CN104862301A

CN104862301A - 一种从母体血浆中分离富集游离胎儿dna的方法

Info

Publication number: CN104862301A
Application number: CN201510075702.0A
Authority: CN
Inventors: 罗红蓉
Original assignee: GUANGZHOU KANGRUI BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU KANGRUI BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2014-02-21
Filing date: 2015-02-11
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2035-02-11
Also published as: CN104862301B

Abstract

本发明公开了一种从含DNA的样品中富集分离小片段DNA的方法，它包括如下步骤：离心样品制备无细胞样品，裂解，结合到二氧化硅柱上，洗涤，部分洗脱，再结合，洗涤，洗脱。本发明方法能有效富集血浆中的低含量的游离胎儿DNA，方法简单，实用，有效，适合用于多个样品的同时处理，无需酚-氯仿等对人体有害的物质，获得的小片段DNA纯度高，可直接用于下游的PCR、实时荧光定量PCR和测序等，具有较好的应用前景。

Description

一种从母体血浆中分离富集游离胎儿DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种从母体血浆中分离富集游离胎儿DNA的方法，属于生物技术领域。

背景技术

在我国，每年新生儿出生缺陷多达80万至120万，尽早进行产检筛查和针对是最有效的应对措施，然而目前常规的针对方法皆为有创兴方法，对胎儿和孕妇都有一定的危险性，因此发展新的无创性产前诊断具有重要的临床意义。1997年Lo等发现在孕妇血浆中存在少量的游离胎儿DNA(cffDNA)，使得开发母体血浆用于安全无创产前诊断(NIPD)成为可能。

然而孕妇外周血中cffDNA含量极少，仅为血浆总游离DNA的19％左右，并且与大量的母体血浆游离DNA混杂在一起，给cffDNA的检测和分离造成了极大的困难，如何从孕妇外周血中高效富集cffDNA已经成为研究的焦点。

目前，从母体血浆中分离游离胎儿DNA的方法有电泳分离法和磁珠分离法，但是由于游离的无细胞胎儿DNA含量极低，实际上很难用电泳分离法等分离不同大小的DNA片段，电泳法还会损失样本，造成污染，而磁珠分离法则较昂贵，回收率也不高。

需要寻找一种有效、简便、成本低廉的游离胎儿DNA分离方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种从含DNA的样品中富集分离游离胎儿DNA的方法。

本发明从含DNA的样品中富集游离胎儿DNA的方法，包括如下步骤：

(1)离心样品，取上清；

(2)每1ml上清中加入结合缓冲液A0.8～1ml、细胞裂解液50～150μl，混匀，在25℃～65℃条件下放置20～60min；

(3)将步骤(2)处理后的样品加入到二氧化硅结合柱上，离心，先用洗涤缓冲液B洗脱；

(4)再用选择性洗涤缓冲液C洗脱，收集洗脱液；

(5)每1ml洗脱液中加入结合缓冲液A0.8～1ml，混匀，在25℃～65℃条件下放置20～60min；

(6)重复步骤(3)；

(7)用洗涤缓冲液D洗脱，再用洗脱缓冲液E洗脱，收集洗脱液，即可。

其中，结合缓冲液A包含如下成分：

洗涤缓冲液B包含如下成分：

硫氰酸胍 100～140g

0.1MTris盐酸 80～120ml；

选择性洗涤缓冲液C由缓冲液B与5M NaCl溶液以1:(2～4)v/v的比例混合而成；

洗涤缓冲液D为含(5～15)mMNaCl的(50％～90％)的乙醇溶液；

(50％～90％)的乙醇溶液：是指乙醇溶液的浓度为50％～90％(v/v)。

洗脱缓冲液E包含如下成分：

0.005～0.015MTris-盐酸

0.0005～0.0015M EDTA。

二氧化硅结合柱是二氧化硅核酸结合柱(Qiagen,QIAamp Mini Spin Columns51304)。

步骤(1)中，所述离心的方法为：将样品在1800～2000g、4℃条件下离心10min，将上清再在15000～16000g、4℃条件下离心10～15min，即可。优选地，前一次离心的条件是：1900g、4℃离心10min；后一次离心的条件是：16000g、4℃离心10min。

