CN110628745B - 一种突变酶Xynh31-K210R及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种突变酶Xynh31‑K210R及其应用，属于基因工程领域。本发明在生物信息学分析的基础上，结合内切木聚糖酶Xynh31同源建模结果，通过将210位的赖氨酸定点突变为精氨酸，并成功构建得到了突变酶Xynh31‑K210R。该突变酶最适反应温度为55℃，其最适反应温度提升了10℃。热稳定性研究显示该酶在60℃时仍然有超过60％的残余酶活，而Xynh31酶残余酶活不到30％，证明该酶的热稳定性得到了提升。

Description

一种突变酶Xynh31-K210R及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种突变酶Xynh31-K210R及其应用。
背景技术
现代分子生物学、基因组学等学科的发展为我们提供了新的技术手段，使我们能够对酶进行分子改造，获得性质优良的新型工业酶。
酶的分子改造目前已经广泛应用于提高酶的催化活性、热稳定性、酸碱耐受性、底物专一性等多个方面，是未来生物技术发展的一个重要方向。
目前木聚糖酶的分子改造主要通过定点突变来实现。利用定点突变提高木聚糖酶热稳定主要通过增加疏水性、芳香族氨基酸相互作用、增加带电氨基酸的数目、引进新的二硫键等方法来实现。Georis等(2000)根据对嗜热及嗜温性木聚糖酶三维结构的对比分析结果，在木聚糖酶中引入新的Y11-Y16芳香族氨基酸相互作用，提高了木聚糖酶的嗜热性和热稳定性。Turune等(2001)在来源于Trichoderma ressei的11家族木聚糖酶的富含Ser/Thr的表面引入了多个Arg，大大提高了热稳定性。Fenel等(2004)在来源于Trichodermaressei的11家族木聚糖酶的N端引入了一个二硫键，提高了该木聚糖酶的热稳定性。Turune等(2002)将来源于Trichoderma ressei的11家族木聚糖酶的110位丝氨酸和154位天冬酰胺突变为半胱氨酸，这两个半胱氨酸形成了一对二硫键，提高了该木聚糖酶的热稳定性。Xie等(2011)采用定点突变的方法将来源于Aspergillus niger的木聚糖酶B第33位甘氨酸替换为丝氨酸，使重组木聚糖酶在85℃下保存30min后仍能保持约80％的酶活力。Dong等(2006)在第11家族木聚糖酶Ser/Thr表面上引入精氨酸，显著提高了热稳定性。Zhang等(2010)将来源于Streptomyces olivaceovirdis的木聚糖酶SoxB的N端部分氨基酸替换成来自耐热真菌Trichoderma fusca的木聚糖酶TFXA的N端部分，大大提高了木聚糖酶的热稳定性。定点突变的基础建立在对蛋白质三维结构的理解上，对蛋白质的背景知识了解越多，成功的可能性越大。脱离了蛋白质三维结构的改造往往会失败，这是定点突变技术的局限性。
总之，提高木聚糖酶的热稳定可通过酶分子改造来实现，比如定点突变。随着生物信息学发展迅速，与内切木聚糖酶结构相关的数据日益增多，对蛋白质结构预测的准确度越来越高，未来酶分子的改造的可能会逐渐减少完全随机性的探索，以计算生物学为基础的基于序列及结构的理性设计可能会逐步增强(冯雁，2007)。
热稳定性是制约内切木聚糖酶工业化应用的重要因素。很多工业进程，如造纸工业的漂白、制浆等，对内切木聚糖酶的热稳定性有着较高的要求，因此获得热稳定性较高的酶有较大的实际意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种突变酶Xynh31-K210R。
本发明的另一目的在于提供上述突变酶Xynh31-K210R的应用。
为进一步改进酶的催化特性，本发明在生物信息学分析的基础上，结合内切木聚糖酶Xynh31同源建模结果，选择部分氨基酸进行定点突变，进一步确定了该酶的催化位点，并成功构建得到了突变酶Xynh31-K210R。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种突变酶Xynh31-K210R，是氨基酸序列为SEQ ID No：3的Xynh31酶的第210位氨基酸由赖氨酸(Lys，K)突变为精氨酸(Arg，R)。
上述突变酶Xynh31-K210R的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
本发明另一方面涉及携带具有编码序列为SEQ ID No：2的突变酶Xynh31-K210R基因的重组质粒；优选的，所述的重组质粒为适于在大肠杆菌中表达的载体；所述的重组质粒为pET-28a-Xynh31-K210R。
本发明还涉及一种工程菌株，其携带上述重组质粒。
所述的工程菌株是以大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)为宿主菌，将重组质粒转化到宿主菌后得到的重组菌。
所述的突变酶Xynh31-K210R在造纸工业中的应用。
具体的，所述的突变酶Xynh31-K210R的热稳定性得到了显著提高，其最适反应温度为55℃，其最适反应温度提升了10℃；在60℃时仍然有超过60％的残余酶活，而Xynh31酶残余酶活不到30％。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明证明Xynh31木聚糖酶的催化位点为171位和279位的谷氨酸
根据查阅文献、序列对比分析及蛋白结构模拟等方法，预测内切木聚糖酶Xynh31的活性位点催化活性位点为171位和279位的谷氨酸(Glu，E)，在此基础上构建突变体Xynh31-ED，实验结果表明突变体基本没有酶活性，证明Xynh31木聚糖酶的催化位点为171位和279位的谷氨酸。
(2)本发明通过定点突变得到了耐热突变酶Xynh31-K210R
