CN108220282A - 一种游离dna的提取试剂以及提取方法 - Google Patents

一种游离dna的提取试剂以及提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因提取领域，具体而言，涉及一种游离DNA的提取试剂以及提取方法。一种游离DNA的提取试剂，包括缓冲液GHB、洗涤液GDW、漂洗液GDF、洗脱液EB中的任一种或多种。本发明克服现有技术在游离DNA提取过程中，纯化效率低、纯度差的缺陷，提供一种简单、方便、不易污染的游离DNA试剂与提取方法，该方法可用于从血浆、血清中低量游离DNA的提取，具备选择性提取100‑200bp片段范围的核酸。

Description

一种游离DNA的提取试剂以及提取方法
技术领域
本发明涉及基因提取领域，具体而言，涉及一种游离DNA的提取试剂以及提取方法。
背景技术
血中游离DNA简称循环核酸(circulating nucleic acid)，是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。最早由Mandel和Metais于1947年发现，但由于缺乏高灵敏性和高特异性的实验方法，导致有关血中游离DNA与疾病相关性的研究在较长时期内进展缓慢。直到有效分离游离DNA技术的出现，和特殊荧光染料与PCR技术相结合的检测技术的应用，使这一领域的研究在最近二十多年得到了较迅速发展。自发现血中游离DNA可含肿瘤细胞DNA相同基因突变后，应用分子生物学手段对循环游离核酸的研究的兴趣日益增加。
血中游离DNA在疾病的早期诊断、预后、监测等方面具有重要潜在价值。尤其是在产前诊断、免疫性疾病病情分析与疗效观察以及肿瘤相关分析都有较好的应用。在肿瘤相关病情分析中的价值尤为重要，虽然目前血中游离DNA分析尚未列为临床必需的检测指标，但数以千计的研究论文和大量一期和二期临床试验的数据，有力支持这一新技术在肿瘤防治中的巨大应用价值。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明克服现有技术在游离DNA提取过程中，纯化效率低、纯度差的缺陷，提供一种简单、方便、不易污染的游离DNA试剂与提取方法，该方法可用于从血浆、血清中低量游离DNA的提取，具备选择性提取100-200bp片段范围的核酸。
在生物行业各领域都追求高通量、自动化、低检测限的今天，传统DNA提取方法的局限愈来愈明显，而磁珠法DNA提取的优势则愈来愈明显：能够实现自动化、大批量操作；操作简单、用时短；不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，安全无毒完全符合现代环保理念；与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。磁珠法提取DNA试剂盒要比传统的方法(Chelex100法、有机法、二氧化硅法、盐析法等)更为简单、方便，转移离心管的次数较少，不易污染、提取效率高等优势。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种游离DNA的提取试剂，包括缓冲液GHB、洗涤液GDW、漂洗液GDF、洗脱液EB中的任一种或多种；
所述缓冲液GHB的工作液含有以下成分：蛋白质变性剂3.8-4.5mol/L，Triton X-100体积百分数为0.8％-1.5％，Tris0.008-0.015mol/L，pH为5.8-6.5；
所述洗涤液GDW含有以下成分：NaCl 9.5-10.5g/L，Tris0.008-0.015mol/L，pH为7.5-8.5；
所述洗涤液GDW的工作液为：所述洗涤液GDW与溶剂以体积比为1:3-5混合而成的混合液；
所述漂洗液GDF含有以下成分：盐酸胍890-900g/L，Tris0.03-0.04mol/L，pH为7.5-8.5；
所述漂洗液GDF的工作液为：所述漂洗液GDF与溶剂以体积比为1.3:1.5-2.0混合而成的混合液；
所述洗脱液EB的工作液含有以下成分：Tris 0.008-0.015mol/L，pH为7.5-8.5。
本发明提供的游离DNA的提取试剂，各试剂之间配合，通过磁珠法能有效提取游离DNA，该方法更简单、方便，转移离心管的次数较少，不易污染等优势。
本发明中，各试剂之间有工作液以及原始液区分，工作液表示在提取过程中所用的试剂，而原始液则是未稀释之前的储存液，因此，在本发明公开工作液各成分含量的基础上，相应可以推知的原始液成分的相关含量也在本发明的保护范围内。
进一步地，所述游离DNA的提取试剂还包括蛋白酶K、磁珠中的一种或两种。
进一步地，所述蛋白酶K以蛋白酶K液的形式存在；
