CN110904097A

CN110904097A - 一种用于血液游离dna提取的试剂盒

Info

Publication number: CN110904097A
Application number: CN201911374466.7A
Authority: CN
Inventors: 许明炎; 张晓妮; 张生; 沈广强
Original assignee: Haplox Biotechnology Shenzhen Co ltd
Current assignee: Haplox Biotechnology Shenzhen Co ltd
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2020-03-24

Abstract

本申请公开了一种用于血液游离DNA提取的试剂盒。本申请试剂盒包括裂解液、结合液、清洗液1和清洗液2；结合液含2‑5M异硫氰酸胍或盐酸胍、10‑100mM Tris‑HCl、10‑50mM的EDTA、5‑15％的Triton X‑100，及20‑50％无水乙醇或异丙醇；清洗液1含2‑5M异硫氰酸胍或盐酸胍、10‑100mM Tris‑HCl、10‑50mM的EDTA，及5‑10％的Triton X‑100、SDS或吐温20，及20‑50％的无水乙醇或异丙醇。本申请试剂盒，改进结合液，提高提取效率；改进清洗液1，提高磁珠cfDNA结合效率，去除杂质；提高了cfDNA回收效率和纯度，降低材料成本。

Description

一种用于血液游离DNA提取的试剂盒

技术领域

本申请涉及血液游离DNA提取技术领域，特别是涉及一种用于血液游离DNA提取的试剂盒。

背景技术

血液游离DNA(cell free DNA，cfDNA)是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。cfDNA是包含良性细胞、白细胞、病原体核酸在内的复杂混合物，其中胎儿游离DNA(cell free fetal DNA，cffDNA)和肿瘤游离DNA(cell free tumor DNA，ctDNA)只占其中很小的一部分。健康人血浆中含有少量的cfDNA，主要来源于细胞凋亡，片段主要在160-200bp或其整数倍。血液中循环的肿瘤细胞(CTC)也可以释放出游离DNA，片段主要在20-200bp，大的可以达到1000bp以上。

cfDNA最早由Mandel和Metais于1947年发现。随着对cfDNA研究的深入，发现其在疾病早期诊断、预后、检测等领域发挥着重要的作用，尤其在产前筛查、免疫性疾病诊疗、癌症筛查与治疗等方面。而且与组织样本相比，无创、易获得是cfDNA检测的显著优势，比如对晚期癌症患者进行基因检测、药效评估等均可用cfDNA进行检测。由此可见，cfDNA在临床医疗方面有着不可替代的地位。

随着cfDNA在临床医疗中的广泛应用，这也对cfDNA的提取提出了更高的要求。与基因组DNA提取不同，现有的cfDNA提取方案普遍存在回收效率低、纯度低等问题。

发明内容

本申请的目的是提供一种改进的用于血液游离DNA提取的试剂盒。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了一种用于血液游离DNA提取的试剂盒，该试剂盒采用磁珠法对血液游离DNA进行提取，该试剂盒包括磁珠、裂解液、结合液、清洗液1和清洗液2；其中，结合液中含有2-5mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)，以及5％-15％的TritonX-100、SDS和Tween-20中的至少一种，以及20％-50％的无水乙醇或异丙醇；清洗液1中含有2-5mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸，以及5％-10％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种，以及20％-50％的无水乙醇或异丙醇。

需要说明的是，磁珠法提取DNA的基本步骤包括，使用裂解液进行裂解，使用结合液使磁珠与核酸结合，使用清洗液1进行第一次清洗，使用清洗液2进行第二次清洗，然后采用洗脱液洗脱获得DNA。本申请的试剂盒通过对结合液和清洗液1进行优化改进，在磁珠与核酸结合时，采用本申请的结合液可以在结合的同时进一步进行裂解，保证裂解充分，而且本申请优化了结合液中无水乙醇或异丙醇的用量，使得cfDNA结合效率得到提升；清洗液1的优化，尤其是其中无水乙醇或异丙醇的用量优化，使磁珠能更有效地结合目的片段的cfDNA，并有效去除蛋白质、盐离子等其他杂质。本申请通过对试剂盒中结合液和清洗液1的优化，不仅能有效结合目的片段的cfDNA，而且能排除基因组DNA等其他核酸的污染，提高了cfDNA的回收效率和纯度。

