CN113122534A - 一种磁珠法提取干血斑基因组dna的试剂盒及提取方法 - Google Patents

一种磁珠法提取干血斑基因组dna的试剂盒及提取方法 Download PDF

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CN113122534A CN202110275943.5A CN202110275943A CN113122534A CN 113122534 A CN113122534 A CN 113122534A CN 202110275943 A CN202110275943 A CN 202110275943A CN 113122534 A CN113122534 A CN 113122534A
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胡佳佳
胡美丽
杨亮
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads

Abstract

本发明公开了一种磁珠法提取干血斑基因组DNA的试剂盒及提取方法，所述DNA提取试剂包括裂解液、磁珠以及磁珠结合液；其中，所述磁珠结合液中，硫氰酸胍质量浓度为1‑10M/L、Tris质量浓度为10‑100mM/L、EDTA的质量浓度为10‑100mM/L、Triton X‑100的体积分数为2％；或所述结合液中，硫氰酸胍的质量浓度为1‑10M/L、Tris的质量浓度为10‑100mM/L、EDTA的质量浓度为10‑100mM/L、吐温20的体积分数为1.5％。所述磁珠采用硅羟基磁珠。本发明的干血斑基因组核酸试剂盒及提取方法能够做到提取多种血液相关样本，不仅是干血斑，还包括血液样本，血凝块样本，血纱和富含血细胞的组织样本；而且提取效力高、纯度佳、产品稳定性强。

Description

一种磁珠法提取干血斑基因组DNA的试剂盒及提取方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种磁珠法提取干血斑基因组DNA的试剂盒及提取方法。
背景技术
干血斑中提取基因组核酸是一种极为常见的需求，比如婴幼儿遗传病筛查，亲子鉴定，成人多种疾病的检测，法医侦查等，需要提取干血斑中淋巴细胞的基因组，通过对于基因组的分析，其结果对于临床医学疾病诊断及治疗十分重要。目前，干血斑提取基因组DNA主要有柱膜法和磁珠法两种，为了使整个试剂盒不含有毒物质，保证了操作人员的安全，其他方法如饱和酚-氯仿法，盐析沉淀法已经基本不采用；此外，柱膜法提取不能用于机器，也不适用于自动法高通量操作，而且提取效力一般。
目前，干血斑提取基因组DNA的提取方法很难做到每次都能提到完整的基因组DNA，并且很难做到没有碎片和拖尾现象，因此，亟需研发一种干血斑基因组DNA提取试剂、试剂盒，以提取片段完整、质量稳定、条带整洁的基因组DNA，以来满足企业客户和研究所、各大高校和医疗机构相关人员的需求。
发明内容
为此，本发明提供一种磁珠法提取干血斑基因组DNA的试剂盒及提取方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明实施例提供一种DNA提取试剂，所述DNA提取试剂包括裂解液、磁珠以及磁珠结合液；
其中，所述磁珠结合液中，硫氰酸胍质量浓度为1-10M/L、Tris质量浓度为10-100mM/L、EDTA的质量浓度为10-100mM/L、Triton X-100的体积分数为2％；
或所述结合液中，硫氰酸胍的质量浓度为1-10M/L、Tris的质量浓度为10-100mM/L、EDTA的质量浓度为10-100mM/L、吐温20的体积分数为1.5％；
所述磁珠采用硅羟基磁珠。
