CN114350652A - 血液游离dna提取试剂盒及核酸提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸提取技术领域，具体来说是一种血液游离DNA提取试剂盒及核酸提取方法，包括第一漂洗液，第二漂洗液，洗脱液，还包括裂解液：异硫氰酸胍溶液、Tris‑HCl缓冲液、乙二胺四乙酸缓冲液、异丙醇溶液、十二烷基硫酸钠缓冲液、曲拉通X‑100、氯化钠溶液；蛋白酶K缓冲液：氯化钙溶液、甘油溶液、海藻糖溶液、Trizma Base缓冲液、Proclin‑300；使用前，向所述蛋白酶K缓冲液中溶解蛋白酶K，浓度在10‑40mg/mL。改良后的裂解液和蛋白酶K缓冲液结合，能够得到纯度更高的DNA；提取过程采用磁珠法，能够更高效快捷地得到高纯度cfDNA，且产量显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，具体来说是一种血液游离DNA提取试剂盒及核酸提取方法。
背景技术
血液游离DNA(cell free DNA，cfDNA)是循环体液中游离于细胞外的高度片段化DNA，主要由凋亡、坏死或正常的细胞主动或被动裂解后释放的，在健康人群的血浆中含量较少，健康的人群cfDNA的浓度在几纳克每毫升到几十纳克每毫升，片段也较短。肿瘤患者因核酸酶活性降低，导致cfDNA的清除率下降，故肿瘤患者血浆中cfDNA一般呈高水平表达状态。研究发现，cfDNA可携带相关细胞来源的遗传信息，能够在一定程度上反映实体肿瘤组织中的基因突发图谱频率，有利于肿瘤的早期诊断、疗效评价及复发转移诊断。此外，cfDNA半衰期较短，与常规的血清肿瘤标志物相比，更有利于肿瘤的实时动态监测。本发明可以提取血液游离DNA，使用磁珠法可以使提取效率大大提高，也使获得率有很大提升。
公布号为CN105602938A的中国发明专利公开了一种改良的血浆cfDNA的提取方法，该发明公布了，全血中分离血浆、裂解、过柱结合、洗涤和洗脱，其中在从全血中分离血浆之前先用福尔马林处理全血，在裂解过程中加大裂解液的用量，并在洗脱之后进一步通过磁珠进行纯化。该发明的方法可以从更少的血浆中提取cfDNA，同时可以得到纯度更高的cfDNA。但是裂解过程中加入的过量裂解液，后期需要除去，增加操作步骤，造成试剂浪费。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种高效便捷地从血液中提取高纯度游离DNA的试剂盒和方法。
为了实现上述目的，设计一种血液游离DNA提取试剂盒，包括第一漂洗液，第二漂洗液，洗脱液，还包括：裂解液，1M-6M异硫氰酸胍溶液、10mM-1M pH6.0-7.2的Tris-HCl缓冲液、1mM-100mM乙二胺四乙酸缓冲液、体积比为10％-30％的异丙醇溶液、质量体积比为0.05％-0.2％的十二烷基硫酸钠缓冲液、体积比1％-10％的曲拉通X-100、0.5M-1M的氯化钠溶液；蛋白酶K缓冲液，包括：1mM-10mM的氯化钙溶液、体积比为30％-60％的甘油溶液、1mM-100mM的海藻糖溶液、1mM-100mM的Trizma Base缓冲液、体积比为0.01％-1％的Proclin-300；使用前，向所述蛋白酶K缓冲液中溶解蛋白酶K，浓度在10-40mg/mL。
优选地，所述第一漂洗液包括：1M-6M异硫氰酸胍溶液，10mM-1M pH6.0-7.2的Tris-HCl缓冲液，1mM-100mM乙二胺四乙酸缓冲液，体积比10％-30％的异丙醇溶液。
优选地，所述第二漂洗液包括：1mM-100mM的Trizma Base缓冲液，使用前向所述第二漂洗液中添加1-10倍体积的无水乙醇。
优选地，所述洗脱液包括：0.01mM-10mM乙二胺四乙酸缓冲液，1mM-100mM的TrizmaBase缓冲液。
本发明还设计一种核酸提取方法，方法具体如下：
(1)在血清或血浆样品中加入裂解液和蛋白酶K缓冲液，振荡混匀，56-70℃水浴30-60min，其间每10-15min涡旋混匀数次；
(2)将离心管取出，加入无水乙醇和磁珠，颠倒混匀数次，期间静置数秒后继续颠倒混匀，将离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液；
(3)将离心管从磁力架上取下，加入第一漂洗液，颠倒混匀数次，期间静置数秒后继续颠倒混匀，将离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液；
(4)将离心管从磁力架上取下，加入第二漂洗液，颠倒混匀数次，期间静置数秒后继续颠倒混匀，将离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液；
(5)重复步骤(4)一次；
(6)将离心管从磁力架上取下，室温下开盖静置晾干，加入50-100μL洗脱液，置于水浴锅中，56-70℃水浴5-10min；
(7)将离心管置于磁力架上，磁分离，小心吸取上清至新的离心管中，进行下游实验或-20℃保存备用。
本发明同现有技术相比，其优点在于：
1.改良后的裂解液和蛋白酶K缓冲液结合，能够得到纯度更高的DNA；
2.采用磁珠法，能够更高效快捷地得到高纯度cfDNA，且产量显著提高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)取300μL血清或者血浆加入1.5mL离心管中，加入300μL裂解液和20μL蛋白酶K缓冲液，振荡混匀，56-70℃水浴30-60min，其间每10-15min涡旋混匀数次。
(2)取出离心管，加入300μL无水乙醇和20μL磁珠，颠倒混匀数次，期间静置数秒后继续颠倒混匀，将离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液。
(3)将离心管从磁力架上取下，加入500μL第一漂洗液，颠倒混匀数次，期间静置数秒后继续颠倒混匀，将离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液。
(4)将离心管从磁力架上取下，加入500μL第二漂洗液，颠倒混匀数次，期间静置数秒后继续颠倒混匀，将离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液。
(5)重复步骤(4)一次。.