还需要说明的是，本申请的关键之一即结合液和清洗液1的优化改进，至于其它组分，例如磁珠、裂解液和清洗液2，都可以参考现有的磁珠法试剂或试剂盒；但是，为了获得更好的cfDNA提取效果，本申请的优选方案中，分别对裂解液和清洗液2进行了限定，详见以下技术方案。

另外，可以理解，本申请的试剂盒除了磁珠、裂解液、结合液、清洗液1和清洗液2以外，还可以包含其它磁珠法常规使用的试剂，例如蛋白酶K、洗脱液等。其中，蛋白酶K可以组合到本申请的试剂盒中，也可以市售购买。至于洗脱液，一般DNA提取采用的洗脱液为TE溶液或者直接采用无核酸酶的灭菌去离子水，TE溶液可以自行配制或者市售购买获得，灭菌去离子水也是实验室常规使用的溶剂。因此，蛋白酶K和洗脱液可以根据需要选择性的组合在本申请的试剂盒中，在此不作具体限定。

优选的，结合液由3.5mol/L的异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、25mmol/L的乙二胺四乙酸、12％的Triton X-100和30％的异丙醇组成；清洗液1由2mol/L的异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、25mmol/L的乙二胺四乙酸、5％的Triton X-100和30％的异丙醇组成。

需要说明的是，以上组分和具体浓度是本申请的一种实现方式中具体采用的，证实具有较好cfDNA提取效果的配方，不排除可以在本申请的优选配方基础上进行化学剂量允许的调整，例如本申请剂量正负5％左右偏差，都能够基本达到本申请的效果。

优选的，裂解液中含有2-6mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸、100-500mmol/L的NaCl，以及5％-15％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种。

需要说明的是，本申请的试剂盒，通过对裂解液进行优化，可以提高裂解效率，并且，在裂解时，有效的使蛋白变性、抑制DNase活性、有利于蛋白质与DNA分离以及DNA沉淀，便于后续与磁珠结合。

优选的，裂解液由4mol/L的异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、25mmol/L的乙二胺四乙酸、300mmol/L的NaCl和12％的Triton X-100组成。

可以理解，以上组分和具体浓度也是本申请的一种实现方式中具体采用的，证实具有较好裂解效果的配方，不排除可以在本申请的优选配方基础上进行化学剂量允许的调整，例如本申请剂量正负5％左右偏差，都能够基本达到本申请的效果。

优选的，清洗液2中含有1-100mmol/L的Tris-HCl或氯化钠，以及70％-80％的无水乙醇。

优选的，清洗液2由10mmol/L的Tris-HCl或氯化钠，以及80％的无水乙醇组成。

需要说明的是，本申请对清洗液2的优化，可以进一步有效的去除盐离子等杂质，从而提高cfDNA的提取纯度。

需要说明的是，本申请的试剂盒，实际上对裂解液、结合液、清洗液1和清洗液2都分别有改进，因此，在要求较低的情况下，或者一些特殊使用情况下，本申请的裂解液、结合液、清洗液1和清洗液2都可以分别单独与现有的磁珠法试剂组合使用，从而具备相应的效果。例如，采用本申请的结合液与现有的磁珠法试剂组合，进一步保证裂解充分，提升cfDNA与磁珠的结合效率；采用本申请的裂解液与现有的磁珠法试剂组合，可以提高裂解效率、使蛋白质与DNA分离，便于后续与磁珠结合；而本申请的清洗液1和清洗液2与现有的磁珠法试剂组合，可以使磁珠能更有效地结合目的片段的cfDNA，并有效去除蛋白质、盐离子等杂质。

