CN110479450A - 一种骨组织rna研磨提取方法及研磨装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种骨组织RNA研磨提取方法，包括以下步骤：1)准备原料以及辅助试剂；2)将原料研磨成骨粉；3)将骨粉与辅助试剂加入离心机中进行分离并获得骨组织RNA提取物。同时还提供了研磨装置，包括底座、研钵、固定组件、以及研磨组件。综上所述,本发明提供了一种骨组织RNA研磨提取方法及研磨装置，通过采用本方法，能够有效提取总RNA，同时本装置结构简单，操作方便，能够有效的对骨组织进行研磨，更方便提取总RNA，本装置成本低，且能够结合自动化进行改造，实现自动化操作。

Description

一种骨组织RNA研磨提取方法及研磨装置

技术领域

本发明涉及RNA提取领域，具体而言，涉及一种骨组织RNA研磨提取方法及研磨装置。

背景技术

骨组织坚硬、骨细胞密度低、且外周质基质含有大量粘蛋白(蛋白多糖)和RNA难以分离。采用传统的研磨以及匀质机等机器研磨等方式无法充分有效地将骨细胞进行破解提取出高质量的总RNA。

经过海量检索，发现现有技术的提取装置和研磨提取方法如公开号为US2019225959A1提供了用于从固定的石蜡包埋的样品(例如，FFPET样品)中快速提取核酸的方法和试剂。在一些实施方案中，所述方法包括在裂解溶液中温育所述组织样品的一个或多个部分，所述裂解溶液包含足以将所述溶液的pH维持在约pH4至约pH9的pH的缓冲液；离液剂；螯合剂；和洗涤剂；其中温育的温度范围为约50℃至约100℃；并从所述裂解溶液中回收核酸。或如公开号为CN105018473A公开的一种分批破碎样品以进行植物RNA提取的方法。一种与该方法相关的装置，包括泡沫箱，离心管架，离心管，泡沫块和固定件，其中2mL的离心管框架放置在泡沫箱内并用泡沫块固定，然后预先用液氮冷却泡沫箱，将含有样品和钢球的离心管放入液氮中，然后用镊子放在泡沫箱内的离心管架上，使植物样品处于低温液体中氮气保护，通过快速摇动分批粉碎，满足RNA提取和样品破碎的要求。采用该方法，可以同时粉碎多个植物样品，大大缩短RNA提取过程中样品破碎所花费的时间，保存样品，样品无交叉感染，始终处于低温保护状态，并且避免了RNA的降解。或如公开号为CN106434633A公开了一种骨组织RNA快速提取试剂盒，包括至少一个基因组DNA清除柱、至少一个RNA吸附柱以及与基因组DNA清除柱配合使用的裂解液和与RNA吸附柱配合使用的洗脱液。本发明的有益效果是：试剂盒采用独有的不含苯酚/氯仿配方的裂解液，并添加多种成分去除骨组织蛋白多糖。采用独特的缓冲体系和双硅胶柱纯化系统解决DNA残留问题，能够得到纯度高，完整性好的骨组织RNA。独特基因组DNA清除柱技术可以有效清除基因组DNA(gDNA)残留，得到的RNA不需要DNA酶消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验，单个样品操作一般可在35分钟内完成，避免提取时间过长，RNA酶污染等原因造成RNA降解。

