CN109371018B

CN109371018B - 用于游离循环肿瘤dna提取的增强剂、提取外周血中游离循环肿瘤dna的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN109371018B
Application number: CN201811645358.4A
Authority: CN
Inventors: 潘晓西; 姬晓勇; 霍旭; 王建伟; 伍启熹; 刘倩; 刘珂弟; 唐宇
Original assignee: Beijing Youxun Medical Devices Co ltd
Current assignee: Beijing Youxun Medical Devices Co ltd
Priority date: 2018-12-30
Filing date: 2018-12-30
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2038-12-30
Also published as: CN109371018A

Abstract

本发明公开了一种用于游离循环肿瘤DNA提取的增强剂、提取外周血中游离循环肿瘤DNA的试剂盒及方法。其中，该增强剂包括：1μg/μL～5μg/μL Carrier RNA、1μg/μL～5μg/μL多聚腺苷酸、1μg/μL～5μg/μL糖原、0～5μg/μL线性丙烯酰胺、1μg/μL～5μg/μL酵母tRNA、2μg/μL～10μg/μL大马哈鱼精子DNA和/或鲱鱼精子DNA和水。本发明的用于游离循环肿瘤DNA(ctDNA)提取的增强剂，可与常规的裂解结合液、洗涤缓冲液、洗脱液等结合使用，通过特异性的结合ctDNA并沉降下来，显著地提高了ctDNA的提取效率和提取产量。

Description

用于游离循环肿瘤DNA提取的增强剂、提取外周血中游离循环肿瘤DNA的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种用于游离循环肿瘤DNA提取的增强剂、提取外周血中游离循环肿瘤DNA的试剂盒及方法。

背景技术

随着发病率和死亡率的不断增加，癌症已经成为中国人群死亡的首要原因和主要的公共健康问题。癌症治疗手段多种多样，包括放疗、化疗以及新兴的靶向治疗和免疫治疗；其中，靶向治疗是精准医学的重要组成，而对于靶向基因特异性人群的筛选尤为重要，癌症的基因检测直接关系到药物对于患者的治疗效率。目前，用于检测的主要样本类型是肿瘤组织或穿刺样本；但是组织样本均为有创操作，有时难以实施，且这些操作受肿瘤大小、部位、患者一般情况等影响，有时不能取得满意的组织，存在一系列的局限性。肿瘤细胞坏死及脱落的肿瘤细胞进入血液后凋亡释放ctDNA进入外周血。近些年血浆游离肿瘤DNA(ctDNA)被认为是一种可检测肿瘤特异性改变的样本。

ctDNA用于肿瘤突变检测优势在于：操作无创或微创；在疾病的任一进程中都可获取；可以作为一种肿瘤标记物，实现实时检测和动态检测；克服肿瘤组织的异质性。然而，目前使用ctDNA检测基因突变仍有一些技术上的挑战，主要表现为：1)ctDNA含量因人而异，并且大多数人含量较低；2)ctDNA片段相对小，大部分约为180bp,片段分布在100bp～400bp；3)ctDNA中肿瘤相关的DNA所占比例不同人差别较大，并且常因比例小而难以测出。这些限制了ctDNA在肿瘤检测中的广泛应用，因此，高效的便捷的ctDNA的提取是影响ctDNA在肿瘤检测中广泛应用的重要因素。

目前，商品化的ctDNA提取试剂盒主要有柱提法和磁珠法，柱提法提取效率高，但柱提法受样本基质干扰较大，需要离心机、真空泵等复杂仪器；磁珠法提取简单快捷，不需要复杂仪器，并且可以结合提取工作站等减少手工操作，但目前商品化的磁珠提取试剂盒提取效率一般，亟待解决提取效率的问题。

发明内容

本发明旨在提供一种用于游离循环肿瘤DNA提取的增强剂、提取外周血中游离循环肿瘤DNA的试剂盒及方法，以提高游离循环肿瘤DNA的提取效率。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于游离循环肿瘤DNA提取的增强剂。该增强剂包括：1μg/μL～5μg/μLCarrier RNA、1μg/μL～5μg/μL多聚腺苷酸、1μg/μL～5μg/μL糖原、0～5μg/μL线性丙烯酰胺、1μg/μL～5μg/μL酵母tRNA、2μg/μL～10μg/μL大马哈鱼精子DNA和/或鲱鱼精子DNA和水。

