CN109055338B - 增强型vpr蛋白及血浆游离核酸提取的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强型VPR蛋白及血浆游离核酸提取的方法。其中，该增强型VPR蛋白的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第55位、第102位、第134位和第166位，且第55位的酪氨酸突变为苯丙氨酸；第102位的丝氨酸突变为苏氨酸；第134位的丝氨酸突变为异亮氨酸；第166位的丝氨酸突变为苏氨酸；或者增强型VPR蛋白的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列。本发明的增强型VPR蛋白在常温下就有较高的活性，因而在血浆游离核酸提取中不需要升温，减少核酸降解。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种增强型VPR蛋白及血浆游离核酸提取的方法。
背景技术
从血浆中提取游离核酸是胎儿无创产前筛查和肿瘤液体活检的关键实验步骤，因为游离核酸总量直接影响无创产前筛查和肿瘤液体活检的灵敏度和检测限。目前，有多种提取方法和商业化试剂盒可供选择，大致分为离心柱法和磁珠法两大类，在实验操作的简便性和游离核酸的提取量上存在一定的差异。离心柱法利用硅基质膜结合核酸，经离心作用去除杂质，然后从硅基质膜上洗脱核酸。磁珠法利用功能化的纳米磁珠结合核酸，利用磁力架吸附磁珠分离核酸和杂质，最后从纳米磁珠上洗脱核酸。与离心柱法相比，磁珠法不需要离心设备，操作简单且与移液工作站结合能实现血浆游离核酸的自动化提取。因此，对于每年有几十万甚至上百万的无创产前筛查样本的临床服务商，磁珠法比离心柱法更适合完成大规模样品的检测。
但是，无论离心柱法还是磁珠法，一般均使用蛋白酶K进行核小体组蛋白的消化。蛋白酶K是一种类枯草杆菌蛋白酶，切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，且在尿素和SDS存在时蛋白较稳定，因此广泛应用于核酸提取。但是蛋白酶K的最适反应温度是50～60℃左右，需要升温设备对反应进行加热，升温过程中游离核酸可能发生降解。如果能用常温下高活性的酶替代蛋白酶K，就能简化实验操作，达到成本降低且提取量增加的效果。从嗜冷菌中发现的低温蛋白酶已被应用于洗涤剂中，从而提高常温下洗涤剂的水解污渍的能力。如果将这种低温蛋白酶改良后应用到核酸提取中，就能在常温下发挥较高的酶活，达到消化核小体组蛋白，释放游离核酸的目的，从而简化实验操作，达到成本降低且提取量增加的效果。
发明内容
本发明旨在提供一种增强型VPR蛋白及血浆游离核酸提取的方法，以解决现有技术中蛋白酶K在血浆游离核酸提取中需要升温而导致核酸降解的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种增强型VPR蛋白。该增强型VPR蛋白的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第55位、第102位、第134位和第166位，且第55位的酪氨酸突变为苯丙氨酸；第102位的丝氨酸突变为苏氨酸；第134位的丝氨酸突变为异亮氨酸；第166位的丝氨酸突变为苏氨酸；或者增强型VPR蛋白的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列。
进一步地，增强型VPR蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；或者增强型VPR蛋白的氨基酸序列为与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列。
根据本发明的另一方面，提供了一种DNA分子。该DNA分子编码上述增强型VPR蛋白。
进一步地，DNA分子的序列为SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10或者SEQ ID NO：11所示序列；或者DNA分子的序列为与SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10或者SEQ ID NO：11具有95％以上同源性的序列。
根据本发明的再一方面，提供了一种重组质粒。该重组质粒含有上述DNA分子。
根据本发明的又一方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述重组质粒。
进一步地，宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。
根据本发明的再一方面，提供了一种血浆游离核酸提取的方法。该方法其包括利用酶消化核小体组蛋白，释放游离核酸的步骤，酶为上述增强型VPR蛋白。
进一步地，血浆游离核酸提取的方法为离心柱法或磁珠法。
根据本发明的又一方面，提供了一种上述增强型VPR蛋白在血浆游离核酸提取中的应用。
应用本发明的技术方案，增强型VPR蛋白在常温下就有较高的活性，因而在血浆游离核酸提取中不需要升温，减少核酸降解，并且本申请中的增强型VPR在含有EDTA和SDS的常温缓冲液中催化活性比蛋白酶K更高，同时具有较好的热稳定性，方便运输和保存。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1A示出了实施例1中life的magmax提取试剂盒提取的游离核酸的片段大小检测结果；
图1B示出了实施例1中SEQ ID NO:1增强型VPR蛋白酶提取的游离核酸的片段大小检测结果；
图1C示出了实施例1中SEQ ID NO:2增强型VPR蛋白酶提取的游离核酸的片段大小检测结果；
图1D示出了实施例1中SEQ ID NO:3增强型VPR蛋白酶提取的游离核酸的片段大小检测结果；