优选的，所述DNA提取试剂包括漂洗液和洗脱液；
所述漂洗液包括第一漂洗液和第二漂洗液；
所述第一漂洗液中，PEG 6000 5-10％(w/v)、NaCl 20-50mmol/L，溶剂为无菌水；
所述第二漂洗液为75-80％的乙醇；
所述洗脱液为pH为8.0，1M/L Tris或RNase-free水。
优选的，所述裂解液中，异硫氰酸胍的摩尔浓度为0.5-5mol/L、SDS的浓度为0.1-5％、Tris-HCl缓冲液的浓度为10-80mmol/L、EDTA的浓度为0.5-10mmol/L、NaCl的浓度为5-50mmol/L、Triton X-100的体积分数为0.1-2.0％、吐温20的体积分数为0.1-2.0％。
优选的，所述磁珠的粒径为200-600nm。
本发明实施例还提供一种DNA提取试剂盒，所述DNA提取试剂盒包括上述所述的DNA提取试剂。
优选的，所述的DNA提取试剂盒还包括离心管、与磁力架配合使用。
本发明实施例还提供一种磁珠法提取干血斑基因组DNA的方法，使用上述所述的DNA提取试剂和所述的DNA提取试剂盒，包括：
1)将干血斑样品加入裂解液和蛋白酶K，预热振荡裂解，得到裂解混合液；
2)将上述裂解混合液加入混匀的硅羟基磁珠和磁珠结合液混和液中，振荡混匀；
3)将步骤2)中的混合液置于磁力架上静置，去除液体；
4)将步骤3)中的磁珠用漂洗液洗涤2次；
5)将清洗后的磁珠晾干，用洗脱液洗脱，得到纯化的基因组DNA。
优选的，所述步骤1)中，所述干血斑样品的数量为3-10片，所述裂解液的加入量为200-400μL，蛋白酶K的加入量为20-50μL，预热温度为60-70℃，振荡时间为25-40min；
所述步骤2)中，振荡时间为10min，900rpm。
优选的，所述预热温度为65℃。
优选的，所述干血斑样品的片数为3-10片，所述干血斑样品的大小为2-5mm。
所述干血斑样品的大小为3mm。
本发明具有如下优点：
本发明的干血斑基因组核酸提取试剂盒能够做到提取多种血液相关样本，而且提取效力高、纯度佳、产品稳定性强。
本发明的干血斑基因组核酸提取方法从干血斑中提取基因组DNA，采用筛选磁珠、磁珠结合液，以及独特的裂解液、缓冲液体和洗涤溶液，可以高效、专一吸附DNA，最大限度的去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物，大大提高了提取基因组核酸的质量和总量，本发明试剂盒及提取方法便于操作，提取的基因组DNA片段完整、浓度高、纯度高、质量稳定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例提供的磁珠法提取干血斑基因组DNA的方法中不同磁珠筛选试验提取基因组DNA的q值的结果比较图，基因组冷冻前测量值；
图2为本发明实施例提供的磁珠法提取干血斑基因组DNA的方法中磁珠筛选试验提取基因组DNA的q值的结果比较图，基因组冷冻后测量值；
图3为本发明实施例提供的磁珠法提取干血斑基因组DNA的方法中不同磁珠质量对应不同干血斑片数的提取基因组DNA的q值的结果比较图；
图4为本发明实施例提供的磁珠法提取干血斑基因组DNA的方法中不同磁珠与不同磁珠结合液，提取基因组DNA的q值的结果比较图；
图5为本发明实施例提供的磁珠法提取干血斑基因组DNA的方法中不同样本、不同磁珠以及相同磁珠在不同磁珠样本结合液中，提取基因组DNA的q值的结果比较图；
图6为本发明实施例提供的磁珠法提取干血斑基因组DNA的方法中不同磁珠结合液分别在65℃和75℃下，干血斑提取基因组DNA的q值的结果比较图；
图7为本发明实施例提供的磁珠法提取干血斑基因组DNA试剂盒与Thermo，天根和美基相应产品比较干血斑提取效力试验结果比较图；