进一步地，多聚腺苷酸的残基数为2100～10000nt，线性丙烯酰胺的重均分子量为100万～500万。

进一步地，Carrier RNA、多聚腺苷酸、糖原、线性丙烯酰胺、酵母tRNA、大马哈鱼精子DNA和鲱鱼精子DNA的质量比例为1:1:1:1:1:1:1。

根据本发明的另一方面，提供了一种提取外周血中游离循环肿瘤DNA的试剂盒。该试剂盒包括上述任一种用于游离循环肿瘤DNA提取的增强剂。

进一步地，试剂盒还包括磁珠悬浮液、SDS溶液、裂解结合液、蛋白酶K、蛋白酶溶解缓冲液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液。

进一步地，裂解结合液包含45mmol/L Tris-HCl、120mmol/L NaCl、30mmol/L乙二胺四乙酸二钠、10～30mol/L异硫氰酸胍、2～4mol/L醋酸钾和5wt～10％吐温20，pH值为7.6；优选的，SDS溶液浓度为10％。

进一步地，蛋白酶溶解缓冲液包含45～75mmol/L Tris-HCl和100～120mmol/LNaCl。

进一步地，第一洗涤液包含45～75mmol/L Tris-HCl、100～120mmol/LNaCl、30～60mmol/L乙二胺四乙酸二钠和1.5wt％曲拉通，pH值为8.0；优选的，第二洗涤液包含80％的乙醇；优选的，洗脱液为无核酸酶水。

根据本发明的再一方面，提供了一种提取外周血中游离循环肿瘤DNA的方法。该方法采用上述任一种试剂盒进行提取外周血中游离循环肿瘤DNA。

进一步地，包括以下步骤：包括以下步骤：1)预先将1mg蛋白酶K预先溶于500～1000μL蛋白酶溶解缓冲液中形成蛋白酶K溶液，向离心管中加入15μL蛋白酶K溶液和50μLSDS溶液；2)转移1mL血清或血浆样品至含15μL蛋蛋白酶K溶液和50μL蛋SDS溶液离心管中；3)置于水浴锅里60℃孵育10min，每隔5min涡旋混匀1次；冰上放置5min；4)加入15μL磁珠悬浮液、1250μL裂解结合液至离心管中，涡旋混匀30秒，再加入2μL增强剂，室温颠倒混匀15分钟；5)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；6)加入500μL第一洗涤液，涡旋混匀30秒；7)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；8)加入500μL第二洗涤液，涡旋混匀30秒；9)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；10)重复步骤8)和9)一次；11)离心，收集管离心管壁上的液滴，转移至磁力架上，吸弃溶液；12)空气干燥3～5分钟；13)加52μL的洗脱液，涡旋打散磁珠，室温放置5～10分钟，期间震荡2～3次加速DNA溶解；13)转移至磁力架上，静置3分钟，转移溶解的DNA至新的离心管中保存，溶解的DNA即为游离循环肿瘤DNA。

本发明的用于游离循环肿瘤DNA(ctDNA)提取的增强剂，可与常规的裂解结合液、洗涤缓冲液、洗脱液等结合使用，通过特异性的结合ctDNA并沉降下来，显著地提高了ctDNA的提取效率和提取产量，解决了目前肿瘤外周血基因检测临床上ctDNA提取经常出现提取量不足，提取失败的问题，开发了ctDNA检测的潜力，拓宽了临床肿瘤检测ctDNA的应用范围，提高了ctDNA的应用价值。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1和图2分别示出了实施例1的试剂盒和DNA提取试剂盒A29319临床样本1的检测结果；