所述蛋白酶K液中，所述蛋白酶K的工作浓度为18-25mg/ml。如在不同的实施例中，蛋白酶K的工作浓度可以为18mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、24mg/ml、25mg/ml等等。
进一步地，所述磁珠为表面修饰有硅羟基的超顺磁性纳米微球。
经试验发现，相对于普通的超顺磁性微球，选用表面修饰有硅羟基的超顺磁性微球提取效果更佳。
进一步地，所述磁珠以磁珠液形式存在，以便于使用添加。
所述磁珠液中，所述磁珠的工作浓度为10-50mg/ml。如在不同的实施例中，磁珠的工作浓度可以为10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml等等。
所述磁珠液选用的溶剂为体积百分含量为18％-25％的乙醇水溶液。
磁珠液选用一定浓度的乙醇水溶液增加磁珠以其他成分的融合性，提高提取效果。
如在不同的实施例中，乙醇水溶液中，乙醇的体积百分含量可以为18％、20％、22％、25％等等。
进一步地，所述蛋白质变性剂为盐酸胍或异硫氰酸胍。
优选地，所述洗涤液GDW与所述漂洗液GDF制成工作液选用的溶剂均为无水乙醇。
本发明还提供了一种游离DNA的提取方法，采用上述的提取试剂进行提取，步骤如下：
(a)待处理血液样品加入缓冲液GHB的工作液、蛋白酶K和磁珠，混匀，孵育，期间上下颠倒混匀；
(b)磁力吸附，待磁珠完全吸附时去除液体；
(c)加入洗涤液GDW的工作液，悬浮；
(d)磁力吸附，待磁珠完全吸附时去除液体；
(e)加入漂洗液GDF的工作液，悬浮，磁力吸附，待磁珠完全吸附时去除液体；
(f)重复步骤(e)，去除乙醇；
(g)加入洗脱液EB的工作液，重新悬浮，孵育，期间晃动使核酸充分洗脱；
(h)磁力吸附，待磁珠完全吸附时将核酸溶液转移，得到游离DNA提取液。
本发明提供的一种游离DNA的提取方法，方法简便，转移离心管的次数较少，不易污染，提取效果佳。
进一步地，步骤(a)中，所述缓冲液GHB的工作液的添加体积为待处理血液样品体积的1-2倍；以每ml待处理血液样品计，蛋白酶K的添加量为1-4mg，磁珠的添加量为0.2-1mg。
如在不同的实施例中，以每ml待处理血液样品计，蛋白酶K的添加量可以为1mg、2mg、3mg、4mg等等；同样地，磁珠的添加量可以为0.2mg、0.4mg、0.6mg、0.8mg、1mg等等。
进一步地，步骤(a)中，孵育10-20min，每3-5min上下颠倒混匀5-15sec。
通过适当的混匀，使得磁珠充分吸附游离DNA。
如在不同的实施例中，可以为每隔3min上下颠倒混匀5sec；也可以为每隔3min上下颠倒混匀10sec；也可以为每隔4min上下颠倒混匀15sec；也可以为每隔4min上下颠倒混匀10sec等等。
洗涤液GDW的作用主要是去除磁珠上的残留液以及杂质。进一步地，步骤(c)中，所述洗涤液GDW的工作液的添加体积为待处理血液样品体积的0.3-0.5倍。
通过添加适当的洗涤液，将杂质去除，并且有效防止洗涤液对磁珠上吸附的游离DNA的影响。
进一步地，步骤(e)中，所述漂洗液GDF的工作液的添加体积为待处理血液样品体积的0.2-0.4倍。
漂洗液GDF的作用是进一步去除游离DNA中残留的杂质。
进一步地，步骤(c)和步骤(e)中，悬浮为：上下颠倒混匀20-40sec使磁珠充分悬浮，离心以去除容器内壁的液滴。
进一步地，步骤(g)中，所述洗脱液EB的工作液的添加体积为待处理血液样品体积的2％-10％；
所述孵育的温度为56±3℃，孵育时间为3-8min，期间每2min晃动一次。
洗脱液的目的是将游离DNA从磁珠上洗脱下来，因此，选用特定的孵育温度和时间，以及每隔2min晃动一次，以充分的将游离DNA洗脱下来。
优选地，所述磁力吸附采用磁力架进行，所述磁力吸附的时间为1-2min。
优选地，得到游离DNA提取液中，游离DNA的片段的长度为100-200bp。与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的游离DNA的提取试剂，实现了游离DNA高效提取，并且，得到的游离DNA纯度高。
(2)本发明提供的游离DNA的提取方法，方法简便，转移离心管的次数较少，不易污染，提取效果佳。
(3)本发明提供的游离DNA的提取方法选择性的提取100-200bp片段范围的核酸，主要适合血浆、血清等样本，提取效果佳。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例5中提取的游离DNA的检测图；
图2为本发明实施例8中每100μl血浆的游离DNA提取效率的线性图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种游离DNA试剂，包括：缓冲液GHB、洗涤液GDW、漂洗液GDF、蛋白酶K、磁珠液、洗脱液EB。