根据文献及蛋白结构模拟结果，通过将210位的赖氨酸定点突变为精氨酸，得到了一个耐热突变酶Xynh31-K210R，该突变酶最适反应温度为55℃，其最适反应温度提升了10℃。热稳定性研究显示该酶在60℃时仍然有超过60％的残余酶活，而Xynh31酶残余酶活不到30％，证明该酶的热稳定性得到了提升。
附图说明
图1是使用phyre2同源建模得到的木聚糖酶Xynh31三维结构；Xynh31具有典型的(β/α)8TIM桶结构，图中黄色部分是β折叠结构，红色部分为α螺旋。
图2是木聚糖酶Xynh31的催化结构域与结合结构域；木聚糖酶Xynh31具有糖苷水解酶第10家族的催化结构域(GH10_2)，同时C端包含CBM2结合结构域。
图3是木聚糖酶Xynh31活性位点预测；根据Prosite数据库预测结果，活性位点为位于171的谷氨酸(Glu)和位于279的谷氨酸(Glu)。
图4是突变酶纯化后电泳图；M：蛋白质分子量标记物；1，纯化蛋白rXynh31；2，纯化蛋白Xynh31-ED；3，纯化蛋白Xynh31-K210R；4，纯化蛋白Xynh31-Cys。
图5是突变重组子的相对酶活性；以没有进行点突变的内切木聚糖酶rXynh31为对照组，将其相对酶活力标为100％。
图6是rXynh31与Xynh31-K210R最适反应pH值及pH稳定性的对比；A：反应体系中pH值对rXynh31与Xynh31-K210R催化活性的影响；B：rXynh31与Xynh31-K210R的pH稳定性。
图7是rXynh31与Xynh31-K210R最适反应温度及热稳定性的对比；A：反应体系中温度对rXynh31与Xynh31-K210R催化活性的影响；B：rXynh31与Xynh31-K210R的热稳定性。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例中所述的Xynh31基因是指专利“201610053484.5、一种中性内切木聚糖酶及其编码基因与应用”中公开的中性内切木聚糖酶XYN-H31基因。
实施例1
1材料
1.1菌株及载体
(1)大肠杆菌E.coli TOP10、E.coli BL21 Star(DE3)购自Invitrogen公司。
(2)链霉菌Streptomyces sp.H31，已经在专利“201510036517.0、一种中性内切葡聚糖酶及其编码基因与应用”中公开。
(3)大肠杆菌表达载体pET-28a(+)蛋白表达载体购自Invitrogen公司。
(4)大肠杆菌连接T载体购自Takara公司。
1.2培养基
LB培养基：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，NaCl 1％，固体LB培养基另添加Agar 2％。筛选重组质粒的转化子时，加入终浓度为50～100μg/mL的氨苄青霉素(大肠杆菌原核表达)。
1.3主要仪器设备
PCR仪：Applied Biosystems公司
离心机：Eppendorf公司
电泳仪：Bio-rad公司
立式压力蒸汽灭菌锅：日本Hirayama公司
凝胶成像系统：Dolphin-DOC
2方法
2.1木聚糖酶Xynh31的活性位点确定及酶分子改造
2.1.1生物信息学分析方法
活性位点分析：利用PROSITE数据库(https://prosite.expasy.org/)进行酶的活性位点分析。
蛋白三维结构的同源建模：利用phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)进行蛋白三维结构的模拟(Kelley et al.,2015)。
蛋白质模拟结构的分析：利用RasMol Version 2.7.5.2(http:// www.rasmol.org/)软件分析蛋白三维结构。
2.1.2木聚糖酶Xynh31催化活性位点的确定
运用PROSITE数据库，输入木聚糖酶Xynh31氨基酸序列(见SEQ ID No：3)进行分析，其开放阅读框编码459个氨基酸，通过数据库分析得到关于木聚糖酶Xynh31的活性位点预测，在预测位点进行定点突变然后在大肠杆菌中表达，并测定酶活以确定其活性位点。根据预测结果选取Glu171、Glu279进行定点突变，构建突变体E171D/E279D，引物见表1。
2.1.3通过定点突变提高木聚糖酶Xynh31的热稳定性
(1)突变位点选取及利用overlap PCR进行定点突变的方法
利用phyre2(Protein Homology/analogY Recognition Engine V 2.0)软件对木聚糖酶Xynh31进行同源建模，将模拟获得的信息进行分析，选择突变位点利用overlap技术实施定点突变。其中选择第210位赖氨酸突变为精氨酸、第114、119位的甘氨酸(Gly，G)、甲硫氨酸(Met，M)突变为半胱氨酸(Cys，C)，构建突变体K210R、G114C/M119C，引物见表1。
木聚糖酶Xynh31的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。Overlap PCR进行定点突变是利用一对突变引物在第一轮引入突变，得到含突变碱基的上游和下游片段，其中两个片段有一部分重叠。第二轮混合进行无引物随机扩增，第三轮用全长引物扩增获得含有突变碱基的基因全长。如果要同时突变两个距离比较远的点，则先突变其中一个，获得突变基因验证成功后再突变下一个。
表1定点突变所用引物
Figure BDA0002252379870000041
Figure BDA0002252379870000051
2.1.4重组质粒pET-28a-Xynh31-ED、pET-28a-Xynh31-K210R、pET-28a-Xynh31-Cys的构建
将得到的突变体Xynh31-ED基因、突变体Xynh31-K210R基因、突变体Xynh31-Cys基因分别利用EcoRI和XhoI双酶切后与同样酶切的pET-28a(+)表达质粒在16℃连接12h后，转化到E.coli BL21 Star(DE3)。转化子经测序鉴定。