图8为本发明实施例提供的磁珠法提取干血斑基因组DNA的试剂盒与CN110951725A、CN109371010A对干血斑提取基因组效力值的比较结果图；
图9为本发明实施例提供的磁珠法提取干血斑基因组DNA的试剂盒与CN110951725A、CN109371010A对干血斑提取基因组提取纯度(Qubit/Nanodrop值)结果图；
图10为本发明实施例的硅羟基磁珠的电镜图；
图11为本发明实施例的提取方法提取3片干血斑中基因组筛选14种磁珠提取q/c值，q/c值表示提取的基因组DNA的浓度的干扰因素的大小，此为冻存前的结果；
图12为本发明实施例的提取方法提取3片干血斑中基因组，筛选14种磁珠提取的OD260/280值和OD260/230值，其中，OD260/280值表示提取的基因组DNA中干扰蛋白成分的程度，OD260/230值表示提取的基因组DNA中干扰有机物成分的程度，冻存前的检测结果；
图13为本发明实施例的提取方法提取3片干血斑中基因组筛选14种磁珠提取q/c值，q/c值表示提取的基因组DNA的浓度的干扰因素的大小，此为冻存后的结果；
图14为本发明实施例的提取方法采用3片干血斑基因组DNA，筛选不同加入质量的金4磁珠的提取干扰因素大小，q/c值表示提取的基因组DNA的干扰因素的程度，此结果是冻存前的结果；
图15为本发明实施例的提取方法采用3片干血斑中基因组DNA，筛选不同加入质量的金4磁珠的提取干扰因素大小，OD260/280值表示提取的基因组DNA中污染蛋白成分程度，OD260/230值表示提取基因组DNA中污染有机物成分程度，此结果是冻存前的结果；
图16为本发明实施例的提取方法采用3片干血斑中基因组DNA，筛选不同加入质量的金4磁珠的提取干扰因素大小，q/c值表示提取的基因组DNA的干扰因素的程度，此结果是冻存后的结果；
图17为本发明实施例的提取方法采用12片干血斑中基因组DNA，筛选加入不同质量的蛋白酶K的提取干扰程度，q/c值表示提取的基因组DNA中干扰因素的程度；
图18为本发明实施例的提取方法采用12片干血斑中基因组DNA，筛选加入不同质量的蛋白酶K的提取干扰程度，OD260/280值表示提取的基因组DNA中蛋白质干扰的程度，OD260/230值表示提取的基因组DNA中有机物干扰的程度；
图19为本发明实施例的提取方法采用3片干血斑中基因组DNA，调整的步骤是磁珠与样本裂解液结合的结合液种类，q/c值表示提取的基因组DNA中杂质的干扰程度；
图20为本发明实施的方法利用不同磁珠-样本结合液提取3片干血斑基因组的OD260/280和OD260/230值的结果比较图；
图21为本发明实施例的方法采用3片干血斑中基因组DNA，调整的步骤是磁珠与样本裂解液结合的结合液种类，q/c值表示提取的基因组DNA中杂质的干扰程度；
图22为本发明实施例的提取方法提取3片干血斑中基因组DNA，调整的步骤是磁珠与样本裂解液结合的结合液种类以及样本裂解的不同温度，q/c值表示提取的基因组DNA中杂质的干扰程度；
图23为本发明实施的提取方法提取3片干血斑中基因组DNA，调整的步骤是磁珠与样本裂解液结合的结合液种类以及样本裂解的不同温度，OD260/280值表示提取的基因组DNA中干扰蛋白质的程度，OD260/230值表示提取的基因组DNA中干扰有机物的程度。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例的一种DNA提取试剂，DNA提取试剂包括裂解液、磁珠以及磁珠结合液；其中，磁珠结合液中，硫氰酸胍质量浓度为1-10M/L、Tris质量浓度为10-100mM M/L、EDTA的质量浓度为10-100mM/L、Triton X-100的体积分数为2％；或结合液中，硫氰酸胍的质量浓度为1-10M/L、Tris的质量浓度为10-100mM/L、EDTA的质量浓度为10-100mM/L、吐温20的体积分数为1.5％；磁珠采用硅羟基磁珠，磁珠的粒径为200-600nm。