CN106011131A - 一种从血浆中分离游离核酸的方法 - Google Patents

一种从血浆中分离游离核酸的方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种从血浆中分离游离核酸的方法,该方法使用二氧化硅基质膜离心柱分离纯化游离核酸。与现有技术相比，本申请所述的血浆中分离游离核酸的方法，达到了如下效果：1、本发明的使用二氧化硅基质膜吸附柱从血浆样品中分离游离核酸的方法，可以同时将血浆样本，裂解缓冲液，Proteinase K和Acryl Carrier混合后进行吸附柱过滤，不仅简单快速，同时进行小体积洗脱，浓缩核酸。2、使用本发明提取核酸，无需有机提取，完全去除污染物和抑制剂使用既可以保证核酸的纯度，大大简化了从血浆中浓缩和纯化游离DNA和RNA的过程。

Description

一种从血浆中分离游离核酸的方法
技术领域
本发明属于核酸纯化领域，具体涉及一种从血浆样品中分离游离核酸的方法。
背景技术
从1948年Mandel和MetaiS首次报道游离核酸至今，游离核酸已有近70年的研究历史，因当时核酸是否是遗传物质没有定论，而没有引起人们的广泛关注。1970年，欧洲学者首次报道肿瘤病人的血浆或血浆中存在游离DNA，其含量为健康人群的10倍左右，其为双链DNA分子，长度基本在500bp以下，大部分以核小体形式存在。大量研究证明，游离DNA与肿瘤基因组DNA具有相同的遗传变异，例如，基因突变、基因启动子甲基化等，因此，游离核酸可被用于一种预测肿瘤发生的新型标记物。1997年，Lo等首次证明孕妇外周血存在胎儿游离DNA，为非创伤产前诊断开辟了一条新途径。存在于血浆或血清中来源于肿瘤细胞的游离DNA主要来源于：肿瘤细胞的凋亡、坏死释放到血液中和肿瘤细胞的转移、增殖释放到血液中。
近年来，游离DNA研究成为基因组分子诊断研究的一个热门领域，首先其可作为一种无创诊断方法，可以随时采集患者样本进行相关检测分析。其次，其可作为一类新型生物标志物，因其具有与肿瘤细胞基因组相同的遗传变异，具有显著的特异性，可以对肿瘤进行分型及早期筛查。因此，循环游离DNA的检测在临床诊断上具有非常重要的应用价值，如癌症早期筛查、肿瘤复发、疗效监控等。游离DNA研究的主要障碍为：游离DNA的分离纯化和高灵敏度检测。因游离DNA在血液中的含量低，且片段长度短，为游离DNA研究带来比较大的困难。
目前核酸提取方法主要有酚氯仿抽提、磁珠法和离心柱法。酚氯仿抽提因大量使用有毒溶剂，对操作者健康有一定危险。磁珠法提取核酸技术，其采用磁性纳米颗粒，利用在高盐低pH下吸附核酸，然后在低盐高pH下分离核酸的原理进行样本核酸的分离纯化，但因其操作过于复杂，并且需要一定温度下使用Proteinase K进行孵育，同时需要多步洗涤等步骤，导致核酸提取的重复性差及提取效率低。离心柱法因其该方法简单快速，无需有机提取，高效回收DNA和RNA碎片，能有效的去除样本中的各种PCR抑制物，纯化效率高、重现性好、产量高。
发明内容
本申请解决的主要问题是提供一种血浆中分离游离核酸的方法，以解决无法实现的能有效的去除样本中的各种PCR抑制物，纯化效率高、重现性好、产量高的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种从血浆中分离游离核酸的方法,其特征在于，包括如下步骤：
1)向血浆样本中加入裂解缓冲液、Proteinase K、Acryl Carrier，混匀；
2)向步骤1)的得到的混合液中加二氧化硅基质膜离心柱，离心，弃废液，将离心柱放回收集管中；
3)向步骤2)所得的离心柱中加入Wash BufferⅠ,离心，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
4)向步骤3)所得的离心柱中加入Wash BufferⅡ,离心，弃废液，晾干离心柱，将离心柱放回收集管中；所述Wash BufferⅡ为CH3(CH2)nOH,n＝0-3；
5)向步骤4)所得离心柱加入洗脱缓冲液，室温放置2-5min，离心，收集洗脱液，所得洗脱液即为分离的游离核酸，所述洗脱缓冲液包含三羟甲基氨基甲烷、EDTA。
进一步地，所述Wash BufferⅠ的制造方法为：称取或量取三羟甲基氨基甲烷盐酸盐5.731g或三羟甲基氨基甲烷4.405g，乙二胺四乙酸二钠[EDTA-2Na]1.353g或乙二胺四乙酸1.062g，将上述各组分混合，加去离子水，调节PH至7.0，定容为1000mL。
进一步地，所述裂解液的制造方法为：称取或量取异硫氰酸胍423.73g或盐酸胍342.58g，三羟甲基氨基甲烷5.13g或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐6.67g，氯化钠0.932g，吐温-20 6.78mL或曲拉通X-100 16.24mL，将上述各组分混合,加去离子水,调节PH为6.5，定容至1000mL。
进一步地，所述CH3(CH2)nOH,n＝0-3，n＝1，即CH3CH2OH。