图3和图4分别示出了实施例1的试剂盒和DNA提取试剂盒A29319临床样本2的检测结果；以及

图5和图6分别示出了实施例1的试剂盒和DNA提取试剂盒A29319临床样本3的检测结果。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种用于游离循环肿瘤DNA提取的增强剂。该增强剂包括：1μg/μL～5μg/μLCarrier RNA、1μg/μL～5μg/μL多聚腺苷酸、1μg/μL～5μg/μL糖原、0～5μg/μL线性丙烯酰胺、1μg/μL～5μg/μL酵母tRNA、2μg/μL～10μg/μL大马哈鱼精子DNA和/或鲱鱼精子DNA和水。

目前，商业化的助沉剂大多选用单一成分独自发挥作用，而不同的成分优势不同：大马哈鱼精子DNA或鲱鱼精子DNA难以富集60bp以下的DNA片段，多聚腺苷酸却具有显著的助沉性能；110bp左右的DNA片段，糖原助沉能力较差，线性丙烯酰胺的助沉性能优于糖原。因此，单一组分具有缺陷，甚至在提取效率上出现反作用，使得提取效率降低；本发明创造性的选用多种助沉剂成分，多种助沉剂相互协同发挥作用可以达到优势互补，弥补缺陷。鉴于ctDNA分子片段波动较大(100bp～400bp)，因此，多种助沉剂同时发挥助沉作用，可以更高产、更全面、更完整的获得血浆中ctDNA。

优选的，多聚腺苷酸的残基数为2100～10000nt，更优选的为2100～5000nt，线性丙烯酰胺的重均分子量为100万～500万。此残基数的多聚腺苷酸和此重均分子量的线性丙烯酰胺配合使用，能够更好的分离片段大小在100～400bp的ctDNA。

更优选的，Carrier RNA、多聚腺苷酸、糖原、线性丙烯酰胺、酵母tRNA、大马哈鱼精子DNA和鲱鱼精子DNA的质量比例为1:1:1:1:1:1:1。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种提取外周血中游离循环肿瘤DNA的试剂盒。该试剂盒包括上述任一种用于游离循环肿瘤DNA提取的增强剂。

优选的，为了使用方便，试剂盒还包括磁珠悬浮液、SDS溶液、裂解结合液、蛋白酶K、蛋白酶溶解缓冲液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液。

更优选的，裂解结合液包含45mmol/L Tris-HCl、120mmol/LNaCl、30mmol/L乙二胺四乙酸二钠、10～30mol/L异硫氰酸胍、2～4mol/L醋酸钾和5wt～10％吐温20，pH值为7.6。该裂解结合液能够充分发挥裂解功能，具有裂解彻底的优点；优选的，SDS溶液浓度为10％。

更优选的，蛋白酶溶解缓冲液包含45～75mmol/L Tris-HCl和100～120mmol/LNaCl。该蛋白酶溶解缓冲液具有溶解效率高，对DNA无损伤优点。

更优选的，第一洗涤液包含45～75mmol/L Tris-HCl、100～120mmol/LNaCl、30～60mmol/L乙二胺四乙酸二钠和1.5wt％曲拉通，pH值为8.0；该第一洗涤液具有洗涤效率高的优点。优选的，第二洗涤液包含80％的乙醇；优选的，洗脱液为无核酸酶水。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种提取外周血中游离循环肿瘤DNA的方法。该方法采用上述任一种试剂盒进行提取外周血中游离循环肿瘤DNA。该试剂盒能够显著提供ctDNA的提取效率和提取产量。