缓冲液GHB制备：称取375.46g的盐酸胍，吸取10ml Triton X-100和10ml 1M Tris溶液至容器中，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH为6.0，加入纯化水定容至1L。
洗涤液GDW制备：称取9.84g NaCl粉末，并加入800ml纯化水，取10ml 1M Tris溶液，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH为8.0，加入纯化水定容至1L。
漂洗液GDF制备：称取893g盐酸胍粉末，33.3ml 1M Tris溶液，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH为8.0，加入纯化水定容至1L。
洗脱液EB制备过程：取10ml 1MTris溶液至于容器中，并加入800ml纯化水，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH为8.0，加纯化水定容至1L。
1M Tris溶液：称取一定量的Tris，加入水，溶解得到1M Tris溶液。
蛋白酶K液的制备：称取20g蛋白酶K粉加入蛋白酶K缓冲液(主要成分为Tris-HCl缓冲液(pH8.3)、氯化钾等，通过市售购买或者按现有方法制备即可)定容至100ml，制成20mg/ml溶液。
磁珠液为超顺磁性微球，其表面修饰硅羟基，能在特定环境下与溶液中的核酸通过疏水、氢键、静电等作用力发生特异性结合，而不与其他杂质结合，可以迅速从样本中分离核酸。
磁珠液的制备：溶剂为体积百分含量为20％的乙醇水溶液，加入磁珠，制成磁珠浓度为20mg/ml的磁珠液。
洗涤液GDW工作液：按照1：4的体积比加入无水乙醇形成工作溶液。
漂洗液GDF工作液：按照1.3：1.7的体积比加入无水乙醇形成工作溶液。
实施例2
缓冲液GHB制备：称取531.72g异硫氰酸胍粉末替换375.46g的盐酸胍，其余与实施例1相同。
实施例3
一种游离DNA试剂，包括：缓冲液GHB、洗涤液GDW、漂洗液GDF、蛋白酶K、磁珠液、洗脱液EB。
缓冲液GHB制备：称取380g的盐酸胍，吸取8ml Triton X-100和8ml1M Tris溶液至容器中，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH为6.5，加入纯化水定容至1L。
洗涤液GDW制备：称取9.5g NaCl粉末，并加入800ml纯化水，取8ml 1M Tris溶液，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH为8.5，加入纯化水定容至1L。
漂洗液GDF制备：称取890g盐酸胍粉末，30ml 1M Tris溶液，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH为8.5，加入纯化水定容至1L。
洗脱液EB制备过程：取8ml 1MTris溶液至于容器中，并加入800ml纯化水，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH为8.5，加纯化水定容至1L。
1M Tris溶液：称取一定量的Tris，加入水，溶解得到1M Tris溶液。
蛋白酶K液的制备：称取18g蛋白酶K粉加入蛋白酶K缓冲液(主要成分为Tris-HCl缓冲液(pH8.3)、氯化钾等，通过市售购买或者按现有方法制备即可)定容至100ml，制成18mg/ml溶液。
磁珠液为超顺磁性微球，其表面修饰硅羟基，能在特定环境下与溶液中的核酸通过疏水、氢键、静电等作用力发生特异性结合，而不与其他杂质结合，可以迅速从样本中分离核酸。
磁珠液的制备：溶剂为体积百分含量为18％的乙醇水溶液，加入磁珠，制成磁珠浓度为10mg/ml的磁珠液。
洗涤液GDW工作液：按照1：3的体积比加入无水乙醇形成工作溶液。
漂洗液GDF工作液：按照1.3：1.5的体积比加入无水乙醇形成工作溶液。
实施例4
一种游离DNA试剂，包括：缓冲液GHB、洗涤液GDW、漂洗液GDF、蛋白酶K、磁珠液、洗脱液EB。
缓冲液GHB制备：称取375.46g的盐酸胍，吸取15ml Triton X-100和15ml 1M Tris溶液至容器中，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH为5.8，加入纯化水定容至1L。