因此，本申请的第二方面公开了一种用于磁珠法提取血液游离DNA的结合液，该结合液即本申请试剂盒中的结合液，其中含有2-5mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸，以及5％-15％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种，以及20％-50％的无水乙醇或异丙醇。

优选的，本申请的结合液由3.5mol/L的异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、25mmol/L的乙二胺四乙酸、12％的Triton X-100和30％的异丙醇组成。

本申请的第三方面公开了一种用于磁珠法提取血液游离DNA的清洗液，该清洗液即包括本申请试剂盒的清洗液1和清洗液2。

本申请的第四方面公开了一种用于磁珠法提取血液游离DNA的裂解液，该裂解液即本申请试剂盒中的裂解液，其中含有2-6mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸、100-500mmol/L的NaCl，以及5％-15％的TritonX-100、SDS和Tween-20中的至少一种。

优选的，本申请的裂解液由4mol/L的异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、25mmol/L的乙二胺四乙酸、300mmol/L的NaCl和12％的Triton X-100组成。

本申请的第五方面公开了本申请的试剂盒、本申请的结合液、本申请的清洗液或本申请的裂解液在血液或血浆的游离DNA的提取中的应用。

可以理解，本申请的试剂盒是针对血液中的cfDNA提取而研发的，因此，其中的各试剂，例如结合液、清洗液、裂解液等都可以用于血液或血浆游离DNA的提取。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请用于血液游离DNA提取的试剂盒，通过结合液的改进和优化，提高了cfDNA的提取效率；通过清洗液1的优化，使磁珠能更有效地结合目的片段的cfDNA，并有效去除蛋白质、盐离子等杂质，排除基因组DNA等其他核酸的污染。本申请的试剂盒，通过各组分的优化改进，不仅提高了cfDNA的回收效率和提取纯度，而且各组分能够充分有效的发挥作用，降低了材料成本。

附图说明

图1是本申请实施例中样本1提取的cfDNA的安捷伦4200分析结果图；

图2是本申请实施例中样本2提取的cfDNA的安捷伦4200分析结果图。

具体实施方式

现有的磁珠法试剂或试剂盒，由于缺乏对cfDNA的针对性，使得cfDNA的提取回收效率普遍较低、纯度也较低。针对这些问题，本申请采用磁珠法，且对结合液、清洗液1的优化改良，使结合、清洗过程在提供游离DNA稳定存在环境的基础上，进一步去除蛋白、盐离子等杂质，并通过对异丙醇占比的优化，高效地结合目的片段大小的游离DNA；使结合、清洗的同时也可完成结合和片段筛选，使得cfDNA的提取效率和纯度均得到显著提高。

具体的，本申请的试剂盒包括磁珠、裂解液、结合液、清洗液1和清洗液2；其中，结合液中含有2-5mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸，以及5％-15％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种，以及20％-50％的无水乙醇或异丙醇；清洗液1中含有2-5mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸，以及5％-10％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种，以及20％-50％的无水乙醇或异丙醇。

结合液中，异硫氰酸胍和盐酸胍为高离液盐，能够破坏细胞结构，使蛋白变性；Tris-HCl缓冲体系，起稳定反应体系的pH作用；EDTA为金属离子螯合剂，可以抑制DNase活性；TritonX-100、SDS、Tween-20等为非离子型表面活性剂，能够溶解细胞膜蛋白，有利于蛋白质与DNA分离；无水乙醇和异丙醇为易溶于水的有机试剂，可以沉淀DNA。本申请对结合液的优化，使得在结合的同时进一步进行裂解，保证裂解充分，而且异丙醇比例的优化，使得游离DNA结合效率得到提升。