步骤(2)中，每1ml上清中加入结合缓冲液A0.9ml，细胞裂解液100μl。；混匀后，在60℃放置30min

步骤(3)中，所述离心是在13000rpm离心1～2min。

步骤(3)中，用缓冲液B洗脱的方法是：加入750μl洗涤缓冲液B，13000rpm离心1min，弃去收集管，换上新的收集管。

步骤(5)中，每1ml洗脱液中加入结合缓冲液A0.9ml，混匀，在60℃放置30min。

步骤(7)中，用洗涤缓冲液D洗脱的方法是：加入洗涤缓冲液D，13000rpm离心1～2min。

步骤(7)中，用洗涤缓冲液E洗脱的方法是：加入洗涤缓冲液E，静置5分钟，13000rpm离心1min。

所述结合缓冲液A包含如下成分：

所述结合缓冲液A的pH为7.2～7.6，优选为7.4。

所述细胞裂解液是浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液。

所述洗涤缓冲液B包含如下成分：

硫氰酸胍 120g

0.1MTris盐酸 100ml

所述洗涤缓冲液B的pH为6.2～6.6，优选为6.4。

所述选择性洗涤缓冲液C由缓冲液B与5M NaCl溶液以1:3v/v的比例混合而成。

所述洗涤缓冲液D为含10mM NaCl的70％乙醇溶液。

所述洗脱缓冲液E包含如下成分：

0.001MTris-盐酸

0.0001M EDTA。

所获得的DNA片段长度为75bp～500bp。

DNA片段长度主要为100bp～300bp。

本发明方法能从母体血浆中有效富集低含量的游离胎儿DNA，方法简单，实用，有效，适合用于多个样品的同时处理，无需酚-氯仿等对人体有害的物质，获得的游离胎儿DNA纯度高，可直接用于下游的PCR、实时荧光定量PCR和测序等，具有较好的应用前景。

样品可以是新鲜或冷冻的血浆。起始样本体积为600μl～3ml，洗脱体积为10μl～100μl。本发明方法获得的DNA片段长度为75bp～500bp，主要富集片段长度为100～300bp的游离DNA。

本发明方法无需酚-氯仿提取，只需将核酸特异地结合于二氧化硅膜结合柱上，并通过缓冲液洗涤步骤后完全除去二价阳离子和蛋白质等PCR抑制剂，再次洗涤后，再分步获得洗脱液，用洗脱液C获得<500bp的小片段DNA，再次过柱纯化，洗涤去除杂质后，最后洗脱，可获得富集的游离胎儿DNA，并可最大限度去除母体背景的DNA干扰。

该技术方法包括2个循环提取过程，共7个步骤(裂解，结合，洗涤，部分洗脱，再结合，洗涤，洗脱)。

技术路线图如附图1所示。

具体的技术步骤如下：

1.血浆处理方法

低速-高速两步离心法获得无细胞血浆

(1)将刚获得的BD采血管(EDTA全血，<2hr)在4℃，1900×g离心10min；

(2)轻轻吸取上清液于15ml锥底形离心管中，切勿接触到上清液与下层的界面膜状物；

(3)再在4℃，16000×g离心10min，该步骤可进一步去除细胞碎片及其附着于上的核酸；

(4)小心转移上清液于新的保存管中，勿接触或扰动底部的沉淀物；

(5)血浆即可用于提取核酸或置于–80℃长期储存备用，使用前在室温解冻，但忌再次冻存。

2.提取步骤

(1)裂解

在生物流体中，自由循环的核酸通常被结合到蛋白质或笼罩在囊泡上，需要以一种有效的裂解步骤，以释放核酸，选择性地结合到二氧化硅核酸结合柱上。

(2)结合

通过结合缓冲液A，可形成高盐及合适的pH条件，确保核酸选择性结合到的二氧化硅核酸结合柱上。

(3)洗涤

通过洗涤缓冲液B，核酸仍然与膜结合，而蛋白质，二价阳离子等杂质、残留污染物被有效冲走。

(4)选择性洗脱

通过选择性洗脱缓冲液C，膜上结合的<500bp的小片段核酸被洗脱下来。

(5)再结合

收集步骤(4)的洗脱液，与等体积的结合缓冲液A混合，小片段DNA被重新吸附于二氧化硅结合柱上。

(6)再洗涤

同步骤3。

(7)洗脱

使用缓冲液D洗脱；

使用洗脱缓冲液E，将膜上结合的小片段DNA洗脱下来。洗脱体积20-100μl，可低至10μl，低洗脱体积可以获得高浓度的DNA，用于后续定量PCR，测序等下游应用，可增加检测灵敏度。

(8)制备的无细胞游离DNA，24小时以内使用贮存在2-8℃下，长期需贮存于-15℃～-30℃。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步地详细说明。但不应理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1本发明流程图

图2实时定量PCR检测洗脱液中的游离DNA。第一次洗脱为柱上残留的PCR产物，第二次洗脱为分段洗脱液重新绑定，洗涤和洗脱后DNA,可见回收大部分的PCR产物，特别是低浓度时。