2.1.5重组大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)的诱导表达
(1)将分别成功转入pET-28a-Xynh31-ED、pET-28a-Xynh31-K210R、pET-28a-Xynh31-Cys的大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)接种到适量的LB培养基中过夜培养。
(2)按1％接种量将过夜培养的重组E.coli BL21菌液接种到LB培养基中。
(3)每间隔一段时间测定菌液OD值，在OD为0.5～0.6时加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达。
(4)培养适当的时间后，取菌液离心并加入缓冲液，使用超声破壁法或液氮反复冻融法裂解细胞，将样品12000r/min高速离心5min后取上清液，进行下一步测定。
2.2酶的分离纯化及酶学特性研究
2.2.1内切木聚糖酶蛋白分离纯化
所用的大肠杆菌中表达的重组内切木聚糖酶(记为rXynh31)及大肠杆菌中表达的重组内切木聚糖突变酶(分别记为Xynh31-ED、Xynh31-K210R或Xynh31-Cys)皆带有6×His-tag，因而可以使用亲和层析进行蛋白的分离纯化。方法如下：
(1)将细胞裂解后的上清液(大肠杆菌表达系统)溶解在平衡缓冲液中。
(2)将Ni亲和层析柱HisTrapTM用平衡缓冲液平衡至基线。
(3)将样品以1mL/min的流速通过恒流泵加载到Ni亲和层析柱上。
(3)咪唑洗脱溶液梯度洗脱，收集洗脱峰测定酶活后，过夜透析后并经10倍浓缩备用。
具体分离纯化步骤参照“201610053484.5、一种中性内切木聚糖酶及其编码基因与应用”中实施例2步骤(二)8。
2.2.2酶活力测定方法
将适量酶液加入到1％的木聚糖溶液，在45℃下振荡反应20min后，迅速加DNS溶液沸水浴10min，后于540nm测定吸光值，通过标准曲线计算还原糖。将上述条件下每小时产生1.0mg木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，用U/mL表示。
比活力的定义：每mg蛋白质所含的酶活力(U/mg)。
实验结果均为三次重复实验所得的平均值。
2.2.3蛋白质电泳分析
(1)SDS-PAGE凝胶配制
具体方法如表2。
(2)电泳步骤
1、将样品12000r/min离心去沉淀后，加入5×样品缓冲液，沸水煮10min后再离心去沉淀，上清用于上样。
2、用上样器小心上样，上样量根据实际需要选择，样品不溢出上样孔。
3、上样结束后迅速开始电泳。样品位于浓缩胶阶段，一般选择低电压，进入分离胶后调高电压，直到溴酚蓝指示带位于凝胶底部，结束电泳。
4、小心将凝胶取下，进行染色，染色时间根据染色剂浓度而定。
5、染色结束后倒去染色液，用去离子水洗涤多次，然后加入脱色液。
6、脱色结束后用凝胶成像系统拍照分析。
具体步骤参照专利“201610053484.5、一种中性内切木聚糖酶及其编码基因与应用”中实施例2步骤(二)9。
表2 SDS-PAGE凝胶配制
组分 浓缩胶(5％)(5mL) 分离胶(12％)(10mL)
H<sub>2</sub>O 3.6 3.3
30％丙烯酰胺 0.83 4.0
1M Tris-HCL(pH 6.8) 0.42 无
1.5M Tris-HCL(pH 8.8) 无 2.5
10％SDS 0.05 0.1
10％AP 0.05 0.1
TEMED 0.005 0.004
2.2.4蛋白浓度测定方法
使用BCA蛋白质定量测定试剂盒进行蛋白浓度的测定。
(1)每个反应使用5mL Solution A，0.1mL Solution B准备A+B混合液，混匀后使用。
(2)取0.1mL待测样品加入2mL A+B混合液，37度反应30分钟。
(3)反应结束后在562nm处测定光的吸收值。
(4)通过标准曲线计算蛋白浓度。
2.2.5内切木聚糖酶的最适温度与热稳定性
本文酶学性质分析过程中每个数据均为平行测定三次取平均值所得。
(1)最适反应温度
以pH 7.0的柠檬酸缓冲液为缓冲体系，以1％的木聚糖为底物，反应体系为1100μL，反应时间为30min。测定30℃～75℃温度范围内内切木聚糖酶rXynh31、突变酶Xynh31-ED、Xynh31-K210R或Xynh31-Cys的酶活性，将最高酶活计为100％，进而计算出其他温度范围内的相对酶活力，然后拟合成曲线进行分析。
(2)热稳定性
分别取100μL酶液在温度为30℃～75℃条件下保温60min，再以pH 7.0的柠檬酸缓冲液为缓冲体系，以1％的木聚糖为底物，反应体系为1100μL，测定内切木聚糖酶rXynh31、突变酶Xynh31-ED、Xynh31-K210R或Xynh31-Cys酶活，将最高酶活计为100％，进而计算出其他温度范围内的相对酶活力，然后拟合成曲线进行分析。
2.2.6内切木聚糖酶最适pH与pH稳定性
(1)最适反应pH值
以60℃为反应温度，以1％的木聚糖为底物，反应体系为1100μL，反应时间为30min。测定在pH 3～11条件下内切木聚糖酶rXynh31、突变酶Xynh31-ED、Xynh31-K210R或Xynh31-Cys的酶活性，将最高酶活计为100％，进而计算出其他反应pH值的相对酶活力，然后拟合成曲线进行分析。
(2)pH值稳定性
将100μL的酶液分别加入1mL pH为3～11的缓冲液中，在37℃下分别温浴60min。然后加入反应底物木聚糖溶液(底物最终浓度为1％)在60℃反应30min，测定内切木聚糖酶rXynh31、突变酶Xynh31-ED、Xynh31-K210R或Xynh31-Cys的酶活性，将最高酶活计为100％，进而计算出其他pH值的相对酶活力，然后拟合成曲线进行分析。
3实验结果与分析
3.1木聚糖酶Xynh31同源建模及改造位点确定
3.1.1木聚糖酶Xynh31的三维结构