本发明实施的DNA提取试剂包括漂洗液、洗脱液；漂洗液包括第一漂洗液和第二漂洗液，第一漂洗液中，PEG6000 5-10％(w/v)、NaCl 20-50mmol/L，溶剂为无菌水；第二漂洗液为75-80％的乙醇；洗脱液为pH为8.0，1M/L Tris或RNase-free水。裂解液中，异硫氰酸胍的摩尔浓度为0.5-5mol/L、SDS的浓度为0.1-5％、Tris-HCl缓冲液的浓度为10-80mmol/L、EDTA的浓度为0.5-10mmol/L、NaCl的浓度为5-50mmol/L、Triton X-100的体积分数为0.1-2.0％、吐温20的体积分数为0.1-2.0％。
本发明还提供一种DNA提取试剂盒，DNA提取试剂盒包括DNA提取试剂。DNA提取试剂盒还包括离心管、与磁力架配合使用。
本发明一种磁珠法提取干血斑基因组DNA的方法，使用DNA提取试剂和提取试剂盒，包括以下步骤：1)将干血斑样品加入裂解液和蛋白酶K，预热振荡裂解，干血斑样品的数量为3-10片，裂解液的加入量为200-400μL，蛋白酶K的加入量为20-50μL，预热温度为60-70℃，振荡时间为25-40min，得到裂解混合液2)将上述裂解混合液加入混匀的硅羟基磁珠和磁珠结合液混和液中，振荡混匀，振荡时间为10min，900rpm。3)将步骤2)中的混合液置于磁力架上静置，去除液体；4)将步骤3)中的磁珠用漂洗液洗涤2次；5)将清洗后的磁珠晾干，用洗脱液洗脱，得到纯化的基因组DNA。
实施例1、利用磁珠法提取干血斑基因组DNA的试剂盒提取干血斑基因组DNA的提取方法
本实施例中，所采用的磁珠法提取干血斑基因组DNA的试剂盒包括裂解液、磁珠以及磁珠结合液，漂洗液、洗脱液和蛋白酶K。该试剂盒中，裂解液Buffer MDA为：异硫氰酸胍3mol/L、SDS 3％(w/v)、Tris-HCl 60mmol/L、EDTA 5mmol/L、NaCl 10mmol/L、Triton X-1001.0％(v/v)、Tween-20 1.0％(v/v)。
磁珠结合液Buffer DLTP为：50mM Tris 50mM EDTA，2％Triton X-100。
第一漂洗液为：Buffer DW：PEG 6000 6％(w/v)和NaCl 30mmol/L，溶剂是无菌水。
第二漂洗液为：Buffer MWE2：75％(v/v)的乙醇。
洗脱液Buffer EB为：pH8.0的1M Tris or RNase-free ddH2O。
磁珠采用300nm的硅羟基磁珠。
本实施例提供利用磁珠法提取干血斑基因组DNA试剂盒提取干血斑基因组DNA的方法，其包括以下步骤：
1、向1.5ml离心管中加入3-10片3mm大小的干血斑样品，加入200-400μL的裂解液Buffer MDA和20-50μL Proteinase K。其中，加入干血斑片数与缓冲液、蛋白酶K的加入量如表1所示。
表1
干血斑片数 Buffer MDA加入量 Proteinase K加入量
3片 200μL 20μL
5片 300μL 35μL
10片 400μL 50μL
涡旋震荡10sec后，放入预热至65℃的恒温震荡器中，恒温震荡裂解30min。
2、在干血斑样品裂解期间，向一个新的离心管中加入30μL，粒径为300nm硅羟基磁珠，600μL磁珠结合液Buffer DLTP，抽打或振荡混匀10sec，得到磁珠与磁珠结合液的混合液。干血斑样品裂解后，将磁珠与磁珠结合液的混合液短暂离心后，室温放置2min，并将裂解液上清转移至磁珠与磁珠结合液的混合液，然后将其放入恒温振荡器，室温900rpm震荡30min。