进一步地，所述CH3CH2OH为无水乙醇，所述Wash BufferⅡ的制造方法为，量取无水乙醇700mL，加去离子水稀释至体积为1000mL。
进一步地，所述洗脱缓冲液的制造方法为：称取或量取三羟甲基氨基甲烷1.211g，10mM EDTA100mL，将上述混合，加去离子水，调节PH为8.0，定容至使1000mL。
进一步地，在进行所述步骤5)前，重复步骤4)，并将重复步骤4)后得到的离心柱离心，12000rpm离心2min，倒掉废液，然后将吸附柱置于室温2-5min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
进一步地，所述步骤5)的离心柱加入洗脱缓冲液时，所述加洗脱缓冲液方式为：从所述离心柱中间位置悬空滴加。
进一步地，所述步骤2)、3)、4)中离心的操作为：12000rpm离心1min；所述步骤5)中离心的的操作为：12000rpm离心2min。
进一步地，实施所述步骤5)时使用的所述洗脱缓冲液在50-70℃环境下孵育。
与现有技术相比，本申请所述的血浆中分离游离核酸的方法，达到了如下效果：
1、本发明的使用二氧化硅基质膜吸附柱从血浆样品中分离游离核酸的方法，可以同时将血浆样本，裂解缓冲液，Proteinase K和Acryl Carrier混合后进行吸附柱过滤，不仅简单快速，同时进行小体积洗脱，浓缩核酸。
2、使用本发明提取核酸，无需有机提取，完全去除污染物和抑制剂使用既可以保证核酸的纯度，大大简化了从血浆中浓缩和纯化游离DNA和RNA的过程。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明实施例2所述的荧光PCR检测的扩增曲线图；
图2是本发明实施例2所述的核酸分子量测定的结果图；
图3是本发明实施例2所述的核酸分子量测定的结果图。
具体实施方式
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
以下结合附图对本申请作进一步详细说明，但不作为对本申请的限定。下文为了叙述方便，下文中所称的“左”“右”“上”“下”等与附图本身左、右、上、下等方向一致，“前端”、“后端”或“末端”等相对于附图为前或后。
实施例1
本实施例1提供一种从血浆样品中分离游离核酸的方法，包括如下实施步骤：
(1)取1.5mL无核酸酶的离心管中加入200-500μL血浆样本和300-500μL裂解缓冲液,得到混合液；
(2)向离心管的混合液中加入20-30μL Proteinase K、8-10μL Acryl Carrier,充分混匀，室温下上下颠倒混匀10min；
(3)将颠倒混匀后所的溶液添加二氧化硅基质膜离心柱(离心柱放入收集管中)，12000rpm离心1min，弃废液，将离心柱放回收集管中；
(4)向步骤(3)的吸附柱中，加入500-600μL Wash BufferⅠ,12000rpm离心1min，弃废液，将离心柱放回收集管中；
(5)向步骤(4)的吸附柱加入600-700μL Wash BufferⅡ,12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱置于室温2-5min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；所述Wash BufferⅡ为CH3(CH2)nOH,n＝0-3；
(6)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-100μL洗脱缓冲液，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，所得洗脱液即为分离的游离核酸。所述洗脱缓冲液包含三羟甲基氨基甲烷、EDTA。
优选地，在实施步骤(6)前最好重复步骤(5)，并将重复步骤(5)后得到的离心柱离心，12000rpm离心2min，倒掉废液，然后将吸附柱置于室温2-5min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
优选地，实施步骤(5)时，最好离心柱加入洗脱缓冲液时，所述加洗脱缓冲液方式为：从所述离心柱中间位置悬空滴加。
优选地，Wash BufferⅠ的制造方法为：称取或量取三羟甲基氨基甲烷盐酸盐5.731g，乙二胺四乙酸二钠[EDTA-2Na]1.353g，将上述各组分混合，加去离子水，调节PH至7.0，定容为1000mL。优选使用前添加1000mL乙醇。
上述Wash BufferⅠ配制成分三羟甲基氨基甲烷盐酸盐可替换成可替换成相同摩尔量的三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸二钠可替换成可替换成相同摩尔量的乙二胺四乙酸。
具体的：Wash BufferⅠ的制造方法为：称取或量取三羟甲基氨基甲烷盐酸盐5.731g或三羟甲基氨基甲烷4.405g，乙二胺四乙酸二钠[EDTA-2Na]1.353g或乙二胺四乙酸1.062g，将上述各组分混合，加去离子水，调节PH至7.0，定容为1000mL。