洗涤液GDW制备：称取10.5g NaCl粉末，并加入800ml纯化水，取15ml 1M Tris溶液，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH为7.5，加入纯化水定容至1L。
漂洗液GDF制备：称取900g盐酸胍粉末，40ml 1M Tris溶液，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH为7.5，加入纯化水定容至1L。
洗脱液EB制备过程：取15ml 1MTris溶液至于容器中，并加入800ml纯化水，使用玻璃棒搅拌均匀后，调节pH为7.5，加纯化水定容至1L。
1M Tris溶液：称取一定量的Tris，加入水，溶解得到1M Tris溶液。
蛋白酶K液的制备：称取25g蛋白酶K粉加入蛋白酶K缓冲液(主要成分为Tris-HCl缓冲液(pH8.3)、氯化钾等，通过市售购买或者按现有方法制备即可)定容至100ml，制成25mg/ml溶液。
磁珠液为超顺磁性微球，其表面修饰硅羟基，能在特定环境下与溶液中的核酸通过疏水、氢键、静电等作用力发生特异性结合，而不与其他杂质结合，可以迅速从样本中分离核酸。
磁珠液的制备：溶剂为体积百分含量为25％的乙醇水溶液，加入磁珠，制成磁珠浓度为50mg/ml的磁珠液。
洗涤液GDW工作液：按照1：5的体积比加入无水乙醇形成工作溶液。
漂洗液GDF工作液：按照1.3：2.0的体积比加入无水乙醇形成工作溶液。
实施例5
一种游离DNA的提取方法，采用实施例1提供的提取试剂进行提取，步骤如下：
1)取4个孕妇血浆样品2ml，每个样本设置5个重复，加入3ml缓冲液GHB、200μl蛋白酶K液和30μl磁珠液，涡旋振荡混匀，室温孵育20min，期间每3-5min上下颠倒混匀10sec。
2)将离心管置于15ml的磁力架上吸附2min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
3)加入750μl漂洗液GDW工作液，上下颠倒混匀30sec使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
4)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
5)加入500μl漂洗液GDF工作液，上下颠倒混匀30sec使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
6)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
7)重复步骤5和6一次。
8)将离心管置于磁力架上，室温晾干5-10min。
注意：乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥太长时间，以免难以洗脱核酸。
9)加入50μl洗脱液EB，用移液器吹吸使磁珠重新悬浮，56℃孵育5min，期间每2min轻轻晃动使核酸充分洗脱。
10)将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新的离心管中。
分别取1μl洗脱液用安捷伦2100基因分析仪的2100expert_High SensitivityDNA Assay进行分析，可以检测到170bp左右的DNA片段，结果见图1。图1中，显示35和10380均为marker。从图1还可以看出，提取的质量佳，无其他杂带。
采用实施例2-4的提取试剂提取，结果与使用实施例1提供的提取试剂提取效果一致。
实施例6
一种游离DNA的提取方法，采用实施例1提供的提取试剂进行提取，步骤如下：
1)取2个血清样品1ml，每个样本设置5个重复，加入1ml缓冲液GHB、50μl蛋白酶K液和10μl磁珠液，涡旋振荡混匀，室温孵育10min，期间每3-5min上下颠倒混匀10sec。
2)将离心管置于5ml的磁力架上吸附2min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
3)加入300μl漂洗液GDW工作液，上下颠倒混匀30sec使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
4)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
5)加入200μl漂洗液GDF工作液，上下颠倒混匀30sec使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
6)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
7)重复步骤5和6一次。