图1E示出了实施例1中SEQ ID NO:4增强型VPR蛋白酶提取的游离核酸的片段大小检测结果；
图1F示出了实施例1中SEQ ID NO:5增强型VPR蛋白酶提取的游离核酸的片段大小检测结果；
图1G示出了实施例1中SEQ ID NO:6增强型VPR蛋白酶提取的游离核酸的片段大小检测结果；
图2示出了实施例2中不同温度下增强型VPR蛋白酶与蛋白酶K的活性比较。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
如何寻找蛋白酶K的替代品，一方面考虑对蛋白酶K进行低温适应性改造，另一方面考虑对蛋白酶K的低温同源蛋白进行活性和稳定性增强改造，使其在含有EDTA和SDS的常温缓冲液中催化活性比蛋白酶K更高，同时具有较好的热稳定性，方便运输和保存。
本申请的发明人选择对蛋白酶K的同源蛋白进行筛选和改造。首先，从蛋白酶K所属的类枯草杆菌蛋白家族中筛选低温蛋白酶，比如S41(Bacillus TA41)、R2(Marinobacter)和VPR(Vibrio species PA-44)等。根据已有文献比较几种低温蛋白酶在常温下的催化活性，发现VPR蛋白的Kcat/Km值较高，例如在25℃时，VPR水解底物succinyl-AAPF-p-nitroanilide的Kcat/Km值显著高于蛋白酶K，说明此条件下VPR蛋白酶的活性比蛋白酶K更高。因此将VPR作为候选物实施基因工程改造。
利用碱基随机突变法产生大量候选的突变型VPR蛋白，从其中筛选出热稳定性高，酶活在EDTA溶液中较高的增强型VPR蛋白，经验证的增强型突变为一个或多个氨基酸突变的组合(Y55F，S102T，S134I和S166T)。首先将VPR基因克隆到pBAD TOPO TA载体上，其中VPR基因N端编码前肽(139个氨基酸)的碱基序列被去除，以提高重组蛋白的可溶性。然后在E.coli Top10菌株中利用阿拉伯糖诱导表达重组蛋白。最后通过his标签纯化获得重组蛋白。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种增强型VPR蛋白。该增强型VPR蛋白的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第55位、第102位、第134位和第166位，且第55位的酪氨酸突变为苯丙氨酸；第102位的丝氨酸突变为苏氨酸；第134位的丝氨酸突变为异亮氨酸；第166位的丝氨酸突变为苏氨酸；或者增强型VPR蛋白的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1：
QSNAIWGLDRIDQRNLPLDRNYNANFDGFGVTAYVIDTGVNNNHEEFGGRSVSGYDFVDNDADSSDCNGHGTHVAGTIGGSQYGVAKNVNIVGVRVLSCSGSGTTSGVISGVDWVAQNASGPSVANMSLGGGQSTALDSAVQGAIQSGVSFMLAAGNSNADACNTSPARVPSGVTVGSTTSSDSRSSFSNWGSCVDLFAPGSQIKSAWYDGGYKTISGTSMATPHVAGVAALYLQENNGLTPLQLTGLLNSRASENKVSDTRGTTNKLLYSLADSGCEPDCGGPTPGPDPD
本文使用的术语“同源性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同源性的规则、标准。本发明用不同程度同源性限定的序列还必须要同时具有增强型VPR蛋白酶活性。在上述实施方式中，优选增强型VPR蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：6具有95％以上的同源性并具有或编码具有增强型VPR蛋白酶活性的氨基酸序列。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下获得这样的变体序列。
SEQ ID NO：2
QSNAIWGLDRIDQRNLPLDRNYNANFDGFGVTAYVIDTGVNNNHEEFGGRSVSGYDFVDNDADSSDCNGHGTHVAGTIGGSQYGVAKNVNIVGVRVLSCSGTGTTSGVISGVDWVAQNASGPSVANMSLGGGQITALDSAVQGAIQSGVSFMLAAGNSNADACNTTPARVPSGVTVGSTTSSDSRSSFSNWGSCVDLFAPGSQIKSAWYDGGYKTISGTSMATPHVAGVAALYLQENNGLTPLQLTGLLNSRASENKVSDTRGTTNKLLYSLADSGCEPDCGGPTPGPDPD
SEQ ID NO：3
QSNAIWGLDRIDQRNLPLDRNYNANFDGFGVTAYVIDTGVNNNHEEFGGRSVSGYDFVDNDADSSDCNGHGTHVAGTIGGSQYGVAKNVNIVGVRVLSCSGTGTTSGVISGVDWVAQNASGPSVANMSLGGGQSTALDSAVQGAIQSGVSFMLAAGNSNADACNTTPARVPSGVTVGSTTSSDSRSSFSNWGSCVDLFAPGSQIKSAWYDGGYKTISGTSMATPHVAGVAALYLQENNGLTPLQLTGLLNSRASENKVSDTRGTTNKLLYSLADSGCEPDCGGPTPGPDPD
SEQ ID NO：4
QSNAIWGLDRIDQRNLPLDRNYNANFDGFGVTAYVIDTGVNNNHEEFGGRSVSGYDFVDNDADSSDCNGHGTHVAGTIGGSQYGVAKNVNIVGVRVLSCSGTGTTSGVISGVDWVAQNASGPSVANMSLGGGQSTALDSAVQGAIQSGVSFMLAAGNSNADACNTSPARVPSGVTVGSTTSSDSRSSFSNWGSCVDLFAPGSQIKSAWYDGGYKTISGTSMATPHVAGVAALYLQENNGLTPLQLTGLLNSRASENKVSDTRGTTNKLLYSLADSGCEPDCGGPTPGPDPD
