CN114350652A - 血液游离dna提取试剂盒及核酸提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及核酸提取技术领域,具体来说是一种血液游离DNA提取试剂盒及核酸提取方法,包括第一漂洗液,第二漂洗液,洗脱液,还包括裂解液:异硫氰酸胍溶液、Tris‑HCl缓冲液、乙二胺四乙酸缓冲液、异丙醇溶液、十二烷基硫酸钠缓冲液、曲拉通X‑100、氯化钠溶液;蛋白酶K缓冲液:氯化钙溶液、甘油溶液、海藻糖溶液、Trizma Base缓冲液、Proclin‑300;使用前,向所述蛋白酶K缓冲液中溶解蛋白酶K,浓度在10‑40mg/mL。改良后的裂解液和蛋白酶K缓冲液结合,能够得到纯度更高的DNA;提取过程采用磁珠法,能够更高效快捷地得到高纯度cfDNA,且产量显著提高。

Description

血液游离DNA提取试剂盒及核酸提取方法
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域,具体来说是一种血液游离DNA提取试剂盒及核酸提取方法。
背景技术
血液游离DNA(cell free DNA,cfDNA)是循环体液中游离于细胞外的高度片段化DNA,主要由凋亡、坏死或正常的细胞主动或被动裂解后释放的,在健康人群的血浆中含量较少,健康的人群cfDNA的浓度在几纳克每毫升到几十纳克每毫升,片段也较短。肿瘤患者因核酸酶活性降低,导致cfDNA的清除率下降,故肿瘤患者血浆中cfDNA一般呈高水平表达状态。研究发现,cfDNA可携带相关细胞来源的遗传信息,能够在一定程度上反映实体肿瘤组织中的基因突发图谱频率,有利于肿瘤的早期诊断、疗效评价及复发转移诊断。此外,cfDNA半衰期较短,与常规的血清肿瘤标志物相比,更有利于肿瘤的实时动态监测。本发明可以提取血液游离DNA,使用磁珠法可以使提取效率大大提高,也使获得率有很大提升。
公布号为CN105602938A的中国发明专利公开了一种改良的血浆cfDNA的提取方法,该发明公布了,全血中分离血浆、裂解、过柱结合、洗涤和洗脱,其中在从全血中分离血浆之前先用福尔马林处理全血,在裂解过程中加大裂解液的用量,并在洗脱之后进一步通过磁珠进行纯化。该发明的方法可以从更少的血浆中提取cfDNA,同时可以得到纯度更高的cfDNA。但是裂解过程中加入的过量裂解液,后期需要除去,增加操作步骤,造成试剂浪费。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足,提供一种高效便捷地从血液中提取高纯度游离DNA的试剂盒和方法。
为了实现上述目的,设计一种血液游离DNA提取试剂盒,包括第一漂洗液,第二漂洗液,洗脱液,还包括:裂解液,1M-6M异硫氰酸胍溶液、10mM-1M pH6.0-7.2的Tris-HCl缓冲液、1mM-100mM乙二胺四乙酸缓冲液、体积比为10%-30%的异丙醇溶液、质量体积比为0.05%-0.2%的十二烷基硫酸钠缓冲液、体积比1%-10%的曲拉通X-100、0.5M-1M的氯化钠溶液;蛋白酶K缓冲液,包括:1mM-10mM的氯化钙溶液、体积比为30%-60%的甘油溶液、1mM-100mM的海藻糖溶液、1mM-100mM的Trizma Base缓冲液、体积比为0.01%-1%的Proclin-300;使用前,向所述蛋白酶K缓冲液中溶解蛋白酶K,浓度在10-40mg/mL。
优选地,所述第一漂洗液包括:1M-6M异硫氰酸胍溶液,10mM-1M pH6.0-7.2的Tris-HCl缓冲液,1mM-100mM乙二胺四乙酸缓冲液,体积比10%-30%的异丙醇溶液。
优选地,所述第二漂洗液包括:1mM-100mM的Trizma Base缓冲液,使用前向所述第二漂洗液中添加1-10倍体积的无水乙醇。
优选地,所述洗脱液包括:0.01mM-10mM乙二胺四乙酸缓冲液,1mM-100mM的TrizmaBase缓冲液。
本发明还设计一种核酸提取方法,方法具体如下:
(1)在血清或血浆样品中加入裂解液和蛋白酶K缓冲液,振荡混匀,56-70℃水浴30-60min,其间每10-15min涡旋混匀数次;
(2)将离心管取出,加入无水乙醇和磁珠,颠倒混匀数次,期间静置数秒后继续颠倒混匀,将离心管置于磁力架上,磁分离,吸弃废液;
(3)将离心管从磁力架上取下,加入第一漂洗液,颠倒混匀数次,期间静置数秒后继续颠倒混匀,将离心管置于磁力架上,磁分离,吸弃废液;
(4)将离心管从磁力架上取下,加入第二漂洗液,颠倒混匀数次,期间静置数秒后继续颠倒混匀,将离心管置于磁力架上,磁分离,吸弃废液;
(5)重复步骤(4)一次;
(6)将离心管从磁力架上取下,室温下开盖静置晾干,加入50-100μL洗脱液,置于水浴锅中,56-70℃水浴5-10min;
(7)将离心管置于磁力架上,磁分离,小心吸取上清至新的离心管中,进行下游实验或-20℃保存备用。
本发明同现有技术相比,其优点在于:
1.改良后的裂解液和蛋白酶K缓冲液结合,能够得到纯度更高的DNA;