利用phyre2(Protein Homology/analogY Recognition Engine V 2.0)软件对木聚糖酶Xynh31进行同源建模，将模拟获得的信息进行分析，模板为c1iszA_(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/flibview.cgi？pdb＝c1iszA_)。如图1，3D结构建模显示，该蛋白整体结构呈现出主要由α-螺旋和β-折叠重复出现而构成上面略宽下面略窄的桶状结构，其主要折叠方式为(β/α)8桶状结构，这是10家族木聚糖酶所具有的典型特征。在所有的(β/α)8TIM桶结构中，催化中心位于由连接β折叠链羧基端与α螺旋氨基端的八个环所构成的口袋底部中，而参与结合和催化的活性残基均在这些环区中(朱绮霞等，2012)。
3.1.2木聚糖酶Xynh31活性位点的预测
在Prosite数据库中输入木聚糖酶Xynh31氨基酸序列，得到其结构域信息，如图2所示，Xynh31由两个结构域组成，分别是Glycosyl hydrolases family 10(GH10)和CBM2，这表明该木聚糖酶分类上属于糖苷水解酶第10家族，有着典型的10家族木聚糖酶的催化结构域，其结合结构域属于CBM2家族。
进一步进行活性位点的预测，由分析结果(图3)可见木聚糖酶Xynh31的预测活性位点为位于171的谷氨酸(Glu)和位于279的谷氨酸(Glu)。为验证预测的正确性，根据密码子偏好性及氨基酸理化性质，将171的谷氨酸(Glu，E)和位于279的谷氨酸(Glu，E)同时突变为天冬氨酸(Asp，D)，构建突变体Xynh31-ED。
3.1.3木聚糖酶Xynh31酶分子热稳定性改造位点的选择
精氨酸通常解离程度较高，对一些化学反应敏感性较低，导致其比赖氨酸更加适应高温环境。精氨酸能够在高温下维持离子对以及正电荷网状结构，所以在一些蛋白质中，赖氨酸Lys突变为精氨酸Arg通常能够提高蛋白的热稳定性(易弋等，2015)。本文从木聚糖酶Xynh31的3D同源模拟结构出发，选取在活性位点附近210点位的赖氨酸(Lys，K)并将其点突变为精氨酸(Arg，R)，构建突变体Xynh31-K210R。
以往有报道在酶的表面添加疏水性氨基酸如半胱氨酸能提高酶的热稳定性，此外当两个半胱氨酸空间上位置靠近时，经常能形成二硫键，也可增加热稳定性。本文参考3D同源模拟结构及文献报道(Watanabe et al.,2015)，选取了114位点的甘氨酸、119位点的甲硫氨酸同时突变为半胱氨酸即构建突变体Xynh31-Cys。
3.2Xynh31突变体重组子酶活力的初步测定
把突变体重组菌进行诱导培养，破壁后将粗酶液离心得到的上清液通过亲和层析纯化，透析浓缩10倍后进行蛋白电泳并测酶活。本实验中rXynh31为未经过任何定点突变的原始重组酶，Xynh31-ED为把理论活性位点谷氨酸突变为天冬氨酸的突变酶，Xynh31-K210R为精氨酸取代赖氨酸的突变酶，Xynh31-Cys为增加半胱甘酸的突变酶。
从电泳结果(图4)可知，rXynh31、Xynh31-ED、Xynh31-K210R表达正常，而第4泳道的纯化结果则并无蛋白，猜测可能因为引入半胱氨酸后形成包涵体，未能正常表达。
将纯化得到的酶进行酶活初步测定，结果如图5所示。原酶rXynh31相对酶活力标为100％，Xynh31-K210R活性与原酶rXynh31基本相当，但突变子Xynh31-ED活性仅为原酶rXynh31的0.4％，Xynh31-Cys则基本检测不到酶活性(Xynh31-Cys因无洗脱峰，使用粗酶液离心得到的上清进行酶活检测)。结果证明171位的谷氨酸(Glu，E)和位于279的谷氨酸为催化活性位点，被替换为天冬氨酸则酶活力迅速下降。Xynh31-K210R突变酶活性正常，可进一步研究其酶学性质。而Xynh31-Cys则检测不到酶活，猜测可能因为新形成二硫键导致蛋白无法正常折叠，形成包涵体。具体原因有待进一步研究。
3.3Xynh31-K210R突变酶的酶学性质研究
(1)最适反应pH和pH稳定性。
将突变酶Xynh31-K210R与原重组酶rXynh31进行最适反应pH值和pH稳定性测试，结果如图6，可见突变酶Xynh31-K210R与原重组酶rXynh31的最适反应pH值均为7.0～9.0，在pH7～10之间仍保持较高的活性。两者的pH稳定性基本相似，在pH5.0～10.0之间较为稳定，在中性及碱性条件下表现出良好的pH稳定性。
(2)最适反应温度和热稳定性。
结果由图7-A可见，原重组酶rXynh31的最适反应温度约为45℃，而突变酶Xynh31-K210R的最适温度为55℃，最适反应温度提高了10℃。将纯酶液分别置于不同的温度条件下(30℃～75℃)保温60min，然后于45℃反应20min测定其酶活力(如图7-B)。结果表明，重组酶rXynh31在50℃以下具有较好稳定性，而当温度高于55℃时，呈现出急剧下降的趋势。突变酶Xynh31-K210R则稳定性得到提高，在60℃时仍然有超过60％的残余酶活。当温度达到70℃时，原酶剩余活力为11％，而Xynh31-K210R残余活力仍有将近40％。可见引入精氨酸突变提高了内切木聚糖酶Xynh31的热稳定性。
4小结
(1)证明Xynh31木聚糖酶的催化位点为171位和279位的谷氨酸。
根据查阅文献、序列对比分析及蛋白结构模拟等方法，预测内切木聚糖酶Xynh31的活性位点催化活性位点为171位和279位的谷氨酸(Glu，E)，在此基础上构建突变体Xynh31-ED，实验结果表明突变体基本没有酶活性，证明Xynh31木聚糖酶的催化位点为171位和279位的谷氨酸。
(2)通过定点突变得到了耐热突变酶Xynh31-K210R。
