:1:1:1的比例混合后，缓慢滴在内管的骨粉上，直到浸没住骨粉(约滴加了400μL)，小心盖上管盖，注意避免损伤离心管上盖外圈，56℃裂解2小时。
5、离心套管在17000rpm下离心1分钟，打开离心套管的管盖，向内管加入吸附液150μL，小心盖上管盖，17000rpm离心2分钟，去除离心套管的内管，向外管加入吸附液1000μL，混匀，加入混匀的硅珠悬液15μL，室温下静置15分钟。
6、离心套管外管在8000rpm下离心30秒，充分去除上清液体，沉淀物中加入-20℃漂洗液750μL，小心盖上管盖，将管盖压紧，充分混匀。
7、离心套管外管在8000rpm下离心30秒，尽量去除漂洗液，开启管盖状态下56℃烘干硅珠2分钟。
8、向硅珠加入洗脱液50μL，小心盖上管盖，充分混匀后56℃保温15分钟。
9、取适量硅珠悬液，以备后续检测。
比较例
使用Life Technologies生产的名为PrepFiler Express BTATMForensic DNAExtraction Kit的DNA提取试剂盒进行DNA提取，按照厂商说明操作。简言之，操作步骤为：
将实施例1的提取步骤变更为Prefiler Express BTA法：
1.将2018-0801-5A4号、2018-0801-5A5号、2018-0801-5B4号、2018-0801-5B5号、2018-0801-5C3号检材放入1.5ml移液管中，加入200μL Prefiler Express BTA裂解液，3μL1mol/L DTT溶液和7μL20mg/mL蛋白酶K溶液，混匀，使用漩涡震荡仪56℃，11rpm孵育2小时；
2.13000rpm离心2分钟；
3.将Prefiler过滤柱套到Prefiler样本管中，将离心后的上清液移至过滤柱中，13000rpm离心2分钟；丢弃过滤柱；
4.将Prefiler样本管放入Automate Express核酸提取仪的样本托盘上，按照仪器要求放入相应的纯化试剂条和EP管，选择终体积50μL；
5.关上仪器门，选择Prefiler Express BTA程序进行纯化提取；
6.仪器运行结束后，取出收集管(内有提取到的DNA样品)，进行下一步的检测。
样品检测
1.DNA样品质和量的PCR分析：
使用仪器：美国ABI 7500型实时荧光定量PCR仪(Life Tech(appliedbiosystems)，试剂盒：Thermo Fisher生产的Quantifiler Trio Kit。7500型快速实时荧光定量PCR仪是特异性靶基因检测与定量的一体化平台。7500型PCR仪器将PCR热循环、荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可以动态观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况。PCR实验结束后可以马上得到定量结果，具有灵敏度高，准确性好和线性范围宽等优点。将实施例1、比较例1中各检材提取得到的DNA样品均同时进行3份平行检测，通过参比标准品制备的标准曲线，准确地确定DNA样品的质和量。按照厂商提供的说明书操作。
分析结果：参见图3，各样品和阴性对照的扩增曲线正常，表明根据本申请的方法成功提取了可供后续分析用的DNA样品。
参见图4，对标准品倍比梯度稀释，重复做2个平行管。实施例和比较例每个样品提取液重复做3个平行管进行定量PCR检测。在构建的标准品范围内取得了较好的线性。相关系数R2均高于0.99，Eff％均大于90％。表1列出实施例和比较例每个样品各个平行实验的原始数据。
表1各样品平行实验的检测目标、量和CT值
(接上页)
(接上页)
PCR实验样品质量监控情况列于表2。表2的数据表明PCR正常进行，无异常情况产生。
表2样品质量监控情况
通过标准曲线方程和各样品CT值求得各样品的浓度，结果列于表3：
表3本公开的方法和BTA法牙齿DNA提取液的定量结果比较
2.常染色体STR检测
取实施例1、比较例1中各检材提取得到的DNA样品，每个样品12μl，使用PP21试剂盒20μl体系扩增，扩增产物应用3500XL全自动荧光分析仪进行检测，按照行业标准GA/T1163-2014分析上述检材的基因分型。STR检验结果见图5～17和表4。
将实施例1、比较例1常染色体STR进行比较，结果如表4：
表4本方法和BTA法牙齿STR检测结果比较
结果分析：
由于BTA法的牙/骨粉最大使用量是250mg，裂解液的最大使用量是200μL，而本方法的牙/骨粉最大容许使用量可达600mg，本例使用的牙齿检材地埋时间达4年，降解程度高，降解指数达7，因此本方法选用了比BTA法大一倍的用量500毫克。结果显示，除了A牙齿2018-0801-5A2号检材DNA浓度两方法接近外，其它所有检材本方法提取到的DNA浓度远高于BTA法，是BTA法的2.43～5.45倍；再根据提取到的DNA浓度和原始检材使用量换算，以等量的牙齿材料进行提取，则本申请的方法提取到的DNA总量是BTA法的1.215～2.725倍，说明本申请的方法对牙齿/骨骼样品DNA的提取收率高。
从得到的STR结果看，本方法获得的STR图谱在每个基因座的两峰之间和大片段扩增、小片段扩增的整体均衡性均好；而BTA法在D2S1338、PentaE、CSF1PO、FGA、VWA、D6S1043、D7S820多个基因座出现不均衡现象、大片段扩增、小片段扩增的整体均衡性也不如本方法。说明本申请的方法提取到的DNA样品质量好，有利于进行后续分析检验。