综上所述，现有技术中的研磨装置和研磨提取方法仅局限于研磨普通组织，传统的研钵研磨费时费力且研磨效果不佳。

发明内容

本发明提出了一种骨组织RNA研磨提取方法及研磨装置以解决所述问题，

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种骨组织RNA研磨提取方法，包括以下步骤：

1)准备原料以及辅助试剂；

2)将原料研磨成骨粉；

3)将骨粉与辅助试剂加入离心机中进行分离并获得骨组织RNA提取物。

进一步地，所述步骤2)包括锤砸以及研磨，将原料放入研钵中，用研磨棒对原料进行锤砸使其粉碎易于研磨，然后再通过研磨棒对粉碎后的原料进行碾压研磨以获得骨粉。

进一步地，所述步骤2)中在研磨过程中需要保持原料低温。

一种骨组织RNA研磨提取方法所使用的研磨装置，包括底座、研钵、固定组件、以及研磨组件；其中，

所述底座，用于承托所述研钵以及安装所述固定组件；

所述研钵，所述研钵可拆卸地固定连接于所述底座上，所述研钵用于承载原料；

所述固定组件，所述固定组件安装于所述底座上且位于所述研钵的一侧，所述固定组件用于限定所述研磨组件沿竖直方向运动；

所述研磨组件，转动连接于所述固定组件上，所述研磨组件用于对所述研钵内的原料进行研磨。。

进一步地，所述固定组件包括竖杆以及套接在所述竖杆上的连杆；其中，

所述竖杆，固定连接于所述底座上；

所述连杆，一端套接于所述竖杆上，另一端套接于所述研磨组件上。

进一步地，所述研磨组件包括从上至下依次连接曲柄摇杆、研磨棒主体、以及研磨部；其中，

所述曲柄摇杆，用于带动所述研磨棒主体转动进而带动所述研磨部转动研磨；

所述研磨棒主体，与所述固定组件连接；

所述研磨部，与所述研钵相适配，用于研磨原料。

进一步地，所述底座还包括液氮暂存槽，所述液氮暂存槽环绕于所述底座凹槽外，所述液氮暂存槽用于将原料冷冻方便研磨。

本发明所取得的有益技术效果是：

1、通过采用本方法，能够有效提取总RNA。

2、本装置结构简单，操作方便，能够有效的对骨组织进行研磨，更方便提取总RNA。

3、本装置成本低，且能够结合自动化进行改造，实现自动化操作。

附图说明

从以下结合附图的描述可以进一步理解本发明。图中的部件不一定按比例绘制，而是将重点放在示出实施例的原理上。在不同的视图中，相同的附图标记指定对应的部分。

图1是本发明实施例之一中一种骨组织RNA研磨提取方法的流程示意图；

图2是本发明实施例之一中一种骨组织RNA研磨装置的结构示意图；

图3是本发明实施例之一中一种骨组织RNA研磨装置的结构示意图。

附图标记说明：1-底座；101-底座凹槽；2-研钵；3-固定组件；301-竖杆；302-连杆；4-研磨组件；401-曲柄摇杆；402-研磨棒主体；403-研磨部。

具体实施方式

为了使得本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合其实施例，对本发明进行进一步详细说明；应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。对于本领域技术人员而言，在查阅以下详细描述之后，本实施例的其它系统、方法和/或特征将变得显而易见。旨在所有此类附加的系统、方法、特征和优点都包括在本说明书内、包括在本发明的范围内，并且受所附权利要求书的保护。在以下详细描述描述了所公开的实施例的另外的特征，并且这些特征根据以下将详细描述将是显而易见的。

本发明实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或组件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。