8)将离心管置于磁力架上，室温晾干5-10min。
9)加入20μl洗脱液EB，用移液器吹吸使磁珠重新悬浮，56±3℃孵育3min，期间每2min轻轻晃动使核酸充分洗脱。
10)将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新的离心管中。
分别取1μl洗脱液用安捷伦2100基因分析仪的2100expert_High SensitivityDNA Assay进行分析，可以检测到150bp左右的DNA片段，结果与实施例5基本一致。
实施例7
一种游离DNA的提取方法，采用实施例1提供的提取试剂进行提取，步骤如下：
1)取2个血浆样品1ml，每个样本设置5个重复，加入2ml缓冲液GHB、200μl蛋白酶K液和50μl磁珠液，涡旋振荡混匀，室温孵育20min，期间每3-5min上下颠倒混匀5-15sec。
2)将离心管置于5ml的磁力架上吸附2min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
3)加入500μl漂洗液GDW工作液，上下颠倒混匀20-40sec使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
4)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
5)加入400μl漂洗液GDF工作液，上下颠倒混匀20-40sec使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
6)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
7)重复步骤5和6一次。
8)将离心管置于磁力架上，室温晾干5-10min。
9)加入50μl洗脱液EB，用移液器吹吸使磁珠重新悬浮，56±3℃孵育8min，期间每2min轻轻晃动使核酸充分洗脱。
10)将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新的离心管中。
分别取1μl洗脱液用安捷伦2100基因分析仪的2100expert_High SensitivityDNA Assay进行分析，可以检测到160bp左右的DNA片段，结果与实施例5基本一致。
实施例8
一种游离DNA的提取方法，采用实施例1提供的提取试剂进行提取，共20个血浆样品，每个样品为300μl，均采用以下方法平行提取，具体步骤如下：
1)血浆样品300μl，加入450μl缓冲液GHB、30μl蛋白酶K液和4.5μl磁珠液，涡旋振荡混匀，室温孵育15min，期间每3-5min上下颠倒混匀5-15sec。
2)将离心管置于2ml的磁力架上吸附2min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
3)加入115μl漂洗液GDW工作液，上下颠倒混匀20-40sec使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
4)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
5)加入75μl漂洗液GDF工作液，上下颠倒混匀20-40sec使磁珠充分悬浮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
6)将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
7)重复步骤5和6一次。
8)将离心管置于磁力架上，室温晾干5-10min。
注意：乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥太长时间，以免难以洗脱核酸。
9)加入20μl洗脱液EB，用移液器吹吸使磁珠重新悬浮，56±3℃孵育3-8min，期间每2min轻轻晃动使核酸充分洗脱。
10)将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新的离心管中。
统计每100μl血浆的游离DNA提取量，结果见表1。
表1提取效率统计
与表1相对应的图如图2所示。从图2可以看出，本发明提供的游离DNA的提取方法，提取效果稳定，且提取效率高。
本发明中，表面修饰有硅羟基的超顺磁性纳米微球可通过市售购买得到，如可购自苏州知益微球科技有限公司。
本发明中，室温是指15-25℃。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种游离DNA的提取试剂，其特征在于，包括缓冲液GHB、洗涤液GDW、漂洗液GDF、洗脱液EB中的任一种或多种；