图3电泳图谱。将5ul 1kb plus DNA ladder于1ml H2O中，1为洗涤缓冲液B，作为对照；2为选择性洗涤缓冲液C1由缓冲液B与5M NaCl溶液以1:2v/v的比例混合；3为选择性洗涤缓冲液C2由缓冲液B与5M NaCl溶液以1:4v/v的比例混合而成；M为Marker。

具体实施方式

实施例一采用本发明方法从孕妇血浆中富集纯化胎儿DNA

一、实验方法

4位胎龄为12-16周的孕妇，样本1-3为男胎，样本4为女胎。抽取孕妇静脉血5ml，将刚获得的BD采血管(EDTA全血)在4℃，1900×g离心10min；吸取上清液于15ml锥底形离心管中，再在4℃，16000×g离心10min，小心转移上清液于新的保存管中，用于下述方法进行游离胎儿DNA提取：

1、在15ml离心管中加入蛋白酶K100μl；

2、再加入1ml孕妇血浆于离心管中；

3、加入结合缓冲液A 0.9ml，涡旋15-30s，充分混匀；

4、60℃温育30min；

5、分两次将裂解液加入二氧化硅柱，每次1ml；

6、13000rpm离心1min，弃去收集管，换上新的收集管；

7、加入750μl洗涤缓冲液B，13000rpm离心1min，弃去收集管，换上新的收集管，核酸仍然与膜结合，而蛋白质，二价阳离子等杂质残留污染物被有效冲走；

8、加入50μl选择性洗涤缓冲液C，膜上结合的<500bp的小片段核酸被洗脱下来；

9、在洗脱液中加入250μl结合缓冲液A，重复步骤3-7；

10、加入洗涤缓冲液D 750μl,13000rpm离心1～2min，弃去洗涤缓冲液；洗涤缓冲液D为含10mM NaCl的70％乙醇溶液；

11、在柱子中间加入10μl洗脱缓冲液E，静置5分钟，13000rpm离心1min，即可获得高纯度的小片段胎儿DNA。

对照方法为通常的一次提取法，具体步骤如下：

1、在15ml离心管中加入蛋白酶K100μl；

2、再加入1ml孕妇血浆于离心管中；

3、加入结合缓冲液A 0.9ml，涡旋15-30s，充分混匀；

4、60℃温育30min；

5、分两次将裂解液加入二氧化硅柱，每次1ml；

6、13000rpm离心1min，弃去收集管，换上新的收集管；

8、加入洗涤缓冲液D 750μl,13000rpm离心1～2min，弃去洗涤缓冲液；洗涤缓冲液D为含10mM NaCl的70％乙醇溶液；

9、在柱子中间加入10μl洗脱缓冲液E，静置5分钟，13000rpm离心1min，即可获得DNA。

二、检测方法

1、用实时荧光定量PCR的方法，以SEQ ID NO.2～3所示的核苷酸序列作为引物，实时荧光定量PCR检测分析SRY基因(男性特有基因)的量(Biorad,Green master mixes,12.5ul,1ul primer,DNA1ul 9.5ul,25ul；反应条件90℃5min,40次循环90℃15s,60℃,30s)。

2、将18s rRNA作为内对照，比较一次提取和本发明方法的结果如下：18S primers,product 107bp。

18S-2-fw CTTAGAGGGACAAGTGGCG

18S-2-rv ACGCTGAGCCAGTCAGTGTA

三、检测结果

Ct值：指每个反应管内的荧光信号达到所设定的阈值时，所经历的反应循环数，Ct值越高，表明样品中DNA含量越低，Ct值越低，表明样品中DNA含量越高。

1、荧光定量PCR的检测结果

样本1、2、3均为男胎，分离的游离胎儿DNA含有SRY基因(男性特有基因)，采用前述应该定量PCR方法可以有效扩增，如果本发明方法可以有效富集游离胎儿DNA，其扩增的Ct值应当低于40；而样本4为女胎，分离的游离胎儿DNA不含有含有SRY基因(男性特有基因)，无法有效扩增，其扩增的Ct值应当大于40。

检测结果如下表所示：

	样本1	样本2	样本3	样本4
					Ct	18.9	24.1	22.6	>40

可以看出，样本1、2、3的Ct值均小于30，而样本4的Ct值>40，与理论推测一致。

实验结果说明，本发明方法可以可以有效富集游离胎儿DNA。

2、一次提取与本发明方法的比较

当用18s rRNA为内对照，比较本发明方法和一次提取方法，结果如下表：

	样本1	样本2	样本3
				本发明方法制备的洗脱液(Ct)	18srRNA	17.5	20.3	18.5
SRY	18.9	24.1	22.6
				一次提取(Ct)	18srRNA	14.1	16.2	15.4
SRY	17.8	23.6	21.6