3、将离心管放置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附时小心去除液、再向离心管中加入800μL第一漂洗液Buffer DW，涡旋振荡30sec重悬磁珠，将离心管放置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附时小心去除液体。
4、重复操作步骤3一次。
5、将离心管从磁力架上取下，加入800μL第二漂洗液Buffer MWP(MWE2+4倍体积乙醇)，涡旋30sec重悬磁珠，将离心管放置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附时小心去除液体。
6、将离心管从磁力架上取下，短暂离心后，将离心管放置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附时小心去除液体，将离心管放置于磁力架上，打开管盖，室温晾干5min。
7、将离心管从磁力架上取下，加入60-100μL洗脱液Buffer EB，放入预热至65℃的恒温震荡器中，1600rpm振荡孵育10min。短暂离心后将离心管放置于磁力架上静置1min，直至磁珠被完全吸附，磁珠完全吸附后，得到基因组DNA溶液，将基因组DNA溶液转移至一个新离心管中，并保存。
实施例2、磁珠法提取干血斑基因组DNA的试剂盒磁珠的筛选
1、磁珠种类的筛选
本实施例中，选用了14中不同的磁珠，分别为第1种：磁珠ABP；第二种：金1；第3种：金2；第4种：金3；第5种：金4；第6种：金5；第7种：FineMag G珠；第8种:为1；第9种：为2；第10种：为3；第11种：为4；第12种纳米；第13种：BSMOH-500；第14种BPOH-300。其中，第1-7种为硅羟基磁珠；第8-14种为硅羧基磁珠。
如图1和图2，本实施例采用实施例1的磁珠法提取干血斑样品提取基因组DNA的筛选过程的试验结果，本实施例一共筛选了14种磁珠，最终选择比较适合的第7种磁珠(FineMag G)和第5种磁珠，但是第7种磁珠提取的基因组在冷冻后复融，其DNA浓度大大降低了，发生了降解现象，因此，选择第5种磁珠作为备选磁珠。
图11为本发明实施例的提取方法提取3片干血斑中基因组筛选14种磁珠提取q/c值，q/c值表示提取的基因组DNA的浓度的干扰因素的大小，此为冻存前的结果；图12为本发明实施例的提取方法提取3片干血斑中基因组，筛选14种磁珠提取的OD260/280值和OD260/230值，其中，OD260/280值表示提取的基因组DNA中干扰蛋白成分的程度，OD260/230值表示提取的基因组DNA中干扰有机物成分的程度，冻存前的检测结果；图13为本发明实施例的提取方法提取3片干血斑中基因组筛选14种磁珠提取q/c值，q/c值表示提取的基因组DNA的浓度的干扰因素的大小，此为冻存后的结果。通过检测结果的比较基因组DNA的纯度：Qubit值/Nanodrop值；OD260/280值以及OD260/230值，选定第5种磁珠作为本发明的提取试剂盒用的干血斑基因组DNA提取的磁珠。
如图14至23所示为本发明的提取方法的具体的筛选条件的试验过程，本发明通过筛选14中磁珠，选出能够将样本基因组提取效力最强的第5种磁珠金4作为提取试剂盒所采用磁珠，该第5种磁珠的粒径为300nm。
如图10所示，第5种磁珠的电镜图，本实施例采用的硅羟基磁珠粒径均一、分散性好、比表面积大、磁响应速度快、沉降速度慢、悬浮性好、生物相溶性好、无毒性。
2、磁珠质量的筛选
如图3所示，本实施例验证了不同质量的第5种磁珠，即磁珠F对于干血斑提取的影响，得到结果1.5mg第5种磁珠磁珠F能够满足最大量，可以满足12片干血斑的需求，将提取试剂盒的磁珠用量定为1.5mg。
实施例3、筛选干血斑样品的提取基因组DNA试剂盒中磁珠结合液的筛选