根据文献及蛋白结构模拟结果，通过将210位的赖氨酸定点突变为精氨酸，得到了一个耐热突变酶Xynh31-K210R，该突变酶最适反应温度为55℃，其最适反应温度提升了10℃。热稳定性研究显示该酶在60℃时仍然有超过60％的残余酶活，而原酶残余酶活不到30％，证明该酶的热稳定性得到了提升。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 一种突变酶Xynh31-K210R及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突变酶Xynh31-K210R的氨基酸序列
<400> 1
Met Pro Asn Asp Ser Leu Asp Arg Arg Lys Pro Pro Gly Trp Arg Ala
1 5 10 15
Leu Gly Arg Lys Ala Leu Leu Ile Gly Ala Val Gly Ala Leu Cys Val
20 25 30
Thr Gly Val Val Ala Met Pro Gly Thr Ala Ser Ala Ala Ser Thr Leu
35 40 45
Ala Gly Val Ala Ala Glu Lys Gly Arg Tyr Phe Gly Ala Ala Val Ser
50 55 60
Ala Gly Gln Leu Asn Glu Ala Asp Tyr Met Ser Arg Leu Asn Ser Glu
65 70 75 80
Phe Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Trp Asp Ala Leu Glu
85 90 95
Pro Ser Arg Asn Ser Phe Asn Phe Ala Thr Ala Asp Arg Ile Val Asp
100 105 110
His Gly Arg Ser Arg Asn Met Ser Val Arg Gly His Thr Leu Val Trp
115 120 125
His Ser Gln Leu Pro Gly Trp Val Gly Ser Leu Gly Ala Ala Asp Leu
130 135 140
Arg Ser Ala Met Asn Asn His Ile Thr Thr Val Met Arg His Tyr Arg
145 150 155 160
Gly Lys Ile His Ser Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Gln Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Ala Arg Arg Ser Ser Pro Phe Gln Asp Arg Leu Gly Asn
180 185 190
Gly Trp Ile Glu Glu Ser Phe Arg Thr Ala Arg Ala Ala Asp Ser Ser
195 200 205
Ala Arg Leu Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Thr Asp Gly Ile Asn Ala Lys
210 215 220
Ser Asn Ala Val Tyr Asn Met Val Arg Asp Phe Lys Gln Arg Gly Val
225 230 235 240
Pro Ile Asp Cys Val Gly Phe Gln Ser His Phe Asn Ser Asn Ser Pro
245 250 255
Val Pro Ser Asp Tyr Gln Arg Asn Leu Gln Arg Phe Ala Asp Leu Gly
260 265 270
Val Asp Val Gln Ile Thr Glu Leu Asp Ile Glu Gly Ser Arg Thr Ala
275 280 285
Gln Ala Asn Asp Tyr Arg Arg Val Val Glu Ala Cys Leu Gly Val Thr
290 295 300
Arg Cys Thr Gly Ile Thr Val Trp Gly Val Thr Asp Lys Tyr Ser Trp
305 310 315 320
Arg Ser Gly Gly Thr Pro Leu Leu Phe Asp Gly Asn Tyr Asn Lys Lys
325 330 335
Pro Ala Tyr His Ala Val Leu Ala Ala Leu Gly Gly Ser Gly Asp Gly
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Gly Asp Gly Ser Cys Thr Val Thr Tyr Glu Glu Thr
355 360 365
Asp Arg Trp Gly Asp Arg Phe Asn Gly Arg Val Thr Val Arg Ala Gly
370 375 380
Ser Ser Ala Ile Ser Ser Trp Arg Val Asn Val Thr Val Arg Ser Pro
385 390 395 400
Gln Arg Ile Ser Ala Thr Trp Asn Gly Thr Pro Ser Trp Asp Ser Ser
405 410 415
Gly Asn Val Met Thr Met Arg Pro Asn Gly Asn Gly Asn Leu Ser Pro
420 425 430
Gly Ala Ser Thr Ser Phe Gly Phe Thr Val Met Ala Asn Asn Asn Trp
435 440 445
Thr Ala Pro Thr Leu Gly Ala Cys Ser Val Ser
450 455
<210> 2
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突变酶Xynh31-K210R的核苷酸序列
<400> 2