由上表可以看出，与一次提取相比，本发明方法分离的产物中，总DNA量更低，而游离胎儿DNA相对更高。表明本发明方法可以选择性富集游离胎儿DNA，而尽量去除母体游离DNA，回收率高，获得的游离胎儿DNA纯度高。

实验结果说明，本发明分离方法可以有效富集游离胎儿DNA，且获得的游离胎儿DNA纯度高。

实施例二本发明方法用于提取血浆中的男性特异的SRY基因

本实施例采用往空白血浆中加入SRY基因片段的方式，验证本发明方法的有效性。本发明SRY基因片段，其长度为194bp，属于游离胎儿DNA。

一、实验方法

男性胎儿DNA存在着Y染色体特异性序列，研究者目前一般通过荧光定量PCR技术来检测Y染色体上的特异性基因，如SRY基因、DYS14等，从而对男性游离胎儿DNA进行定量。

SRY基因为男性特有基因。通常人血浆中游离DNA含量大约为1–100ng/ml。两份600μl的血浆来自一名75岁的老年女性，按以下表1的比例加入了核苷酸序列如SEQ ID NO.1

(aattgcagtttgcttcccgcagatcccgcttcggtactctgcagcgaagtgcaactggacaacaggttgtacagggatgactgtacgaaagccacacactcaagaatggagcaccagctaggccacttaccgcccatcaacgcagccagctcaccgcagcaacgggaccgctacagccactggacaaagctgta)所示的194bp的SRY基因片段于2个血浆样本中，用本发明分离游离胎儿DNA方法富集分离血浆中的SRY基因的片段。洗脱体积为10μl，DNA的富集量用实时荧光定量PCR检测分析(Biorad,Green master mixes,12.5ul,1ul primer,DNA1ul9.5ul,25ul；反应条件90℃5min,40次循环90℃15s,60℃,30s)，引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示，扩增出来的基因片段如SEQ IDNO.4所示，为85bp。血浆和水分别作为对照。

实验中血浆样本的游离DNA浓度

	血浆样本1	血浆样本2
			血浆	600μl	600μl
PCR产物	3ng	30ng
			DNA浓度(ng/ml)	5ng/ml	50ng/ml

本发明分离游离胎儿DNA方法和对照方法(一次提取法)同实施例1。

二、检测结果

空白血浆和水的Ct值均大于40，表明其中均不能检测到该PCR产物的存在，而样本1和样本2的检测结果如图2所示，Ct值均小于15，表明本发明方法可以有效富集SRY基因片段；

同时，与一次提取相比，本发明方法可以有效降低Ct值，说明本发明方法与一次洗脱相比，可以更为有效富集SRY基因片段。

结果表明，本发明方法可从SRY基因片段低至5ng/ml的血浆中分离富集到SRY基因片段，说明本发明方法可以从血浆中有效分离低浓度的游离胎儿DNA。

实施例三本发明选择洗脱液的筛选实验

一、实验方法

操作步骤如下，其中步骤7分别按照三种方法处理：

1、5ul 1kb plus DNA ladder加有1ml H₂O的离心管中；

2、加入结合缓冲液A 0.9ml，涡旋15-30s，充分混匀；

4、60℃温育30min；

5、分两次将裂解液加入二氧化硅柱，每次1ml；

6、13000rpm离心1min，弃去收集管，换上新的收集管；

7、处理1：加入750μl洗涤缓冲液B，13000rpm离心1min，弃去收集管，换上新的收集管，核酸仍然与膜结合，而蛋白质，二价阳离子等杂质残留污染物被有效冲走；

或处理2：加入750μl洗涤缓冲液C1(处理2为选择性洗涤缓冲液C1由缓冲液B与5M NaCl溶液以1:2v/v的比例混合)，13000rpm离心1min，弃去收集管，换上新的收集管，大片段的核酸仍然与膜结合，而小于500bp的小片段DNA，蛋白质，二价阳离子等杂质残留污染物在过柱液中；

或处理3：加入750μl洗涤缓冲液C2(处理3为选择性洗涤缓冲液C2由缓冲液B与5M NaCl溶液以1:4v/v的比例混合而成)，13000rpm离心1min，弃去收集管，换上新的收集管，大片段的核酸仍然与膜结合，而小于500bp的小片段DNA，蛋白质，二价阳离子等杂质残留污染物在过柱液中；