本实施例利用实施例1所述的提取方法筛选样本磁珠结合液、磁珠和细胞裂解后基因组DNA的结合需要在合适的磁珠结合液里面，为了提高提取DNA的浓度，本实施例分别采用7种磁珠结合液DLT、DLB、GHL、GHC、DP1、MLP1和AL加入等体积的异丙醇。
在不同人干血斑样本上测定本发明实施例的试剂盒的提取最佳条件，如图5所示，在5个人的干血斑样本中，测定磁珠E磁珠F在不同磁珠结合液DLB+异丙醇；DLT+异丙醇和MLP1单独的条件下，提取基因组效力大小。从实验结果看，整体的提取效力一致性很强，每组的6个数值全部在较相近的范围之内波动；同时，不同组别存在一定的差异，提取效力体现的q的数值的准确性，提取质量合格。
本实施例中所验证的磁珠结合液包括以下几种：
磁珠结合液DLT：1-10M硫氰酸胍、10-100mM Tris、10-100mM EDTA、2％Triton X-100。
磁珠结合液DLB中：1-10M硫氰酸胍、10-100mM Tris、10-100mM EDTA、1.5％Tween-20。
磁珠结合液GHC中：1-10M硫氰酸胍、10-100mM Tris、10-100mM EDTA、2％TritonX-100、1.5％Tween-20。
磁珠结合液GHL中：1-10M硫氰酸胍、10-100mM Tris、10-100mM EDTA、10-100mMNaCl、2％SDS。
磁珠结合液DP1中：1-10M硫氰酸胍、10-100mM Tris、10-100mM EDTA、10-100mMNaCl、2％SDS、PEG6000 5-30％(v/v)、2％Triton X-100。
磁珠结合液MLP1中：硫氰酸胍、10-100mM Tris、10-100mM EDTA、10-100mM NaC、2％SDS、PEG 6000 5-30％(v/v)、1.5％Tween-20。
磁珠结合液AL中：硫氰酸胍、10-100mM Tris、10-100mM EDTA、10-100mM NaCl、2％SDS、PEG 6000 5-30％(v/v)、2％Triton X-100、1.5％Tween-20。
如图4所示，本发明实施例结果证明：磁珠结合液DLT和DLB加入等体积异丙醇的组别要优于其他组别。
实施例4、筛选干血斑样品的提取基因组DNA方法中的最佳裂解温度
本实施例干血斑样本中加入裂解液后，需要在高温条件下才能发生裂解细胞，释放基因组DNA的反应，但是基因组DNA在高温条件下，尤其是长时间时，又会发生降解。
本实施例通过采用实施例2筛选的磁珠，在一定的条件下，变换不同的磁珠结合液，以及采用不同的干血斑样品的裂解温度进行试验。
如图6所示，本实施例的实验证明，65℃裂解30分钟比75℃裂解30分钟，制备得到的基因组DNA的浓度更高，纯度更好。65℃裂解条件下，既能够裂解干血斑样品上的细胞，又能够使DNA更加稳定。
试验例1
利用本发明实施例1提供的磁珠法提取干血斑基因组DNA的方法，提取得到的基因组DNA。
同时Thermo，天根和美基的血斑提取试剂盒，按照说明书进行操作提取干血斑细胞基因组DNA。
如图7所示，本发明的干血斑基因组DNA提取试剂盒提取效力较Thermo，天根和美基基因组提取试剂盒，其干血斑样本提取效力，以及基因组DNA的纯度均增加。
试验例2
1、按照本发明实施例1中提取方法提取的干血斑样品DNA提取试剂盒提取的DNA；
2、按照专利CN110951725A中的提取方法：(1)先在干血斑样本中加入裂解液和蛋白酶K，65℃条件下裂解30min；(2)取出200μL裂解液加入至磁珠样本结合液中，使磁珠结合样本；(3)第一步洗涤杂质；(4)第二步洗涤杂质；(5)65℃条件下洗脱基因组DNA。