atgcccaacg attcgttaga caggcgcaag ccccccggat ggcgggcgct gggccgcaag 60
gcactcctga tcggcgccgt cggcgccctc tgcgtgaccg gcgtggtagc catgcccggt 120
accgccagcg ccgcctccac gctcgccggt gtcgccgcgg agaagggccg gtacttcggc 180
gcggccgtct cggccggcca gctcaacgag gcggactaca tgtccaggct gaacagcgag 240
ttcaacagcc tcacggccga gaacgagatg aagtgggacg ccctggagcc gtcccgcaac 300
tcgttcaact tcgccaccgc cgaccggatc gtcgatcacg gacgcagccg gaacatgtcg 360
gtccgcggcc acaccctggt gtggcactcc cagttgcccg gctgggtggg cagtcttggc 420
gcagccgacc tgcgttcggc gatgaacaac cacatcacca ccgtgatgcg gcactaccgc 480
ggcaagatcc actcctggga cgtggtcaac gaggcgttcc aggacggcgg cagcggcgcc 540
cggcgcagct ccccgttcca ggaccggctc ggcaacggct ggatcgagga gtcgttccgc 600
accgcccgcg ccgccgactc cagcgccaga ctctgctaca acgactacaa caccgacggg 660
atcaacgcca agagcaacgc ggtctacaac atggtgcgcg acttcaagca gcgcggcgtg 720
cccatcgact gcgtcggctt ccagtcgcac ttcaacagca actcgcccgt accgagcgac 780
taccagcgca acctccagcg cttcgccgac ctcggcgtcg acgtgcagat caccgaactt 840
gacatcgagg gctccagaac cgcccaggcc aacgactacc gccgcgtcgt ggaggcgtgc 900
ctcggcgtga cccgctgcac cggcatcacg gtctggggcg tcaccgacaa gtactcctgg 960
cgtagcggcg gcactccgct gctgttcgac ggcaactaca acaagaagcc cgcctaccac 1020
gcggtgctgg cggcgctggg cggctccggc gacggcggcg gcgggggcgg cgacggctcc 1080
tgcaccgtca cctacgagga gacggaccgc tggggcgacc gcttcaacgg cagggtgacg 1140
gtccgggccg gaagctccgc gatcagcagc tggcgggtga acgtgaccgt gcgctccccg 1200
cagaggatct ccgccacctg gaacggcaca ccgtcctggg acagcagcgg gaacgtgatg 1260
acgatgaggc ccaacggcaa cggcaacctg tcccccgggg cgtcgaccag cttcggcttc 1320
accgtcatgg cgaacaacaa ctggacggcc ccgaccctcg gagcctgttc cgtctcctga 1380
<210> 3
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Xynh31酶的氨基酸序列
<400> 3
Met Pro Asn Asp Ser Leu Asp Arg Arg Lys Pro Pro Gly Trp Arg Ala
1 5 10 15
Leu Gly Arg Lys Ala Leu Leu Ile Gly Ala Val Gly Ala Leu Cys Val
20 25 30
Thr Gly Val Val Ala Met Pro Gly Thr Ala Ser Ala Ala Ser Thr Leu
35 40 45
Ala Gly Val Ala Ala Glu Lys Gly Arg Tyr Phe Gly Ala Ala Val Ser
50 55 60
Ala Gly Gln Leu Asn Glu Ala Asp Tyr Met Ser Arg Leu Asn Ser Glu
65 70 75 80
Phe Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Trp Asp Ala Leu Glu
85 90 95
Pro Ser Arg Asn Ser Phe Asn Phe Ala Thr Ala Asp Arg Ile Val Asp
100 105 110
His Gly Arg Ser Arg Asn Met Ser Val Arg Gly His Thr Leu Val Trp
115 120 125
His Ser Gln Leu Pro Gly Trp Val Gly Ser Leu Gly Ala Ala Asp Leu
130 135 140
Arg Ser Ala Met Asn Asn His Ile Thr Thr Val Met Arg His Tyr Arg
145 150 155 160
Gly Lys Ile His Ser Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Gln Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Ala Arg Arg Ser Ser Pro Phe Gln Asp Arg Leu Gly Asn