所述缓冲液GHB的工作液含有以下成分：蛋白质变性剂3.8-4.5mol/L，Triton X-100体积百分数为0.8％-1.5％，Tris 0.008-0.015mol/L，pH为5.8-6.5；
所述洗涤液GDW含有以下成分：NaCl 9.5-10.5g/L，Tris 0.008-0.015mol/L，pH为7.5-8.5；
所述洗涤液GDW的工作液为：所述洗涤液GDW与溶剂以体积比为1:3-5混合而成的混合液；
所述漂洗液GDF含有以下成分：盐酸胍890-900g/L，Tris 0.03-0.04mol/L，pH为7.5-8.5；
所述漂洗液GDF的工作液为：所述漂洗液GDF与溶剂以体积比为1.3:1.5-2.0混合而成的混合液；
所述洗脱液EB的工作液含有以下成分：Tris 0.008-0.015mol/L，pH为7.5-8.5。
2.根据权利要求1所述的游离DNA的提取试剂，其特征在于，所述游离DNA的提取试剂还包括蛋白酶K、磁珠中的一种或两种；
进一步地，所述蛋白酶K以蛋白酶K液的形式存在；
所述蛋白酶K液中，所述蛋白酶K的工作浓度为18-25mg/ml。
3.根据权利要求2所述的游离DNA的提取试剂，其特征在于，所述磁珠为表面修饰有硅羟基的超顺磁性纳米微球。
4.根据权利要求2所述的游离DNA的提取试剂，其特征在于，所述磁珠以磁珠液形式存在；
所述磁珠液中，所述磁珠的工作浓度为10-50mg/ml；
所述磁珠液选用的溶剂为体积百分含量为18％-25％的乙醇水溶液。
5.根据权利要求1-4任一项所述的游离DNA的提取试剂，其特征在于，所述蛋白质变性剂为盐酸胍或异硫氰酸胍；
优选地，所述洗涤液GDW与所述漂洗液GDF制成工作液选用的溶剂均为无水乙醇。
6.一种游离DNA的提取方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的提取试剂进行提取，步骤如下：
(a)待处理血液样品加入缓冲液GHB的工作液、蛋白酶K和磁珠，混匀，孵育，期间上下颠倒混匀；
(b)磁力吸附，待磁珠完全吸附时去除液体；
(c)加入洗涤液GDW的工作液，悬浮；
(d)磁力吸附，待磁珠完全吸附时去除液体；
(e)加入漂洗液GDF的工作液，悬浮，磁力吸附，待磁珠完全吸附时去除液体；
(f)重复步骤(e)，去除乙醇；
(g)加入洗脱液EB的工作液，重新悬浮，孵育，期间晃动使核酸充分洗脱；
(h)磁力吸附，待磁珠完全吸附时将核酸溶液转移，得到游离DNA提取液。
7.根据权利要求6所述的一种游离DNA的提取方法，其特征在于，步骤(a)中，所述缓冲液GHB的工作液的添加体积为待处理血液样品体积的1-2倍；以每ml待处理血液样品计，蛋白酶K的添加量为1-4mg，磁珠的添加量为0.2-1mg；
进一步地，步骤(a)中，孵育10-20min，每3-5min上下颠倒混匀5-15sec。
8.根据权利要求6所述的一种游离DNA的提取方法，其特征在于，步骤(c)中，所述洗涤液GDW的工作液的添加体积为待处理血液样品体积的0.3-0.5倍；
进一步地，步骤(e)中，所述漂洗液GDF的工作液的添加体积为待处理血液样品体积的0.2-0.4倍；
进一步地，步骤(c)和步骤(e)中，悬浮为：上下颠倒混匀20-40sec使磁珠充分悬浮，离心以去除容器内壁的液滴。
9.根据权利要求6所述的一种游离DNA的提取方法，其特征在于，步骤(g)中，所述洗脱液EB的工作液的添加体积为待处理血液样品体积的2％-10％；
所述孵育的温度为56±3℃，孵育时间为3-8min，期间每2min晃动一次。
10.根据权利要求6-9任一项所述的一种游离DNA的提取方法，其特征在于，所述磁力吸附采用磁力架进行，所述磁力吸附的时间为1-2min；
优选地，得到游离DNA提取液中，游离DNA的片段的长度为100-200bp。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109055338A (zh) * 2018-08-15 2018-12-21 北京科迅生物技术有限公司 增强型vpr蛋白及血浆游离核酸提取的方法
CN109207476A (zh) * 2018-10-26 2019-01-15 王煜 一种尿液游离dna提取试剂盒及提取方法
CN109371018A (zh) * 2018-12-30 2019-02-22 北京优迅医疗器械有限公司 用于游离循环肿瘤dna提取的增强剂、提取外周血中游离循环肿瘤dna的试剂盒及方法