清洗液1中，异硫氰酸胍和盐酸胍为高离液盐，能够破坏细胞结构，使蛋白变性；Tris-HCl缓冲体系，起稳定反应体系的pH作用；EDTA为金属离子螯合剂，可以抑制DNase活性；Triton X-100、SDS、Tween-20等为非离子型表面活性剂，能够溶解细胞膜蛋白，有利于蛋白质与DNA分离；无水乙醇和异丙醇为易溶于水的有机试剂，可以沉淀DNA。本申请对清洗液1的优化，尤其是异丙醇比例的优化，使磁珠能更有效地结合目的片段的游离DNA，并有效去除蛋白质、盐离子等其他杂质；本申请通过对结合液、清洗液1中异丙醇占比的优化，不仅能有效结合目的片段的游离DNA，而且能排除基因组DNA等其他核酸的污染。

进一步的改进方案中，本申请还对裂解液进行了优化，本申请的裂解液中含有2-6mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸、100-500mmol/L的NaCl，以及5％-15％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种。

本申请的裂解液中，异硫氰酸胍和盐酸胍为高离液盐，能够破坏细胞结构，使蛋白变性；Tris-HCl缓冲体系，起稳定反应体系的pH作用；EDTA为金属离子螯合剂，可以抑制DNase活性；NaCl，提供高盐环境，使DNA充分溶于液相，与蛋白沉淀分离，在乙醇环境中，更容易形成DNA钠盐沉淀；Triton X-100、SDS、Tween-20等为非离子型表面活性剂，能够溶解细胞膜蛋白，有利于蛋白质与DNA分离。

本申请进一步的改进方案中，还对清洗液2进行了改进，本申请的清洗液2中含有1-100mmol/L的Tris-HCl或氯化钠，以及70％-80％的无水乙醇。其中，Tris-HCl或氯化钠，作为缓冲体系，起到稳定反应体系pH的作用，无水乙醇可进一步去除盐离子等杂质。

采用本申请优化改进的试剂盒，不仅能够提高cfDNA的提取效率和纯度，而且，本申请的试剂盒经核算，其提取1例样本的成本约为5.6元，仅为同类型市售产品的约1/10，大大降低了cfDNA的提取成本。