2、按照专利CN109371010A的提取方法为：(1)先在干血斑样本中加入裂解液和蛋白酶K，65℃条件下裂解30min；(2)取出200μL裂解液加入至磁珠样本结合液中，使磁珠结合样本；(3)第一步洗涤杂质；(4)第二步洗涤杂质；(5)65℃条件下洗脱基因组DNA。
如图8和9所示，本发明实施例1对干血斑样品提取的方法，其基因组效力和基因纯度均好于对比专利试剂盒的提取方法。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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11.US2012/0156683A1。

Claims (10)

1.一种DNA提取试剂，其特征在于，所述DNA提取试剂包括裂解液、磁珠以及磁珠结合液；
其中，所述磁珠结合液中，硫氰酸胍质量浓度为1-10M/L、Tris质量浓度为10-100mM/L、EDTA的质量浓度为10-100mM/L、Triton X-100的体积分数为2％；
或所述结合液中，硫氰酸胍的质量浓度为1-10M/L、Tris的质量浓度为10-100mM/L、EDTA的质量浓度为10-100mM/L、吐温20的体积分数为1.5％；
所述磁珠采用硅羟基磁珠。
2.如权利要求1所述的DNA提取试剂，其特征在于，
所述DNA提取试剂包括漂洗液和洗脱液；
所述漂洗液包括第一漂洗液和第二漂洗液；
所述第一漂洗液中，PEG 6000 5-10％(w/v)、NaCl 20-50mmol/L，溶剂为无菌水；
所述第二漂洗液为75-80％的乙醇；
所述洗脱液为pH为8.0，1M/L Tris或RNase-free水。
3.如权利要求1所述的DNA提取试剂，其特征在于，
所述裂解液中，异硫氰酸胍的摩尔浓度为0.5-5mol/L、SDS的浓度为0.1-5％、Tris-HCl缓冲液的浓度为10-80mmol/L、EDTA的浓度为0.5-10mmol/L、NaCl的浓度为5-50mmol/L、Triton X-100的体积分数为0.1-2.0％、吐温20的体积分数为0.1-2.0％。
4.如权利要求1-3中任一项所述的DNA提取试剂，其特征在于，
所述磁珠的粒径为200-600nm。
5.一种DNA提取试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂盒包括权利要求1-3中任一所述的DNA提取试剂。
6.如权利要求5所述的DNA提取试剂盒，其特征在于，所述的DNA提取试剂盒还包括离心管、与磁力架配合使用。
7.一种磁珠法提取干血斑基因组DNA的方法，其特征在于，使用权利要求1-4中任一所述的DNA提取试剂和权利要求5或6所述的DNA提取试剂盒，包括：
1)将干血斑样品加入裂解液和蛋白酶K，预热振荡裂解，得到裂解混合液；
2)将上述裂解混合液加入混匀的硅羟基磁珠和磁珠结合液混和液中，振荡混匀；
3)将步骤2)中的混合液置于磁力架上静置，去除液体；
4)将步骤3)中的磁珠用漂洗液洗涤2次；
5)将清洗后的磁珠晾干，用洗脱液洗脱，得到纯化的基因组DNA。
8.如权利要求7所述的磁珠法提取干血斑基因组DNA的方法，其特征在于，
所述步骤1)中，所述干血斑样品的数量为3-10片，所述裂解液的加入量为200-400μL，蛋白酶K的加入量为20-50μL，预热温度为60-70℃，振荡时间为25-40min；
所述步骤2)中，振荡时间为10min，900rpm。
9.如权利要求7所述的磁珠法提取干血斑基因组DNA的方法，其特征在于，
所述预热温度为65℃。
10.如权利要求7所述的磁珠法提取干血斑基因组DNA的方法，其特征在于，
所述干血斑样品的片数为3-10片，所述干血斑样品的大小为2-5mm。
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