本发明为一种骨组织RNA研磨提取方法及研磨装置，根据附图说明所示讲述以下实施例：

实施例一：

一种骨组织RNA研磨提取方法，包括以下步骤：

1)准备原料以及辅助试剂；

2)将原料研磨成骨粉；

3)将骨粉与辅助试剂加入离心机中进行分离并获得骨组织RNA提取物。

所述步骤2)包括锤砸以及研磨，将原料放入研钵中，用研磨棒对原料进行锤砸使其粉碎易于研磨，然后再通过研磨棒对粉碎后的原料进行碾压研磨以获得骨粉。

所述步骤2)中在研磨过程中需要保持原料低温。

一种骨组织RNA研磨提取方法所使用的研磨装置，包括底座1、研钵2、固定组件3、以及研磨组件4；其中，

所述底座1，用于承托所述研钵2以及安装所述固定组件3；

所述研钵2，所述研钵2可拆卸地固定连接于所述底座1上，所述研钵2用于承载原料；

所述固定组件3，所述固定组件3安装于所述底座1上且位于所述研钵2的一侧，所述固定组件3用于限定所述研磨组件4沿竖直方向运动；

所述研磨组件4，转动连接于所述固定组件3上，所述研磨组件4用于对所述研钵2内的原料进行研磨。

所述底座1中部具有与所述研钵2相适配的凹槽101，所述底座凹槽101的中部具有一用于固定所述研钵的凸块。

所述底座1还包括液氮暂存槽，所述液氮暂存槽环绕于所述底座凹槽101外，所述液氮暂存槽用于将原料冷冻方便研磨。

所述研磨组件4包括从上至下依次连接曲柄摇杆401、研磨棒主体402、以及研磨部403；其中，

所述曲柄摇杆401，用于带动所述研磨棒主体402转动进而带动所述研磨部403转动研磨；

所述研磨棒主体402，与所述固定组件3连接；

所述研磨部403，与所述研钵2相适配，用于研磨原料。

所述研磨棒主体402与所述研磨部403之间连接有凸台，所述凸台用于卡接所述研磨部403于所述研磨棒402上。

所述固定组件3包括竖杆301以及套接在所述竖杆上的连杆302；其中，

所述竖杆301，固定连接于所述底座1上；

所述连杆302，一端套接于所述竖杆301上，另一端套接于所述研磨组件4上。

实施例二：

一种骨组织RNA研磨提取方法，包括以下步骤：

1)准备原料以及辅助试剂；

2)将原料研磨成骨粉；

3)将骨粉与辅助试剂加入离心机中进行分离并获得骨组织RNA提取物。

所述步骤2)包括锤砸以及研磨，将原料放入研钵中，用研磨棒对原料进行锤砸使其粉碎易于研磨，然后再通过研磨棒对粉碎后的原料进行碾压研磨以获得骨粉。

所述步骤2)中在研磨过程中需要保持原料低温。

所述步骤3)还包括以下步骤：

4)将部分骨粉与裂解液混合并得到裂解物；

5)将裂解物离心一段时间后静置；

6)取裂解物上清加入乙醇并混匀获得混合物；

7)将混合物加入基因组清除柱中离心，并弃掉废液；

8)将基因组清除柱子放在一个离心管内，在基因组清除柱内加裂解液，离心并收集滤液获得滤过液，取少量滤过液，加入乙醇，立即吹打混匀，获得混合物；

9)立刻将混合物加入一个吸附柱RA中，离心，弃掉废液；

10)加去蛋白液RW1，放置一段时间，离心，弃掉废液；

11)重复步骤10)；

12)将吸附柱RA放回空收集管中，离心，去除漂洗液；

13)取出吸附柱RA，放入一个离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加试剂，放置一段时间，离心。

14)如果预期RNA产量>30μg，加试剂重复步骤13)，合并两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。

一种骨组织RNA研磨提取方法所使用的研磨装置，包括底座1、研钵2、固定组件3、以及研磨组件4；其中，

所述底座1，用于承托所述研钵2以及安装所述固定组件3；

所述研钵2，所述研钵2可拆卸地固定连接于所述底座1上，所述研钵2用于承载原料；

所述固定组件3，所述固定组件3安装于所述底座1上且位于所述研钵2的一侧，所述固定组件3用于限定所述研磨组件4沿竖直方向运动；

所述研磨组件4，转动连接于所述固定组件3上，所述研磨组件4用于对所述研钵2内的原料进行研磨。

所述底座1中部具有与所述研钵2相适配的凹槽101，所述底座凹槽101的中部具有一用于固定所述研钵的凸块。

所述底座1还包括液氮暂存槽，所述液氮暂存槽环绕于所述底座凹槽101外，所述液氮暂存槽用于将原料冷冻方便研磨。

所述研磨组件4包括从上至下依次连接曲柄摇杆401、研磨棒主体402、以及研磨部403；其中，

所述曲柄摇杆401，用于带动所述研磨棒主体402转动进而带动所述研磨部403转动研磨；

所述研磨棒主体402，与所述固定组件3连接；

所述研磨部403，与所述研钵2相适配，用于研磨原料。

所述研磨棒主体402与所述研磨部403之间连接有凸台，所述凸台用于卡接所述研磨部403于所述研磨棒402上。

所述固定组件3包括竖杆301以及套接在所述竖杆上的连杆302；其中，

所述竖杆301，固定连接于所述底座1上；

所述连杆302，一端套接于所述竖杆301上，另一端套接于所述研磨组件4上。

实施例三：

一种骨组织RNA研磨提取方法，包括以下步骤：

1)准备原料以及辅助试剂；

2)将原料研磨成骨粉；

3)将骨粉与辅助试剂加入离心机中进行分离并获得骨组织RNA提取物。

所述步骤2)包括锤砸以及研磨，将原料放入研钵中，用研磨棒对原料进行锤砸使其粉碎易于研磨，然后再通过研磨棒对粉碎后的原料进行碾压研磨以获得骨粉。

所述步骤2)中在研磨过程中需要保持原料低温。

所述步骤3)还包括以下步骤：

4)短时放回65℃水浴中十分钟，中间偶尔颠倒一到两次，以帮助快速裂解。

5)将裂解物在4℃的温度以及每分钟一万三千转的条件下离心十分钟，静置沉淀不能裂解的碎片。

6)取裂解物上清转到一个新离心管。加入与上清体积1:0.5的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。

7)将混合物(每次小于720微升，多于720微升可以分两次加入)加入一个基因组清除柱中，清除柱放入收集管中以每分钟一万三千转离心两分钟，弃掉废液。

确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

8)将基因组清除柱子放在一个干净的2毫升离心管内。在基因组清除柱内加500微升裂解液，以每分钟一万三千转离心三十秒，收集含有RNA的滤液，用微量移液器较精确估计滤过液体积(通常为450-500微升左右，滤过时候损失体积应该减去)，加入0.5倍滤过液体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