下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例一

本例的试剂盒具体包括裂解液、蛋白酶K、磁珠悬浮液、结合液、清洗液1、清洗液2和洗脱液。

其中，裂解液由4M的异硫氰酸胍、50mM的Tris-HCl、25mM的EDTA、300mM的NaCl和12％的Triton X-100组成。

蛋白酶K购自天根生化科技，磁珠悬浮液购自为度生物。

结合液由3.5M的异硫氰酸胍、50mM的Tris-HCl、25mM的EDTA、12％的Triton X-100和30％的异丙醇组成。

清洗液1由2M的异硫氰酸胍、50mM的Tris-HCl、25mM的EDTA、5％的TritonX-100和30％的异丙醇组成。

清洗液2由10mM的Tris-HCl和80％的无水乙醇组成。

洗脱液为无核酸酶的灭菌去离子水。

本例试剂盒的使用方法如下：

(1)向10mL离心管中依次加入40μL蛋白酶K、1mL血浆、100μL裂解液，震荡混匀后于于60℃金属浴中孵育20min；

(2)冷却至室温，依次加入1.25mL结合液、20μL磁珠悬浮液，震荡结合10min；

(3)置于磁力架上2-5min，弃掉液体，加入1mL清洗液1，震荡混匀30s；

(4)将液体转移至1.5mL离心管中，并上架磁吸2min，取清澈的清洗液重新涮洗10mL离心管后，再转移至1.5mL离心管中；

(5)弃掉液体，加入1mL清洗液1，震荡混匀30s，瞬离后，上架磁吸2min，弃掉上清；

(6)加入1mL清洗液2，震荡混匀30s，瞬离后，上架磁吸2min，弃掉上清；

(7)重复清洗液2清洗1次；

(8)室温晾干3-5min，加入40μL洗脱液，涡旋震散磁珠，于56℃金属浴中孵育5min；

(9)瞬离后上架磁吸，将洗脱液转移到新的离心管中，-20℃保存，即获得提取的cfDNA。

本例按照以上试剂盒和方法，对两个血浆样本进行了cfDNA提取，并对提取的cfDNA进行质量检测。具体的，本例检测了提取的两个cfDNA的A260、A280和A230；并计算A260/280，A260/230，以此表征cfDNA的纯度。采用QUBIT测定提取的两个cfDNA的浓度，并采用安捷伦4200分析提取的两个cfDNA的主片段大小和主片段的含量。各项检测结果如表1所示；安捷伦4200的分析结果如图1和图2所示，图1为样本1的分析结果图，图2为样本为的分析结果图。

表1提取的cfDNA质量检测结果

表1和图1、图2的结果显示，本例的试剂盒能够有效的提取主片段20-200bp的血浆游离DNA，并且，提取的cfDNA纯度和浓度较高，能够很好的满足后续使用需求。

实施例二

本例在实施例一的基础上，对裂解液、结合液、清洗液1和清洗液2的组分和各组分浓度进行了试验，详细如下：

1.裂解液配方试验

本例对裂解液中各组分的不同浓度进行了试验，具体如表2所示。

表2裂解液配方试验

本例按照表2配制了试验1至试验8的八种配方的裂解液，其余试剂，例如蛋白酶K、结合液、清洗液1和清洗液2等都与实施例一相同，采用实施例一相同的方法，对实施例一的血浆样本1进行cfDNA提取。并按照实施例一的方法测量所提取的cfDNA的浓度和纯度。结果显示，本例的八种配方的裂解液，最终都能够提取获得符合使用需求的cfDNA的浓度和纯度，尤其是试验2、4和6的效果相对较好，与实施例一接近。

2.结合液配方试验

本例对结合液中各组分的不同浓度进行了试验，具体如表3所示。

表3结合液配方试验

本例按照表3配制了试验1至试验6的六种配方的结合液，其余试剂，例如蛋白酶K、裂解液、清洗液1和清洗液2等都与实施例一相同，采用实施例一相同的方法，对实施例一的血浆样本1进行cfDNA提取。并按照实施例一的方法测量所提取的cfDNA的浓度和纯度。结果显示，本例的六种配方的结合液，最终都能够提取获得符合使用需求的cfDNA的浓度和纯度，尤其是试验2、4和6的效果相对较好，与实施例一接近。

3.清洗液1配方试验

本例对清洗液1中各组分的不同浓度进行了试验，具体如表4所示。

表4清洗液1配方试验

本例按照表4配制了试验1至试验6的六种配方的清洗液1，其余试剂，例如蛋白酶K、裂解液、结合液和清洗液2等都与实施例一相同，采用实施例一相同的方法，对实施例一的血浆样本1进行cfDNA提取。并按照实施例一的方法测量所提取的cfDNA的浓度和纯度。结果显示，本例的六种配方的清洗液1，最终都能够提取获得符合使用需求的cfDNA的浓度和纯度，尤其是试验4和6的效果相对较好，与实施例一接近。

4.清洗液2配方试验

本例对清洗液2中各组分的不同浓度进行了试验，具体如表5所示。

表5清洗液2配方试验

本例按照表5配制了试验1至试验6的六种配方的清洗液2，其余试剂，例如蛋白酶K、裂解液、结合液和清洗液1等都与实施例一相同，采用实施例一相同的方法，对实施例一的血浆样本1进行cfDNA提取。并按照实施例一的方法测量所提取的cfDNA的浓度和纯度。结果显示，本例的六种配方的清洗液2，最终都能够提取获得符合使用需求的cfDNA的浓度和纯度，尤其是试验2和6的效果相对较好。