(6)将离心管从磁力架上取下，室温下开盖静置5-10min晾干。
(7)加入50-100μL洗脱液，置于水浴锅中，56-70℃水浴5-10min。
(8)将离心管置于磁力架，磁分离，小心吸取上清至新的离心管中，进行下游实验或-20℃保存备用。
对比例1
(1)取血清或者血浆300μL加入1.5mL离心管中，加入300μL裂解液和20μL蛋白酶K缓冲液，振荡混匀，56-70℃水浴30-60min，其间每10-15min涡旋混匀数次。
(2)取出离心管，将离心管内溶液吸入过滤柱中，12000rpm离心3min。
(3)将收集管中的溶液吸取到新的1.5mL离心管中，加入300μL无水乙醇，彻底混匀。
(4)向吸附柱中加入350μL第一漂洗液，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
(5)向吸附柱中加入500μL第二漂洗液(使用前先加入乙醇)，室温静置1-2min，12000rpm(～13400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
(6)重复步骤(5)一次。
(7)12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液。
(8)将吸附柱转入一个新的DNase-Free离心管中，加入30-50μL DNase-FreeddH2O室温放置2min，12000rpm离心2min，得到DNA溶液。
采用赛默飞的Qubit 4荧光计测定仪测定实施例1和对比例1的核酸浓度，A260表示核酸在波长为260nm下的吸光值，实验结果如下所示：
表1不同实施例所提取的核酸的浓度和纯度测定结果
实施例1采取了磁珠法提取血液游离DNA，对比例1采取了离心柱法提取血液游离DNA,从二者的对比数据可知，在相同试验样本量下，磁珠法可以提取到更多的游离DNA。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种血液游离DNA提取试剂盒，包括第一漂洗液，第二漂洗液，洗脱液，其特征在于，还包括
裂解液：1M-6M异硫氰酸胍溶液、10mM-1M pH6.0-7.2的Tris-HCl缓冲液、1mM-100mM乙二胺四乙酸缓冲液、体积比为10%-30%的异丙醇溶液、质量体积比为0.05%-0.2%的十二烷基硫酸钠缓冲液、体积比1%-10%的曲拉通X-100、0.5M-1M的氯化钠溶液；
蛋白酶K缓冲液：1mM-10mM的氯化钙溶液、体积比为30%-60%的甘油溶液、1mM-100mM的海藻糖溶液、1mM-100mM的Trizma Base 缓冲液、体积比为0.01%-1%的Proclin-300；使用前，向所述蛋白酶K缓冲液中溶解蛋白酶K，浓度在10-40mg/mL。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述第一漂洗液，包括：1M-6M异硫氰酸胍溶液，10mM-1M pH6.0-7.2的Tris-HCl缓冲液，1mM-100mM乙二胺四乙酸缓冲液，体积比10%-30%的异丙醇溶液。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述第二漂洗液，包括：1mM-100mM的Trizma Base缓冲液，使用前向所述第二漂洗液中添加1-10倍体积的无水乙醇。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述洗脱液，包括：0.01mM-10mM乙二胺四乙酸缓冲液，1mM-100mM的Trizma Base缓冲液。
5.一种采用如权利要求1所述血液游离DNA提取试剂盒的核酸提取方法，其特征在于，方法具体如下：
S1. 在血清或血浆样品中加入裂解液和蛋白酶K缓冲液，振荡混匀，56-70℃水浴30-60min，其间每10-15min涡旋混匀数次；
S2. 将离心管取出，加入无水乙醇和磁珠，颠倒混匀数次，期间静置数秒后继续颠倒混匀，将离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液；
S3. 将离心管从磁力架上取下，加入第一漂洗液，颠倒混匀数次，期间静置数秒后继续颠倒混匀，将离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液；
S4. 将离心管从磁力架上取下，加入第二漂洗液，颠倒混匀数次，期间静置数秒后继续颠倒混匀，将离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液；
S5. 重复步骤S4一次；
S6. 将离心管从磁力架上取下，室温下开盖静置晾干，加50-100μL入洗脱液，置于水浴锅中，56-70℃水浴5-10min；
S7. 将离心管置于磁力架上，磁分离，小心吸取上清至新的离心管中，进行下游实验或-20℃保存备用。
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