优选的，包括以下步骤：包括以下步骤：1)预先将1mg蛋白酶K预先溶于500～1000μL蛋白酶溶解缓冲液中形成蛋白酶K溶液，向离心管中加入15μL蛋白酶K溶液和50μL SDS溶液；2)转移1mL血清或血浆样品至含15μL蛋蛋白酶K溶液和50μL蛋SDS溶液离心管中；3)置于水浴锅里60℃孵育10min，每隔5min涡旋混匀1次；冰上放置5min；4)加入15μL磁珠悬浮液、1250μL裂解结合液至离心管中，涡旋混匀30秒，再加入2μL增强剂，室温颠倒混匀15分钟；5)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；6)加入500μL第一洗涤液，涡旋混匀30秒；7)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；8)加入500μL第二洗涤液，涡旋混匀30秒；9)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；10)重复步骤8)和9)一次；11)离心，收集管离心管壁上的液滴，转移至磁力架上，吸弃溶液；12)空气干燥3～5分钟；13)加52μL的洗脱液，涡旋打散磁珠，室温放置5～10分钟，期间震荡2～3次加速DNA溶解；13)转移至磁力架上，静置3分钟，转移溶解的DNA至新的离心管中保存，溶解的DNA即为游离循环肿瘤DNA。

在本发明一实施方式中，试剂盒由以下试剂组成：

1.磁珠悬浮液G购于life公司；

2.SDS溶液购于life公司，浓度为10％；

3.裂解结合液：45mmol/L Tris-HCl、120mmol/LNaCl、30mmol/L乙二胺四乙酸二钠、10mol/L异硫氰酸胍、2mol/L醋酸钾、5wt％吐温20，pH值为7.6；

4.蛋白酶K购于life公司；

5.蛋白酶溶解缓冲液：45mmol/L Tris-HCl、120mmol/LNaCl；

6.第一洗涤液：45mmol/L Tris-HCl、120mmol/LNaCl、30mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1.5wt％曲拉通，pH值为8.0；

7.第二洗涤液：80％的乙醇；

8.洗脱液AE：无核酸酶水；

9.增强剂：1μg/μL～5μg/μLCarrier RNA、1μg/μL～5μg/μL多聚腺苷酸、1μg/μL～5μg/μL糖原、0～5μg/μL线性丙烯酰胺、1μg/μL～5μg/μL酵母tRNA、2μg/μL～10μg/μL大马哈鱼精子DNA和/或鲱鱼精子DNA和水，Carrier RNA、多聚腺苷酸、糖原、线性丙烯酰胺(linearacrylamide)、酵母tRNA、大马哈鱼精子DNA、鲱鱼精子DNA，按1:1:1:1:1:1:1的质量比例混合缓冲液制成，缓冲液为水。

采用该试剂盒提取游离ctDNA的提取方法包括以下步骤：

1.向2.0mL的离心管中加入15μL蛋白酶K(1mg蛋白酶K预先溶于蛋白酶溶解缓冲液中)和50μL SDS溶液；

2.转移1mL血清或血浆样品至含15μL蛋白酶K和50μL SDS溶液的离心管中；

3.置于水浴锅里60℃孵育10min，每隔5min涡旋混匀1次；冰上放置5min。

4.加入15μL磁珠悬浮液G，1250μL裂解结合液至样品中，涡旋混匀30秒，此时，再加入2μL增强液，室温颠倒混匀15分钟；

5.转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃所有溶液；

6.加入500μL洗涤液1，涡旋混匀30秒；

7.转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，小心吸弃所有溶液；

8.加入500μL洗涤液2，涡旋混匀30秒；

9.转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，小心吸弃所有溶液；

10.重复第7-8步一次；

11.短暂离心，收集管壁上的液滴，转移至磁力架上，小心吸弃所有溶液；

12.空气干燥3-5分钟；

13.加52μL的洗脱液AE，涡旋打散磁珠，室温放置5-10分钟，期间轻轻震荡2-3次加速DNA溶解；

14.转移至磁力架上，静置3分钟，转移DNA至新的1.5ml离心管中，并于适当的条件保存。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。下面实施例中未写明的试剂或方法可采用本发明常规的试剂或技术手段实现。

实施例1

本实施例试剂盒由以下试剂组成：

1.磁珠悬浮液G购于life公司；

2.SDS溶液购于life公司，浓度为10％；

4.蛋白酶K购于life公司；

5.蛋白酶溶解缓冲液：45mmol/L Tris-HCl、120mmol/LNaCl；

6.洗涤液1：45mmol/L Tris-HCl、120mmol/LNaCl、30mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1.5wt％曲拉通，pH值为8.0；