以上试验结果显示，本例的试剂盒中，裂解液中含有2-6mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸、100-500mmol/L的NaCl，以及5％-15％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种；结合液中含有2-5mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸，以及5％-15％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种，以及20％-50％的无水乙醇或异丙醇；清洗液1中含有2-5mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸，以及5％-10％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种，以及20％-50％的无水乙醇或异丙醇；清洗液2中含有1-100mmol/L的Tris-HCl或氯化钠，以及70％-80％的无水乙醇；都可以基本满足本申请的cfDNA提取需求。其中，结合实施例一的结果，裂解液由4mol/L的异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、25mmol/L的乙二胺四乙酸、300mmol/L的NaCl和12％的Triton X-100组成；结合液由3.5mol/L的异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、25mmol/L的乙二胺四乙酸、12％的Triton X-100和30％的异丙醇组成；清洗液1由2mol/L的异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、25mmol/L的乙二胺四乙酸、5％的Triton X-100和30％的异丙醇组成；清洗液2由10mmol/L的Tris-HCl或氯化钠，以及80％的无水乙醇组成；效果最佳，作为本例优选的试剂盒方案。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims

1.一种用于血液游离DNA提取的试剂盒，所述试剂盒采用磁珠法对血液游离DNA进行提取，其特征在于：所述试剂盒包括磁珠、裂解液、结合液、清洗液1和清洗液2；

所述结合液中含有2-5mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸，

以及5％-15％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种，

以及20％-50％的无水乙醇或异丙醇；

所述清洗液1中含有2-5mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸，

以及5％-10％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种，

以及20％-50％的无水乙醇或异丙醇。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述结合液由3.5mol/L的异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、25mmol/L的乙二胺四乙酸、12％的Triton X-100和30％的异丙醇组成；

所述清洗液1由2mol/L的异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、25mmol/L的乙二胺四乙酸、5％的Triton X-100和30％的异丙醇组成。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述裂解液中含有2-6mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸、100-500mmol/L的NaCl，

以及5％-15％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述裂解液由4mol/L的异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、25mmol/L的乙二胺四乙酸、300mmol/L的NaCl和12％的Triton X-100组成。

5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述清洗液2中含有1-100mmol/L的Tris-HCl或氯化钠，

以及70％-80％的无水乙醇。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述清洗液2由10mmol/L的Tris-HCl或氯化钠，

以及80％的无水乙醇组成。

7.一种用于磁珠法提取血液游离DNA的结合液，其特征在于：所述结合液中含有2-5mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸，

以及5％-15％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种，

以及20％-50％的无水乙醇或异丙醇；

优选的，所述结合液由3.5mol/L的异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、25mmol/L的乙二胺四乙酸、12％的Triton X-100和30％的异丙醇组成。

8.一种用于磁珠法提取血液游离DNA的清洗液，所述清洗液包括清洗液1和清洗液2，其特征在于：所述清洗液1中含有2-5mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸，

以及5％-10％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种，

以及20％-50％的无水乙醇或异丙醇；

优选的，所述清洗液1由2mol/L的异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、25mmol/L的乙二胺四乙酸、5％的Triton X-100和30％的异丙醇组成；

优选的，所述清洗液2中含有1-100mmol/L的Tris-HCl或氯化钠，

以及70％-80％的无水乙醇；

优选的，所述清洗液2由10mmol/L的Tris-HCl或氯化钠，

以及80％的无水乙醇组成。

9.一种用于磁珠法提取血液游离DNA的裂解液，其特征在于：所述裂解液中含有2-6mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍、10-100mmol/L的Tris-HCl、10-50mmol/L的乙二胺四乙酸、100-500mmol/L的NaCl，

以及5％-15％的Triton X-100、SDS和Tween-20中的至少一种；

优选的，所述裂解液由4mol/L的异硫氰酸胍、50mmol/L的Tris-HCl、25mmol/L的乙二胺四乙酸、300mmol/L的NaCl和12％的Triton X-100组成。

10.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒、权利要求7所述的结合液、权利要求8所述的清洗液或权利要求9所述的裂解液在血液或血浆的游离DNA的提取中的应用。