2.采用磁珠法,能够更高效快捷地得到高纯度cfDNA,且产量显著提高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)取300μL血清或者血浆加入1.5mL离心管中,加入300μL裂解液和20μL蛋白酶K缓冲液,振荡混匀,56-70℃水浴30-60min,其间每10-15min涡旋混匀数次。
(2)取出离心管,加入300μL无水乙醇和20μL磁珠,颠倒混匀数次,期间静置数秒后继续颠倒混匀,将离心管置于磁力架上,磁分离,吸弃废液。
(3)将离心管从磁力架上取下,加入500μL第一漂洗液,颠倒混匀数次,期间静置数秒后继续颠倒混匀,将离心管置于磁力架上,磁分离,吸弃废液。
(4)将离心管从磁力架上取下,加入500μL第二漂洗液,颠倒混匀数次,期间静置数秒后继续颠倒混匀,将离心管置于磁力架上,磁分离,吸弃废液。
(5)重复步骤(4)一次。.
(6)将离心管从磁力架上取下,室温下开盖静置5-10min晾干。
(7)加入50-100μL洗脱液,置于水浴锅中,56-70℃水浴5-10min。
(8)将离心管置于磁力架,磁分离,小心吸取上清至新的离心管中,进行下游实验或-20℃保存备用。
对比例1
(1)取血清或者血浆300μL加入1.5mL离心管中,加入300μL裂解液和20μL蛋白酶K缓冲液,振荡混匀,56-70℃水浴30-60min,其间每10-15min涡旋混匀数次。
(2)取出离心管,将离心管内溶液吸入过滤柱中,12000rpm离心3min。
(3)将收集管中的溶液吸取到新的1.5mL离心管中,加入300μL无水乙醇,彻底混匀。
(4)向吸附柱中加入350μL第一漂洗液,12000rpm离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。
(5)向吸附柱中加入500μL第二漂洗液(使用前先加入乙醇),室温静置1-2min,12000rpm(~13400×g)离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。
(6)重复步骤(5)一次。
(7)12000rpm离心2min,倒掉废液,将吸附柱置于室温放置数分钟,彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液。
(8)将吸附柱转入一个新的DNase-Free离心管中,加入30-50μL DNase-FreeddH2O室温放置2min,12000rpm离心2min,得到DNA溶液。
采用赛默飞的Qubit 4荧光计测定仪测定实施例1和对比例1的核酸浓度,A260表示核酸在波长为260nm下的吸光值,实验结果如下所示:
表1不同实施例所提取的核酸的浓度和纯度测定结果
Figure BDA0003428243550000031
Figure BDA0003428243550000041
实施例1采取了磁珠法提取血液游离DNA,对比例1采取了离心柱法提取血液游离DNA,从二者的对比数据可知,在相同试验样本量下,磁珠法可以提取到更多的游离DNA。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种血液游离DNA提取试剂盒,包括第一漂洗液,第二漂洗液,洗脱液,其特征在于,还包括
裂解液:1M-6M异硫氰酸胍溶液、10mM-1M pH6.0-7.2的Tris-HCl缓冲液、1mM-100mM乙二胺四乙酸缓冲液、体积比为10%-30%的异丙醇溶液、质量体积比为0.05%-0.2%的十二烷基硫酸钠缓冲液、体积比1%-10%的曲拉通X-100、0.5M-1M的氯化钠溶液;
蛋白酶K缓冲液:1mM-10mM的氯化钙溶液、体积比为30%-60%的甘油溶液、1mM-100mM的海藻糖溶液、1mM-100mM的Trizma Base 缓冲液、体积比为0.01%-1%的Proclin-300;使用前,向所述蛋白酶K缓冲液中溶解蛋白酶K,浓度在10-40mg/mL。
2.根据权利要求1所述试剂盒,其特征在于,所述第一漂洗液,包括:1M-6M异硫氰酸胍溶液,10mM-1M pH6.0-7.2的Tris-HCl缓冲液,1mM-100mM乙二胺四乙酸缓冲液,体积比10%-30%的异丙醇溶液。
3.根据权利要求1所述试剂盒,其特征在于,所述第二漂洗液,包括:1mM-100mM的Trizma Base缓冲液,使用前向所述第二漂洗液中添加1-10倍体积的无水乙醇。
4.根据权利要求1所述试剂盒,其特征在于,所述洗脱液,包括:0.01mM-10mM乙二胺四乙酸缓冲液,1mM-100mM的Trizma Base缓冲液。
5.一种采用如权利要求1所述血液游离DNA提取试剂盒的核酸提取方法,其特征在于,方法具体如下:
S1. 在血清或血浆样品中加入裂解液和蛋白酶K缓冲液,振荡混匀,56-70℃水浴30-60min,其间每10-15min涡旋混匀数次;
S2. 将离心管取出,加入无水乙醇和磁珠,颠倒混匀数次,期间静置数秒后继续颠倒混匀,将离心管置于磁力架上,磁分离,吸弃废液;