180 185 190
Gly Trp Ile Glu Glu Ser Phe Arg Thr Ala Arg Ala Ala Asp Ser Ser
195 200 205
Ala Lys Leu Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Thr Asp Gly Ile Asn Ala Lys
210 215 220
Ser Asn Ala Val Tyr Asn Met Val Arg Asp Phe Lys Gln Arg Gly Val
225 230 235 240
Pro Ile Asp Cys Val Gly Phe Gln Ser His Phe Asn Ser Asn Ser Pro
245 250 255
Val Pro Ser Asp Tyr Gln Arg Asn Leu Gln Arg Phe Ala Asp Leu Gly
260 265 270
Val Asp Val Gln Ile Thr Glu Leu Asp Ile Glu Gly Ser Arg Thr Ala
275 280 285
Gln Ala Asn Asp Tyr Arg Arg Val Val Glu Ala Cys Leu Gly Val Thr
290 295 300
Arg Cys Thr Gly Ile Thr Val Trp Gly Val Thr Asp Lys Tyr Ser Trp
305 310 315 320
Arg Ser Gly Gly Thr Pro Leu Leu Phe Asp Gly Asn Tyr Asn Lys Lys
325 330 335
Pro Ala Tyr His Ala Val Leu Ala Ala Leu Gly Gly Ser Gly Asp Gly
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Gly Asp Gly Ser Cys Thr Val Thr Tyr Glu Glu Thr
355 360 365
Asp Arg Trp Gly Asp Arg Phe Asn Gly Arg Val Thr Val Arg Ala Gly
370 375 380
Ser Ser Ala Ile Ser Ser Trp Arg Val Asn Val Thr Val Arg Ser Pro
385 390 395 400
Gln Arg Ile Ser Ala Thr Trp Asn Gly Thr Pro Ser Trp Asp Ser Ser
405 410 415
Gly Asn Val Met Thr Met Arg Pro Asn Gly Asn Gly Asn Leu Ser Pro
420 425 430
Gly Ala Ser Thr Ser Phe Gly Phe Thr Val Met Ala Asn Asn Asn Trp
435 440 445
Thr Ala Pro Thr Leu Gly Ala Cys Ser Val Ser
450 455
<210> 4
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Xynh31酶的核苷酸序列
<400> 4
atgcccaacg attcgttaga caggcgcaag ccccccggat ggcgggcgct gggccgcaag 60
gcactcctga tcggcgccgt cggcgccctc tgcgtgaccg gcgtggtagc catgcccggt 120
accgccagcg ccgcctccac gctcgccggt gtcgccgcgg agaagggccg gtacttcggc 180
gcggccgtct cggccggcca gctcaacgag gcggactaca tgtccaggct gaacagcgag 240
ttcaacagcc tcacggccga gaacgagatg aagtgggacg ccctggagcc gtcccgcaac 300
tcgttcaact tcgccaccgc cgaccggatc gtcgatcacg gacgcagccg gaacatgtcg 360
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gcagccgacc tgcgttcggc gatgaacaac cacatcacca ccgtgatgcg gcactaccgc 480
ggcaagatcc actcctggga cgtggtcaac gaggcgttcc aggacggcgg cagcggcgcc 540
cggcgcagct ccccgttcca ggaccggctc ggcaacggct ggatcgagga gtcgttccgc 600
accgcccgcg ccgccgactc cagcgccaag ctctgctaca acgactacaa caccgacggg 660
atcaacgcca agagcaacgc ggtctacaac atggtgcgcg acttcaagca gcgcggcgtg 720
cccatcgact gcgtcggctt ccagtcgcac ttcaacagca actcgcccgt accgagcgac 780
taccagcgca acctccagcg cttcgccgac ctcggcgtcg acgtgcagat caccgaactt 840
gacatcgagg gctccagaac cgcccaggcc aacgactacc gccgcgtcgt ggaggcgtgc 900