CN109913447A (zh) * 2019-04-04 2019-06-21 深圳市南科征途有限公司 游离dna提取富集试剂盒及游离dna提取方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103952397A (zh) * 2014-04-16 2014-07-30 天根生化科技（北京）有限公司 一种使用磁珠从血清或血浆样品中分离游离核酸的方法
CN104862301A (zh) * 2014-02-21 2015-08-26 广州康睿生物医药科技有限公司 一种从母体血浆中分离富集游离胎儿dna的方法
CN105349532A (zh) * 2015-12-15 2016-02-24 杭州千基生物科技有限公司 一种磁珠法提取游离核酸的方法及其试剂盒
CN105861493A (zh) * 2016-06-03 2016-08-17 上海科华生物工程股份有限公司 游离dna提取试剂盒及其应用
CN106011131A (zh) * 2016-07-29 2016-10-12 北京旌准医疗科技有限公司 一种从血浆中分离游离核酸的方法
CN106834277A (zh) * 2017-02-11 2017-06-13 上海塔歌生物技术有限公司 一种用磁珠法分离游离dna的方法及分离试剂盒
CN106867992A (zh) * 2017-01-11 2017-06-20 上海芯超生物科技有限公司 一种全血dna提取试剂盒及提取方法
CN107312771A (zh) * 2017-01-11 2017-11-03 华东医药（杭州）基因科技有限公司 一种高效抽提血清和血浆游离dna的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104862301A (zh) * 2014-02-21 2015-08-26 广州康睿生物医药科技有限公司 一种从母体血浆中分离富集游离胎儿dna的方法
CN103952397A (zh) * 2014-04-16 2014-07-30 天根生化科技（北京）有限公司 一种使用磁珠从血清或血浆样品中分离游离核酸的方法
CN105349532A (zh) * 2015-12-15 2016-02-24 杭州千基生物科技有限公司 一种磁珠法提取游离核酸的方法及其试剂盒
CN105861493A (zh) * 2016-06-03 2016-08-17 上海科华生物工程股份有限公司 游离dna提取试剂盒及其应用
CN106011131A (zh) * 2016-07-29 2016-10-12 北京旌准医疗科技有限公司 一种从血浆中分离游离核酸的方法
CN106867992A (zh) * 2017-01-11 2017-06-20 上海芯超生物科技有限公司 一种全血dna提取试剂盒及提取方法
CN107312771A (zh) * 2017-01-11 2017-11-03 华东医药（杭州）基因科技有限公司 一种高效抽提血清和血浆游离dna的方法
CN106834277A (zh) * 2017-02-11 2017-06-13 上海塔歌生物技术有限公司 一种用磁珠法分离游离dna的方法及分离试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
谭贵良等: "《现代分子生物学及组学技术在食品安全检测中的应用》", 30 June 2014 *
陈智龙: "《个体化用药基因检测的临床应用》", 31 March 2016 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109055338A (zh) * 2018-08-15 2018-12-21 北京科迅生物技术有限公司 增强型vpr蛋白及血浆游离核酸提取的方法
CN109055338B (zh) * 2018-08-15 2020-11-17 北京科迅生物技术有限公司 增强型vpr蛋白及血浆游离核酸提取的方法
CN109207476A (zh) * 2018-10-26 2019-01-15 王煜 一种尿液游离dna提取试剂盒及提取方法
CN109371018A (zh) * 2018-12-30 2019-02-22 北京优迅医疗器械有限公司 用于游离循环肿瘤dna提取的增强剂、提取外周血中游离循环肿瘤dna的试剂盒及方法
CN109371018B (zh) * 2018-12-30 2022-04-22 北京优迅医疗器械有限公司 用于游离循环肿瘤dna提取的增强剂、提取外周血中游离循环肿瘤dna的试剂盒及方法
CN109913447A (zh) * 2019-04-04 2019-06-21 深圳市南科征途有限公司 游离dna提取富集试剂盒及游离dna提取方法

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