9)立刻将混合物(每次小于720微升，多于720微升可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，吸附柱放入收集管中以每分钟一万三千转离心两分钟离心两分钟，弃掉废液。

确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

10)加700微升去蛋白液RW1，室温放置1分钟，以每分钟一万三千转离心30秒，弃掉废液。

11)加入500微升漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇)，以每分钟一万三千转离心30秒，弃掉废液。加入500微升漂洗液RW，重复一遍。

12)将吸附柱RA放回空收集管中，以每分钟一万三千转离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

13)取出吸附柱RA，放入一个特制离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50微升试剂(事先在70-90℃水浴中加热可提高产量)，室温放置1分钟，以每分钟一万两千转离心1分钟。

14)如果预期RNA产量>30微克，加30-50微升试剂重复步骤13)，合并两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。

一种骨组织RNA研磨提取装置，包括底座1、研钵2、固定组件3、以及研磨组件4；其中，

所述底座1，用于承托所述研钵2以及安装所述固定组件3，所述底座1由轻便且导热性差的材料组成；

所述研钵2，所述研钵2可拆卸地固定连接于所述底座1上，所述研钵2用于承载原料；所述研钵2根据需要有多种不同规格尺寸，且所述研钵2内部表面磨砂处理，更好更方便的进行研磨；

所述固定组件3，所述固定组件3安装于所述底座1上且位于所述研钵2的一侧，所述固定组件3用于限定所述研磨组件4沿竖直方向运动；所述固定组件3通过螺纹连接于所述底座1上；

所述研磨组件4，转动连接于所述固定组件3上，所述研磨组件4用于对所述研钵2内的原料进行研磨；所述研磨组件4可以通过接入电动机实现自动研磨。

所述底座1中部具有与所述研钵2相适配的凹槽101，所述底座凹槽101的中部具有一用于固定所述研钵的凸块，所述研钵2底部开有与所述凸块相适配的凹槽；所述凸块为四方柱，所述四方柱一侧具有凹槽，钢珠通过弹簧与所述四方柱的凹槽连接，所述钢珠有一部份伸出四方柱表面外部，主要用于固定所述研钵2不会乱动。

所述固定组件3包括竖杆301以及套接在所述竖杆上的连杆302；其中，

所述竖杆301，底部有螺纹，螺纹连接于所述底座1上；

所述连杆302，为两个圆环与一根筋板连接，其中一个圆环套接于所述竖杆301上，另一圆环套接于所述研磨组件4上。所述固定组件3还有用于限位用的限位件，具体的，在本实施例中，与所述竖杆301连接的圆环上开有螺纹孔或通孔，如果为螺纹孔，通过螺钉压实所述竖杆301进而实现固定；如果为通孔，所述竖杆301对应位置上开有对应通孔，通过一根插销穿过两个对应通孔对所述连杆302进行限位固定。

所述研磨组件4包括从上至下依次连接曲柄摇杆401、研磨棒主体402、以及研磨部403；其中，

所述曲柄摇杆401，用于带动所述研磨棒主体402转动进而带动所述研磨部403转动研磨；

所述研磨棒主体402，与所述固定组件3连接，为上小下大的分段圆柱结构；

所述研磨棒主体402的小圆柱部分与所述固定组件3连接，具体的，与所述连杆的圆环套接，所述小圆柱与所述曲柄摇杆401连接的一端上连接有泡沫带，用于手握研磨棒锤砸原料，为了方便锤砸操作，所述圆环与所述研磨棒主体402的大圆柱部分之间连接有弹性件，所述弹性件为弹簧，且弹簧的弹性为能够满足将所述研磨棒主体402提拉，但不妨碍拉伸的条件；所述弹性件用于将所述研磨棒主体402恢复到原位。所述研磨棒主体402的大圆柱部分为永磁铁，更好的固定所述研磨部403。

所述研磨部403，与所述研钵2相适配，用于研磨原料，用于研磨的表面磨砂，同时，所述研磨部403可以根据所述研钵2的不同进行更换，同时所述研磨部403由高硬度材料组成，保证能够砸碎具有一定硬度的原料。

所述研磨棒主体402与所述研磨部403之间连接有凸台，所述研磨部403具有与所述凸台相适配的凹槽，所述凸块为四方柱，所述四方柱一侧具有凹槽，钢珠通过弹簧与所述四方柱的凹槽连接，所述钢珠有一部份伸出四方柱表面外部，所述凸台用于卡接所述研磨部403于所述研磨棒402上。