ctcggcgtga cccgctgcac cggcatcacg gtctggggcg tcaccgacaa gtactcctgg 960
cgtagcggcg gcactccgct gctgttcgac ggcaactaca acaagaagcc cgcctaccac 1020
gcggtgctgg cggcgctggg cggctccggc gacggcggcg gcgggggcgg cgacggctcc 1080
tgcaccgtca cctacgagga gacggaccgc tggggcgacc gcttcaacgg cagggtgacg 1140
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cagaggatct ccgccacctg gaacggcaca ccgtcctggg acagcagcgg gaacgtgatg 1260
acgatgaggc ccaacggcaa cggcaacctg tcccccgggg cgtcgaccag cttcggcttc 1320
accgtcatgg cgaacaacaa ctggacggcc ccgaccctcg gagcctgttc cgtctcctga 1380
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XnyH31全长上游引物（EcoR I）
<400> 5
ccggaattca tgcccaacga ttcgttagac aggcgcaag 39
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XnyH31全长下游引物（XhoI）
<400> 6
ccgctcgagt cagtgatggt gatggtggtg ggagacggaa caggctccga 50
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XnyH31 sense（E171D）
<400> 7
cgtggtcaac gacgcgttcc ag 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XnyH31 antisense（E171D）
<400> 8
ctggaacggt cgttgaccac g 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XnyH31 sense（E279D）
<400> 9
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<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XnyH31 antisense（E279D）
<400> 10
cgatgtcaag gtcggtgatc tg 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XnyH31 sense（K210R）
<400> 11
ccagcgccag actctgctac a 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XnyH31 antisense（K210R）
<400> 12
tgtagcagag tctggcdctg g 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XnyH31 sense（G114C）
<400> 13
gtcgatcact gccgcagccg g 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XnyH31 antisense（G114C）
<400> 14
ccggcagcgg cagtgatcga c 21
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XnyH31 sense（M119C）
<400> 15
agccggaact gctcggtccg cgg 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> XnyH31 antisense（M119C）
<400> 16
ccgcggaccg agcagttccg gct 23

Claims (9)

1.一种突变酶Xynh31-K210R，其特征在于：该突变酶Xynh31-K210R是氨基酸序列为SEQID No：3的Xynh31酶的第210位氨基酸由赖氨酸突变为精氨酸；所述突变酶Xynh31-K210R的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.编码权利要求1所述的突变酶Xynh31-K210R的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
4.一种用于在宿主细胞内表达权利要求1所述的突变酶Xynh31-K210R的重组质粒。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于：所述的重组质粒为适于在大肠杆菌中表达的载体。
6.根据权利要求4或5所述的重组质粒，其特征在于：所述的重组质粒携带有权利要求2或3所述的基因。
7.一种工程菌株，其特征在于：所述的工程菌株携带权利要求4、5或6所述的重组质粒。
8.根据权利要求7所述的工程菌株，其特征在于：所述的工程菌株是以大肠杆菌E.coliBL21 Star(DE3)为宿主菌，将重组质粒转化到宿主菌后得到的重组菌。
9.权利要求1所述的突变酶Xynh31-K210R在造纸工业中的应用。
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