SEQ ID NO：5
QSNAIWGLDRIDQRNLPLDRNYNANFDGFGVTAYVIDTGVNNNHEEFGGRSVSGFDFVDNDADSSDCNGHGTHVAGTIGGSQYGVAKNVNIVGVRVLSCSGTGTTSGVISGVDWVAQNASGPSVANMSLGGGQITALDSAVQGAIQSGVSFMLAAGNSNADACNTSPARVPSGVTVGSTTSSDSRSSFSNWGSCVDLFAPGSQIKSAWYDGGYKTISGTSMATPHVAGVAALYLQENNGLTPLQLTGLLNSRASENKVSDTRGTTNKLLYSLADSGCEPDCGGPTPGPDPD
SEQ ID NO：6
QSNAIWGLDRIDQRNLPLDRNYNANFDGFGVTAYVIDTGVNNNHEEFGGRSVSGYDFVDNDADSSDCNGHGTHVAGTIGGSQYGVAKNVNIVGVRVLSCSGSGTTSGVISGVDWVAQNASGPSVANMSLGGGQITALDSAVQGAIQSGVSFMLAAGNSNADACNTTPARVPSGVTVGSTTSSDSRSSFSNWGSCVDLFAPGSQIKSAWYDGGYKTISGTSMATPHVAGVAALYLQENNGLTPLQLTGLLNSRASENKVSDTRGTTNKLLYSLADSGCEPDCGGPTPGPDPD
应用本发明的技术方案，增强型VPR蛋白在常温下就有较高的活性，因而在血浆游离核酸提取中不需要升温，减少核酸降解，并且本申请中的增强型VPR在含有EDTA和SDS的常温缓冲液中催化活性比蛋白酶K更高，同时具有较好的热稳定性，方便运输和保存。
优选的，增强型VPR蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；或者增强型VPR蛋白的氨基酸序列为与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列。
根据本发明一种典型的实施方式，提供DNA分子。该DNA分子编码上述增强型VPR蛋白。优选的，DNA分子的序列为SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或者SEQ ID NO：11所示序列；或者DNA分子的序列为与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或者SEQ ID NO：11具有95％以上同源性的序列。
SEQ ID NO:7
SEQ ID NO:8
SEQ ID NO:9
SEQ ID NO:10
SEQ ID NO:11
本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞、酵母或真核细胞。优选原核细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种血浆游离核酸提取的方法，其包括利用酶消化核小体组蛋白，释放游离核酸的步骤，酶为本发明的增强型VPR蛋白，血浆游离核酸提取的方法包括但不限于离心柱法或磁珠法。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种增强型VPR蛋白在血浆游离核酸提取中的应用。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
配制磁珠法核酸提取使用的缓冲液，包括裂解缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。其中裂解缓冲液的高浓度盐的成分为下列中的一种或几种：2～3M盐酸胍、4.5～6M异硫氰酸胍和1.5～3M碘化钠等。其他成分为：1％～30％曲拉通(Triton X-100)，10～50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)，1～10mM乙二胺四乙酸钠(EDTA)。
洗涤缓冲液A组分为：2～3M盐酸胍，1％～30％曲拉通(Triton X-100)，5～50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)，1～10mM乙二胺四乙酸钠(EDTA)，异丙醇，70％乙醇。
洗涤缓冲液B组分为：5～50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl)，1～10mM乙二胺四乙酸钠(EDTA)，80％乙醇。
洗脱缓冲液组分为：8～10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Cl，pH8.0)。
磁珠使用超顺磁性纳米磁珠，直径为100～200nM，电镜下呈球形且大小均匀。
实验步骤：
1.蛋白酶预处理：分别向2mL血浆中加入20ul不同的VPR增强型蛋白酶(SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)和50ul 20％SDS溶液。混匀后常温孵育30分钟。
2.裂解与结合：向上述反应液中加入2mL裂解缓冲液和40ul磁珠。涡旋振荡20min，使磁珠与核酸充分结合。将反应管放入磁力架上，静置5分钟至溶液澄清且磁珠完全吸附到磁力架一侧，移除上清液。
3.漂洗：向上述反应管中加入1mL洗涤缓冲液A，重悬磁珠并转移到新的1.5mL离心管中。将离心管放入磁力架上，静置2分钟至溶液澄清且磁珠完全吸附到磁力架一侧，移除上清液。再加入1mL洗涤缓冲液B重悬磁珠，将离心管放入磁力架上，静置2分钟至溶液澄清且磁珠完全吸附到磁力架一侧，移除上清液。