7.洗涤液2：80％的乙醇；

8.洗脱液AE：无核酸酶水；

9.增强剂：终浓度为2.5μg/μLCarrier RNA、2.5μg/μL多聚腺苷酸、2.5μg/μL糖原、2.5μg/μL线性丙烯酰胺(linear acrylamide)、2.5μg/μL酵母tRNA、2.5μg/μL大马哈鱼精子DNA、2.5μg/μL鲱鱼精子DNA，缓冲液为水。

本实施例游离ctDNA提取方法：

2.转移1mL血清或血浆样品至含15μL蛋白酶K溶液和50μL SDS溶液的离心管中；

3.加入15μL磁珠悬浮液G，1250μL裂解结合液至样品中，涡旋混匀30秒，此时，再加入2μL增强液，室温颠倒混匀15分钟；

4.转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃所有溶液；

5.加入500μL洗涤液1，涡旋混匀30秒；

6.转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，小心吸弃所有溶液；

7.加入500μL洗涤液2，涡旋混匀30秒；

8.转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，小心吸弃所有溶液；

9.重复第7-8步一次；

10.短暂离心，收集管壁上的液滴，转移至磁力架上，小心吸弃所有溶液；

11.空气干燥3-5分钟；

12.加52μL的洗脱液AE，涡旋打散磁珠，室温放置5-10分钟，期间轻轻震荡2-3次加速DNA溶解；

13.转移至磁力架上，静置3分钟，转移DNA至新的1.5ml离心管中，并于适当的条件保存。

一、本实施例增强剂不同成分比例的优化

采用本实施例的试剂盒及方法，进行增强剂成分质量比例的优化，除了增强剂外，其他组分不调整，分为三组。增强剂1组，Carrier RNA、多聚腺苷酸、糖原、线性丙烯酰胺、酵母tRNA、大马哈鱼精子DNA和鲱鱼精子DNA按质量比例1:1:1:1:1:1:1混合；终浓度均为2.5μg/μL。增强剂2组，Carrier RNA、多聚腺苷酸、糖原、线性丙烯酰胺、酵母tRNA、大马哈鱼精子DNA和鲱鱼精子DNA按质量比例1:2:1:2:1:2:1混合，终浓度分别为2.5μg/μL，5μg/μL，2.5μg/μL，5μg/μL，2.5μg/μL，5μg/μL，2.5μg/μL。增强剂3组，Carrier RNA、多聚腺苷酸、糖原、线性丙烯酰胺、酵母tRNA、大马哈鱼精子DNA和鲱鱼精子DNA按质量比例2:1:2:1:2:1:2混合；终浓度分别为5μg/μL，2.5μg/μL，5μg/μL，2.5μg/μL，5μg/μL，2.5μg/μL，5μg/μL。提取3个8ml临床外周血血浆样本；每个实验流程1ml提取，每个样本共提取8次，8次提取的DNA混合后，用qPCR定量测量提取量，结果见下表1：

表1

结论：增强剂1组，Carrier RNA、多聚腺苷酸、糖原、线性丙烯酰胺、酵母tRNA、大马哈鱼精子DNA和鲱鱼精子DNA按质量比例1:1:1:1:1:1:1混合；终浓度均为2.5μg/μL。最大幅度提高了ctDNA的提取量，实现了最优的ctDNA助沉效果。

二、采用本实施例的试剂盒及方法与life公司磁珠法游离DNA提取试剂盒A29319(简称DNA提取试剂盒A29319)提取3个8ml临床外周血血浆样本；每个实验流程1ml提取，每个样本共提取8次，8次提取的DNA混合后，用qPCR定量测量提取量，结果见下表2：

表2

由表2结果可见，本发明的试剂盒提取的ctDNA总量显著高于DNA提取试剂盒A29319。

三、用Tapestation 2100测量片段大小，各取2ng上样检测2100片段大小，本实施例提取的ctDNA与DNA提取试剂盒A29319由图1～图6(其中图1和图2分别为本实施例的试剂盒和DNA提取试剂盒A29319临床样本1的检测结果；其中图3和图4分别为本实施例的试剂盒和DNA提取试剂盒A29319临床样本2的检测结果；其中图5和图6分别为本实施例的试剂盒和DNA提取试剂盒A29319临床样本3的检测结果)可见，主要片段大小均在100bp～400bp之间，与文献报道的ctDNA主要片段大小一致，表明本实施例提取试剂盒性能优秀，提取过程对ctDNA无损伤。