优选地，所述裂解液的制造方法为：称取或量取异硫氰酸胍423.73g，三羟甲基氨基甲烷5.13g，氯化钠0.932g，吐温-20 100 6.78mL，将上述各组分混合,加去离子水,调节PH为6.5，定容至1000mL。优选使用前添加500mL异丙醇。使用前添加500mL异丙醇。
此外，关于裂解液配制成分中异硫氰酸胍可替换成相同摩尔量的盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷可替换成相同摩尔量的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、吐温-20可替换成相同摩尔量的曲拉通100。
具体的：称取或量取异硫氰酸胍423.73g或盐酸胍342.58g，三羟甲基氨基甲烷5.13g或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐6.67g，氯化钠0.932g，吐温-206.78mL或曲拉通X-10016.24mL，将上述各组分混合,加去离子水,调节PH为6.5，定容至1000mL。
优选地，所述Wash BufferⅡ为低级醇与去离子水的混合溶液，所述低级醇为含有4个碳以下的饱和醇；
优选地，所述低级醇的化学通式为：CH3(CH2)nOH,n＝0-3；优选n＝1,即乙醇为最优方案。
优选的，所述Wash BufferⅡ的制造方法为，量取无水乙醇700mL，加去离子水稀释至体积为1000mL。
优选地，所述洗脱缓冲液的制造方法为：称取或量取三羟甲基氨基甲烷1.211g，10mM EDTA100mL，将上述混合，加去离子水，调节PH为8.0，定容至使1000mL。在洗脱过程可在50-70℃范围内环境下孵育以获得跟好的洗脱效果。
本实施例使用的离心吸附柱采用二氧化硅基质膜作为核酸的特异性吸附材料，最大程度的吸附核酸分子。
实施例2
本实施例2提供一种从500μL血浆样本中提取游离核酸的实施方案。
1、试剂准备
1)裂解缓冲液：
裂解缓冲液各组分含量为：
异硫氰酸胍[Guanidine thiocyanate] 423.73g
三羟甲基氨基甲烷[Tris] 5.13g
氯化钠0.932g
吐温-20[Tween-20] 6.78mL
将上述各组分称重或量取后混合，加去离子水，调节PH为6.5，定容至1000mL。
使用前添加500mL异丙醇。
2)离心吸附柱：二氧化硅基质膜。
3)Wash BufferⅠ：
Wash BufferⅠ的各组分含量为：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 5.731g
乙二胺四乙酸二钠[EDTA-2Na] 1.353g
将上述各组分称重或量取后混合，加去离子水，调节PH为7.0，定容至1000mL。
使用前添加1000mL乙醇。
4)Wash BufferⅡ：
Wash BufferⅡ的各组分含量为：
无水乙醇700mL
将上述各组分称重或量取后混合，加去离子水，使混合液体积为1000mL。
5)洗脱缓冲液
洗脱缓冲液的组成为：
三羟甲基氨基甲烷[Tris] 1.211g
10mM EDTA 100mL
将上述各组分称重后混合，加去离子水，调节PH至8.0，定容至1000mL。
2.采用实施例1所述的方法从血浆样品中分离游离核酸
(1)取1.5mL无核酸酶的离心管中加入500μL血浆样本和500μL裂解缓冲液，得到混合液；
(2)向离心管的混合液中加入20μL Proteinase K、8μL Acryl Carrier，充分混匀，室温下上下颠倒混匀10min；
(3)将颠倒混匀后所的溶液添加硅基质膜离心柱(离心柱放入收集管中)，12000rpm离心1min，弃废液，将离心柱放回收集管中；
(4)向步骤(3)的离心柱中，加入500μL Wash BufferⅠ,12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
(5)向步骤(4)的吸附柱加入700μL Wash BufferⅡ,12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
(6)重复步骤(5)
(7)将步骤(6)中的离心柱离心，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温2-5min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(8)将离心柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL洗脱缓冲液，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，所得洗脱液即为分离的游离核酸。
3.结果分析
1)荧光PCR检测