因此将实施例、比较例进行比较证明：本发明的方法提取效果好，优于BTA法，表现为：从同样的原料中本发明的方法提取到的DNA总量、DNA质量、获得的STR图谱均衡性均优于BTA法。BTA法是一种比传统骨骼提取方法(脱脂脱钙法)优良的较为快速的提取方法，而本发明方法更优于BTA法，说明本发明方法是目前最为优良的骨和牙齿DNA的提取方法。综合来讲，本发明从提取方法简单易行、省时省力、提取效率高、提取质量好、成本低廉等多方面取得了突出的技术效果，使骨和牙齿检验变得易于实践操作，尤其适用于普通基层技术员，使基层单位也能轻松开展骨骼/牙齿的检验工作。
案例应用：应用此种骨和牙齿粉碎研磨方法及提取方法，在郑州市公安局物证鉴定中心DNA室2016年7月开始应用至2017年底，共检验郑州本地及河南省内其它地市案件23起，检材覆盖牙齿、股骨、肱骨、指骨、肋骨，全部检验成功，其中地埋时间最长达21年。本申请的DNA提取方法检测骨骼牙齿样品稳定可靠，并成功检测了过去难以处理的陈旧、困难样品，取得了良好的效果。
本实施例仅说明本发明的技术构思及特点，其目的在于使该领域内人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种DNA提取缓冲液，其特征在于，所述DNA提取缓冲液由TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠溶液、1mol/L的DTT溶液、10mg/mL的蛋白酶K溶液按4～5:1:1:1的体积比混合而成。
2.一种从骨骼或牙齿中提取DNA的方法，所述从骨骼或牙齿中提取DNA的方法利用根据权利要求1所述的DNA提取缓冲液从骨骼或牙齿中提取DNA，其特征在于，所述从骨骼或牙齿中提取DNA的方法包括以下步骤：
(1)取骨骼样品或牙齿样品，清理表面杂质后干燥；
(2)将所述骨骼样品或牙齿样品放入旋转刀片式粉碎器的粉碎杯中，粉碎成粉状；
(3)取粉碎后的粉状样品0.1～0.5g，置于试管中；
(4)向粉状样品中加入DNA提取缓冲液100～400μL，浸没粉状样品，在55～58℃下裂解2～4小时；
(5)将粉状样品的固体残渣与DNA提取缓冲液分离，向分离后的DNA提取缓冲液中加入吸附液900～1200μL，混匀，再加入吸附珠粒悬液10～20μL，室温下静置15～20分钟；
(6)将吸附珠粒与上清液分离，弃去上清液，然后向吸附珠粒添加预冷的漂洗液700～800μL，混合均匀；
(7)除去漂洗液，将吸附珠粒干燥；
(8)向吸附珠粒中加入洗脱液15～100μL，充分混匀，在55～58℃下保温15～20分钟；
(9)将吸附珠粒悬液冷冻保存，或者取0.5～20μL吸附珠粒悬液，进行PCR反应。
3.根据权利要求2所述的从骨骼或牙齿中提取DNA的方法，其特征在于，所述步骤(2)按下列方式进行：
将所述骨骼样品或牙齿样品放入旋转刀片式粉碎器的粉碎杯中，盖上杯盖，使刀片旋转5～15秒，然后暂停2～10秒，重复旋转-暂停循环3～4次，将样品粉碎成粉状。
4.根据权利要求2或3所述的从骨骼或牙齿中提取DNA的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，粉碎时不向样品中添加介质，粉碎过程在室温下进行。
5.根据权利要求2或3所述的从骨骼或牙齿中提取DNA的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，骨骼样品或牙齿样品粉碎成粉状后，粉状样品中包含粒径为50～200μm的颗粒。
6.根据权利要求2或3所述的从骨骼或牙齿中提取DNA的方法，其特征在于，在所述步骤(1)和所述步骤(2)之间插入步骤(1.1)：用一次性无菌锯条将干燥后的所述骨骼样品或牙齿样品锯成体积约1cm3的小块；
在所述步骤(2)中，取步骤(1.1)得到的锯成小块的骨骼样品或牙齿样品，放入粉碎杯中，粉碎成粉状。
7.根据权利要求2或3所述的从骨骼或牙齿中提取DNA的方法，其特征在于，所述粉碎杯为一次性粉碎杯。
8.根据权利要求2或3所述的从骨骼或牙齿中提取DNA的方法，其特征在于：
在所述步骤(3)中，所述试管为离心套管，所述离心套管包括内管和外管，所述粉状样品置于内管中；
在所述步骤(4)中，向内管中的粉状样品滴加DNA提取缓冲液100～400μL，在56℃下裂解2小时；
在所述步骤(5)中，将离心套管置于离心机中，13000～17000rpm离心1～2分钟，然后开盖，向内管中加入吸附液100～200μL，盖上离心套管的管盖，13000～17000rpm离心1～2分钟，除去内管，向外管中加入吸附液800～1000μL，混匀，再加入吸附珠粒悬液15μL，室温下静置15～20分钟；
在所述步骤(6)中，将外管置于离心机中，7000～9000rpm离心0.5～1分钟，除去上清液体，然后向吸附珠粒添加预冷的漂洗液800μL，混合均匀；
在所述步骤(7)中，将外管置于离心机中，7000～9000g离心0.5～1分钟，除去液体，将吸附珠粒干燥。
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