所述底座1还包括液氮暂存槽，所述液氮暂存槽环绕于所述底座凹槽101外，所述液氮暂存槽用于将原料冷冻方便研磨。所述液氮暂存槽与所述底座1表面上连接有环状泡沫环，用于减少液氮消耗。

所述研磨部403为平头式，所述研钵2对应为平底内腔；所述研磨面部403为锥形，所述研钵2对应为斜坡式内腔。

具体操作流程：按照对应组件安装好后，通入氮气，放入原料，原料为骨组织或其他组织，比如植物，脂肪，皮肤等难研磨的组织都可以。然后手握泡沫带部分进行上下往复锤砸，将原料粉碎后转动曲柄摇杆进行碾碎，该碾碎过程能充分将骨细胞进行破解并方便后续总RNA的提取。

综上所述,本发明提供了一种骨组织RNA研磨提取方法及研磨装置，通过采用本方法，能够有效提取总RNA，同时本装置结构简单，操作方便，能够有效的对骨组织进行研磨，更方便提取总RNA，本装置成本低，且能够结合自动化进行改造，实现自动化操作。

虽然上面已经参考各种实施例描述了本发明，但是应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行许多改变和修改。也就是说上面讨论的方法，系统和设备是示例。各种配置可以适当地省略，替换或添加各种过程或组件。例如，在替代配置中，可以以与所描述的顺序不同的顺序执行方法，和/或可以添加，省略和/或组合各种部件。而且，关于某些配置描述的特征可以以各种其他配置组合，如可以以类似的方式组合配置的不同方面和元素。此外，随着技术发展其中的元素可以更新，即许多元素是示例，并不限制本公开或权利要求的范围。

在说明书中给出了具体细节以提供对包括实现的示例性配置的透彻理解。然而，可以在没有这些具体细节的情况下实践配置,例如，已经示出了众所周知的电路，过程，算法，结构和技术而没有不必要的细节，以避免模糊配置。该描述仅提供示例配置，并且不限制权利要求的范围，适用性或配置。相反，前面对配置的描述将为本领域技术人员提供用于实现所描述的技术的使能描述。在不脱离本公开的精神或范围的情况下，可以对元件的功能和布置进行各种改变。

综上，其旨在上述详细描述被认为是例示性的而非限制性的，并且应当理解，以下权利要求(包括所有等同物)旨在限定本发明的精神和范围。以上这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明的记载的内容之后，技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。

Claims (7)

1.一种骨组织RNA研磨提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)准备原料以及辅助试剂；

2)将原料研磨成骨粉；

3)将骨粉与辅助试剂加入离心机中进行分离并获得骨组织RNA提取物。

2.如权利要求1所述的一种骨组织RNA研磨提取方法，其特征在于，所述步骤2)包括锤砸以及研磨，将原料放入研钵中，用研磨棒对原料进行锤砸使其粉碎易于研磨，然后再通过研磨棒对粉碎后的原料进行碾压研磨以获得骨粉。

3.如前述权利要求之一所述的一种骨组织RNA研磨提取方法及研磨装置，其特征在于，所述步骤2)中在研磨过程中需要保持原料低温。

4.根据权利要求1-3任一项所述的一种骨组织RNA研磨提取方法所使用的研磨装置，其特征在于，包括底座、研钵、固定组件、以及研磨组件；其中，

所述底座，用于承托所述研钵以及安装所述固定组件；

所述研钵，所述研钵可拆卸地固定连接于所述底座上，所述研钵用于承载原料；

所述固定组件，所述固定组件安装于所述底座上且位于所述研钵的一侧，所述固定组件用于限定所述研磨组件沿竖直方向运动；

所述研磨组件，转动连接于所述固定组件上，所述研磨组件用于对所述研钵内的原料进行研磨。。

5.如前述权利要求之一所述的一种研磨装置，其特征在于，所述固定组件包括竖杆以及套接在所述竖杆上的连杆；其中，

所述竖杆，固定连接于所述底座上；

所述连杆，一端套接于所述竖杆上，另一端套接于所述研磨组件上。

6.如前述权利要求之一所述的一种研磨装置，其特征在于，所述研磨组件包括从上至下依次连接曲柄摇杆、研磨棒主体、以及研磨部；其中，

所述曲柄摇杆，用于带动所述研磨棒主体转动进而带动所述研磨部转动研磨；

所述研磨棒主体，与所述固定组件连接；

所述研磨部，与所述研钵相适配，用于研磨原料。

7.如前述权利要求之一所述的一种研磨装置，其特征在于，所述底座还包括液氮暂存槽，所述液氮暂存槽环绕于所述底座凹槽外，所述液氮暂存槽用于将原料冷冻方便研磨。