四、上述提取的每个临床样本各取20ng执行相同的文库构建过程、芯片上机过程和生物信息分析过程，比较检测结果：临床样本2，本公司产品提取检测结果与临床医院结果一致为阳性，而对比公司产品结果为阴性。表明我公司产品提取性能优秀，对提取的ctDNA无损伤。详细结果见下表3：

表3

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于游离循环肿瘤DNA提取的增强剂，其特征在于，包括：1μg/μL～5μg/μLCarrier RNA、1μg/μL～5μg/μL多聚腺苷酸、1μg/μL～5μg/μL糖原、0～5μg/μL线性丙烯酰胺、1μg/μL～5μg/μL酵母tRNA、2μg/μL～10μg/μL大马哈鱼精子DNA和/或鲱鱼精子DNA和水；所述多聚腺苷酸的残基数为2100～10000nt，所述线性丙烯酰胺的重均分子量为100万～500万；所述Carrier RNA、所述多聚腺苷酸、所述糖原、所述线性丙烯酰胺、所述酵母tRNA、所述大马哈鱼精子DNA和所述鲱鱼精子DNA的质量比例为1:1:1:1:1:1:1。

2.一种提取外周血中游离循环肿瘤DNA的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的用于游离循环肿瘤DNA提取的增强剂。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括磁珠悬浮液、SDS溶液、裂解结合液、蛋白酶K、蛋白酶溶解缓冲液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解结合液包含45mmol/L Tris-HCl、120mmol/LNaCl、30mmol/L乙二胺四乙酸二钠、10～30mol/L异硫氰酸胍、2～4mol/L醋酸钾和5wt～10％吐温20，pH值为7.6。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述SDS溶液浓度为10％。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶溶解缓冲液包含45～75mmol/L Tris-HCl和100～120mmol/LNaCl。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述第一洗涤液包含45～75mmol/LTris-HCl、100～120mmol/LNaCl、30～60mmol/L乙二胺四乙酸二钠和1.5wt％曲拉通，pH值为8.0。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述第二洗涤液包含80％的乙醇。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为无核酸酶水。

10.一种提取外周血中游离循环肿瘤DNA的方法，其特征在于，采用如权利要求2至9中任一项所述的试剂盒进行提取外周血中游离循环肿瘤DNA。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)预先将1mg蛋白酶K预先溶于500～1000μL蛋白酶溶解缓冲液中形成蛋白酶K溶液，向离心管中加入15μL所述蛋白酶K溶液和50μLSDS溶液；

2)转移1mL血清或血浆样品至含15μL所述蛋白酶K溶液和50μL所述SDS溶液所述离心管中；

3)置于水浴锅里60℃孵育10min，每隔5min涡旋混匀1次；冰上放置5min；

4)加入15μL磁珠悬浮液、1250μL裂解结合液至所述离心管中，涡旋混匀30秒，再加入2μL增强剂，室温颠倒混匀15分钟；

5)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；

6)加入500μL第一洗涤液，涡旋混匀30秒；

7)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；

8)加入500μL第二洗涤液，涡旋混匀30秒；

9)转移至磁力架上，静置3分钟吸附磁珠，吸弃溶液；

10)重复步骤8)和9)一次；

11)离心，收集管所述离心管壁上的液滴，转移至磁力架上，吸弃溶液；

12)空气干燥3～5分钟；

13)加52μL的洗脱液，涡旋打散磁珠，室温放置5～10分钟，期间震荡2～3次加速DNA溶解；

13)转移至磁力架上，静置3分钟，转移溶解的DNA至新的离心管中保存，所述溶解的DNA即为游离循环肿瘤DNA。