4.洗脱：晾干洗涤液B后，加入100ul洗脱缓冲液，涡旋振荡5分钟，使磁珠充分重悬。将离心管放入磁力架上，静置2分钟至溶液澄清且磁珠完全吸附到磁力架一侧，转移上清液至新的1.5mL离心管中，即为血浆游离核酸。
5.对照实验：使用MagMAXTM Cell-Free DNAIsolation Kit按试剂盒说明书提取同等体积的血浆。
提取结果见表1和2。
表1
表2
利用本发明的方法提取10例孕妇血浆样本，对照组使用life的magmax提取试剂盒，2100电泳显示7种方法的游离核酸片段分布情况基本一致(结果见图1A-图1G)，SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6VPR蛋白酶游离核酸提取总量低于life家试剂盒，SEQ ID NO:5VPR蛋白酶游离核酸提取总量接近life家试剂盒，而本发明的SEQ IDNO:2增强型VPR蛋白酶游离核酸提取总量高于life家试剂盒。
实施例2
不同温度下增强型VPR蛋白酶与蛋白酶K的活性比较
在5个温度条件下(15～55℃)，分别测定增强型VPR蛋白酶(SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)和蛋白酶K(如下)水解底物succinyl-AAPF-p-nitroanilide的酶动力学参数，Kcat/Km值根据米氏方程和底物浓度计算。
蛋白酶K的氨基酸序列为SEQ ID NO:12：
AAQTNAPWGLARISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEASHPEFEGRAQMVKTYYYSSRDGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGQYSTIIAGMDFVASDKNNRNCPKGVVASLSLGGGYSSSVNSAAARLQSSGVMVAVAAGNNNADARNYSPASEPSVCTVGASDRYDRRSSFSNYGSVLDIFGPGTSILSTWIGGSTRSISGTSMATPHVAGLAAYLMTLGKTTAASACRYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQA
不同温度下增强型VPR蛋白酶(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQIDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)与蛋白酶K的活性比较，结果见图2、表3和4。
表3
表4
以上结果说明，增强型VPR蛋白在常温下就有较高的活性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京科迅生物技术有限公司
<120> 增强型VPR蛋白及血浆游离核酸提取的方法
<130> PN95475KXSW
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 291
<212> PRT
<213> vibrio sp.PA-44
<400> 1
Gln Ser Asn Ala Ile Trp Gly Leu Asp Arg Ile Asp Gln Arg Asn Leu
1 5 10 15
Pro Leu Asp Arg Asn Tyr Asn Ala Asn Phe Asp Gly Phe Gly Val Thr
20 25 30
Ala Tyr Val Ile Asp Thr Gly Val Asn Asn Asn His Glu Glu Phe Gly
35 40 45
Gly Arg Ser Val Ser Gly Tyr Asp Phe Val Asp Asn Asp Ala Asp Ser
50 55 60
Ser Asp Cys Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gln Tyr Gly Val Ala Lys Asn Val Asn Ile Val Gly Val Arg Val
85 90 95
Leu Ser Cys Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Val Ile Ser Gly Val
100 105 110
Asp Trp Val Ala Gln Asn Ala Ser Gly Pro Ser Val Ala Asn Met Ser
115 120 125
Leu Gly Gly Gly Gln Ser Thr Ala Leu Asp Ser Ala Val Gln Gly Ala
130 135 140
Ile Gln Ser Gly Val Ser Phe Met Leu Ala Ala Gly Asn Ser Asn Ala
145 150 155 160
Asp Ala Cys Asn Thr Ser Pro Ala Arg Val Pro Ser Gly Val Thr Val
165 170 175
Gly Ser Thr Thr Ser Ser Asp Ser Arg Ser Ser Phe Ser Asn Trp Gly
180 185 190
Ser Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Ser Gln Ile Lys Ser Ala Trp
195 200 205
Tyr Asp Gly Gly Tyr Lys Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro
210 215 220
His Val Ala Gly Val Ala Ala Leu Tyr Leu Gln Glu Asn Asn Gly Leu
225 230 235 240
Thr Pro Leu Gln Leu Thr Gly Leu Leu Asn Ser Arg Ala Ser Glu Asn
245 250 255
Lys Val Ser Asp Thr Arg Gly Thr Thr Asn Lys Leu Leu Tyr Ser Leu
260 265 270
Ala Asp Ser Gly Cys Glu Pro Asp Cys Gly Gly Pro Thr Pro Gly Pro
275 280 285
Asp Pro Asp
290
<210> 2
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<213> vibrio sp.PA-44
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Asp Asp Asn Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp
100 105 110
Phe Val Ala Ser Asp Lys Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val
115 120 125
Ala Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala
130 135 140
Ala Ala Arg Leu Gln Ser Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly
145 150 155 160
Asn Asn Asn Ala Asp Ala Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser
165 170 175
Val Cys Thr Val Gly Ala Ser Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe
180 185 190
Ser Asn Tyr Gly Ser Val Leu Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile
195 200 205
Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser
210 215 220
Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu
225 230 235 240
Gly Lys Thr Thr Ala Ala Ser Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala
245 250 255
Asn Lys Gly Asp Leu Ser Asn Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu
260 265 270
Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln Ala
275
Claims (10)
1.一种增强型VPR蛋白，其特征在于，所述增强型VPR蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或者SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1所述的增强型VPR蛋白。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的序列为SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或者SEQ ID NO：11所示序列。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求2或3所述的DNA分子。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为酵母；所述原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。
8.一种血浆游离核酸提取的方法，其包括利用酶消化核小体组蛋白，释放游离核酸的步骤，其特征在于，所述酶为权利要求1所述的增强型VPR蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述血浆游离核酸提取的方法为离心柱法或磁珠法。
10.一种权利要求1所述的增强型VPR蛋白在血浆游离核酸提取中的应用。
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| Effect of selected Ser/Ala and Xaa/Pro mutations on the stability and catalytic properties of a cold adapted subtilisin-like serine proteinase;Arnórsdóttir J等;《Biochim Biophys Acta.》;20070404;第750页左栏第2段、第2.1节和表1，参考文献25图1和第5539页右栏第1段 * |
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