S3. 将离心管从磁力架上取下,加入第一漂洗液,颠倒混匀数次,期间静置数秒后继续颠倒混匀,将离心管置于磁力架上,磁分离,吸弃废液;
S4. 将离心管从磁力架上取下,加入第二漂洗液,颠倒混匀数次,期间静置数秒后继续颠倒混匀,将离心管置于磁力架上,磁分离,吸弃废液;
S5. 重复步骤S4一次;
S6. 将离心管从磁力架上取下,室温下开盖静置晾干,加50-100μL入洗脱液,置于水浴锅中,56-70℃水浴5-10min;
S7. 将离心管置于磁力架上,磁分离,小心吸取上清至新的离心管中,进行下游实验或-20℃保存备用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114958825A (zh) * 2022-04-07 2022-08-30 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 一种差异化富集小片段核酸分子的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060188892A1 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Ambion, Inc. Enzymatic digestion of tissue
CN101023171A (zh) * 2004-08-02 2007-08-22 根特拉体系股份有限公司 采用固相支持物纯化dna的制剂和方法
CN104250642A (zh) * 2014-04-30 2014-12-31 厦门安普利生物工程有限公司 一种提取纯化m-mlv逆转录酶的方法
CN107663521A (zh) * 2016-07-28 2018-02-06 深圳华大基因股份有限公司 血浆游离核酸提取试剂盒及其应用
CN109207476A (zh) * 2018-10-26 2019-01-15 王煜 一种尿液游离dna提取试剂盒及提取方法
US20190300873A1 (en) * 2015-12-28 2019-10-03 Koninklijke Philips N.V. Nucleic acid purification system using a single wash and elution buffer solution
CN113694189A (zh) * 2021-08-17 2021-11-26 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 一种蛋白酶k的冷冻干燥保护剂及制备方法
CN114350649A (zh) * 2021-12-02 2022-04-15 力因精准医疗产品(上海)有限公司 一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101023171A (zh) * 2004-08-02 2007-08-22 根特拉体系股份有限公司 采用固相支持物纯化dna的制剂和方法
US20060188892A1 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Ambion, Inc. Enzymatic digestion of tissue
CN104250642A (zh) * 2014-04-30 2014-12-31 厦门安普利生物工程有限公司 一种提取纯化m-mlv逆转录酶的方法
US20190300873A1 (en) * 2015-12-28 2019-10-03 Koninklijke Philips N.V. Nucleic acid purification system using a single wash and elution buffer solution
CN107663521A (zh) * 2016-07-28 2018-02-06 深圳华大基因股份有限公司 血浆游离核酸提取试剂盒及其应用
CN109207476A (zh) * 2018-10-26 2019-01-15 王煜 一种尿液游离dna提取试剂盒及提取方法
CN113694189A (zh) * 2021-08-17 2021-11-26 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 一种蛋白酶k的冷冻干燥保护剂及制备方法
CN114350649A (zh) * 2021-12-02 2022-04-15 力因精准医疗产品(上海)有限公司 一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114958825A (zh) * 2022-04-07 2022-08-30 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 一种差异化富集小片段核酸分子的方法

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