取分离的游离核酸2μL作为模板,进行荧光定量PCR检测。检测结果见图1(扩增曲线)和表1(Ct值)。扩增曲线的含义是：PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光闽值时所经历的循环数。即Ct值越小说明起始游离核酸含量越高。
表1
2)Qubit(Qubit 3.0Fluorometer)核酸浓度测定
取分离的游离核酸1μL进行Qubit(Qubit 3.0Fluorometer)核酸浓度测定，测定结果表2。
表2
3)核酸分子量测定
取2个样本的分离的游离核酸在安捷伦4200进行分子量检测，检测结果，如图2-图3所示。
结论：本发明提供的方法可以有效地从血浆中分离游离核苷酸。
与现有技术相比，本申请所述的血浆中分离游离核酸的方法，达到了如下效果：
1、本发明的使用二氧化硅基质膜吸附柱从血浆样品中分离游离核酸的方法，可以同时将血浆样本，裂解缓冲液，Proteinase K和Acryl Carrier混合后进行吸附柱过滤，不仅简单快速，同时进行小体积洗脱，浓缩核酸。
2、使用本发明提取核酸，无需有机提取，完全去除污染物和抑制剂使用既可以保证核酸的纯度，大大简化了从血浆中浓缩和纯化游离DNA和RNA的过程。
由于方法部分已经对本申请实施例进行了详细描述，这里对实施例中涉及的系统与方法对应部分的展开描述省略，不再赘述。对于系统中具体内容的描述可参考方法实施例的内容，这里不再具体限定。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种从血浆中分离游离核酸的方法,其特征在于，包括如下步骤：
1)向血浆样本中加入裂解缓冲液、Proteinase K、Acryl Carrier，混匀；
2)向步骤1)的得到的混合液中加二氧化硅基质膜离心柱，离心，弃废液，将离心柱放回收集管中；
3)向步骤2)所得的离心柱中加入Wash Buffer Ⅰ,离心，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
4)向步骤3)所得的离心柱中加入Wash Buffer Ⅱ,离心，弃废液，晾干离心柱，将离心柱放回收集管中；所述Wash Buffer Ⅱ为CH3(CH2)nOH,n＝0-3；
5)向步骤4)所得离心柱加入洗脱缓冲液，室温放置2-5min，离心，收集洗脱液，所得洗脱液即为分离的游离核酸，所述洗脱缓冲液包含三羟甲基氨基甲烷、EDTA。
2.根据权利要求1所述的从血浆中分离游离核酸的方法，其特征在于，所述WashBuffer Ⅰ的制造方法为：称取或量取三羟甲基氨基甲烷盐酸盐5.731g或三羟甲基氨基甲烷4.405g，乙二胺四乙酸二钠[EDTA-2Na]1.353g或乙二胺四乙酸1.062g，将上述各组分混合，加去离子水，调节PH至7.0，定容为1000mL。
3.根据权利要求1所述的从血浆中分离游离核酸的方法，其特征在于，所述裂解液的制造方法为：称取或量取异硫氰酸胍423.73g或盐酸胍342.58g，三羟甲基氨基甲烷5.13g或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐6.67g，氯化钠0.932g，吐温-20 6.78mL或曲拉通X-100 16.24mL，将上述各组分混合,加去离子水,调节PH为6.5，定容至1000mL。
4.根据权利要求1所述的从血浆中分离游离核酸的方法，其特征在于，所述CH3(CH2)nOH,n＝0-3，n＝1，即CH3CH2OH。
5.根据权利要求4所述的从血浆中分离游离核酸的方法，其特征在于，所述CH3CH2OH为无水乙醇，所述Wash Buffer Ⅱ的制造方法为，量取无水乙醇700mL，加去离子水稀释至体积为1000mL。
6.根据权利要求1所述的从血浆中分离游离核酸的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液的制造方法为：称取或量取三羟甲基氨基甲烷1.211g，10mM EDTA100mL，将上述混合，加去离子水，调节PH为8.0，定容至使1000mL。
7.根据权利要求1所述的从血浆中分离游离核酸的方法，其特征在于，在进行所述步骤5)前，重复步骤4)，并将重复步骤4)后得到的离心柱离心，12000rpm离心2min，倒掉废液，然后将吸附柱置于室温2-5min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
8.根据权利要求7所述的从血浆中分离游离核酸的方法，其特征在于，所述步骤5)的离心柱加入洗脱缓冲液时，所述加洗脱缓冲液方式为：从所述离心柱中间位置悬空滴加。
9.根据权利要求8所述的从血浆中分离游离核酸的方法，其特征在于，所述步骤2)、3)、4)中离心的操作为：12000rpm离心1min；所述步骤5)中离心的的操作为：12000rpm离心2min。
10.根据权利要求9所述的从血浆中分离游离核酸的方法，其特征在于，实施所述步骤5)时使用的所述洗脱缓冲液在50-70℃环境下孵育。
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