10，将以上处理获得DNA在2％琼脂糖凝胶电泳，80v 40min,Biorad凝胶成像系统照相获得图。

二、实验结果

结果如图3所示：步骤7中，采用洗涤缓冲液B洗脱(处理1)后，大量小片段DNA(<500bp)仍然结合在柱子上，而采用本发明选择性洗涤缓冲液C(处理2和处理3)洗脱后，大量小片段DNA(<500bp)被洗脱，大片段DNA则仍然结合在柱子上，说明本发明选择性洗涤缓冲液C可以地选择性洗脱小片段DNA(<500bp)，可以有效富集小片段DNA，而洗涤缓冲液B则不能。

母体血浆中，游离胎儿DNA片段较短，通平均为300bp，而游离母体DNA片段则较长，通常大于1kb。结合前述实验结果，我们可以得知，本发明采用选择性洗涤缓冲液C可以选择性洗脱游离胎儿DNA，而不会洗脱游离母体DNA，可以从母体血浆中有效富集游离胎儿DNA，而采用洗涤缓冲液B则无法达到目的。

综上，本发明方法可以选择性富集游离胎儿DNA，获得的游离胎儿DNA纯度高，且操作简单，成本低，为临床应用实践奠定了技术基础，具有良好的应用前景。

本发明中，SEQ ID NO.1～5所述的核苷酸的序列如下：

SEQ ID NO.1：

5’-aattgcagtttgcttcccgcagatcccgcttcggtactctgcagcgaagtgcaactggacaacaggttgtacagggatgactgtacgaaagccacacactcaagaatggagcaccagctaggccacttaccgcccatcaacgcagccagctcaccgcagcaacgggaccgctacagccactggacaaagctgta-3’

SEQ ID NO.2：

5’-tactctgcagcgaagtgcaa-3’。

SEQ ID NO.3：

5’-agctggtgctccattcttga-3’。

SEQ ID NO.4：

5’-tactctgcagcgaagtgcaactggacaacaggttgtacagggatgactgtacgaaagccacacactca

Agaatggagcaccagct-3’。

Claims

1.一种从母体血浆中分离富集游离胎儿DNA的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取母体血浆样品，离心，得上清；

(3)加入到二氧化硅结合柱上，离心，用洗涤缓冲液B洗脱；

(4)再用选择性洗涤缓冲液C洗脱，收集洗脱液；

(6)重复步骤(3)；

(7)用洗涤缓冲液D洗脱，再用洗脱缓冲液E洗脱，收集洗脱液，即可；

其中，结合缓冲液A包含如下成分：

其中，细胞裂解液是浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液；

其中，洗涤缓冲液B包含如下成分：

硫氰酸胍 100～140g

0.1MTris盐酸 80～120ml；

其中，选择性洗涤缓冲液C由缓冲液B与5mol/L NaCl溶液以1:(2～4)v/v的比例混合而成；

其中，洗涤缓冲液D为含(5～15)mmol/LNaCl的(50％～90％)的乙醇溶液；

其中，洗脱缓冲液E包含如下成分：

0.005～0.015mol/L Tris-盐酸

0.0005～0.0015mol/L EDTA

其余为水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述离心的方法为：将样品在1800～2000g、4℃条件下离心10min，取上清再在15000～16000g、4℃条件下离心10～15min，即可。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：第一次离心的条件是：1900g、4℃离心10min；后一次离心的条件是：16000g、4℃离心10min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，每1ml上清中加入结合缓冲液A0.9ml，细胞裂解液100μl；混匀后，在60℃放置30min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述离心是在13000rpm条件下离心1～2min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中，每1ml洗脱液中加入结合缓冲液A0.9ml，混匀，在60℃放置30min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述结合缓冲液A包含如下成分：

硫氰酸胍 120g

0.1MTris盐酸 100ml

0.2M EDTA溶液 22ml

Triton X-100 2.6g；

所述结合缓冲液A的pH为7.2～7.6，优选为7.4。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述洗涤缓冲液B包含如下成分：

硫氰酸胍 120g

0.1MTris盐酸 100ml

所述洗涤缓冲液B的pH为6.2～6.6，优选为6.4。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述选择性洗涤缓冲液C是由缓冲液B与5mol/L NaCl溶液以1:3v/v的比例混合而成。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述洗涤缓冲液D为含10mM NaCl的70％乙醇溶液。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述洗脱缓冲液E包含如下成分：

0.001mol/LTris-盐酸

0.0001mol/L EDTA

其余为水。