CN106399535A - 一种高通量测序检测无创亲子鉴定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种高通量测序检测无创亲子鉴定的方法，包括以下步骤：提取基因组DNA，包括提取孕妇新鲜血液中的胎儿游离DNA、提取孕妇DNA、提取疑似父亲的DNA；采用含有多个SNP位点的扩增子试剂盒进行PCR扩增，分别对胎儿游离DNA、孕妇DNA、疑似父亲的DNA进行富集；采用文库构建试剂盒对纯化好的多重PCR扩增产物进行文库构建；采用实时荧光定量PCR和Agilent 2100对构建好的文库进行质量控制，为上机测序做准备；测序，采用软件对上机测序结果进行生物信息学分析，鉴定出是否具有亲缘关系。本发明所述方法具有无创性、安全性、通量高、成本低等优点。

Description

一种高通量测序检测无创亲子鉴定的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说是涉及一种高通量测序检测无创亲子鉴定的方法。

背景技术

亲权鉴定是指通过检测与分析一系列多态性遗传标记来判定父母与子女之间是否存在生物学亲缘关系。现代亲权鉴定的方法采用DNA分析，主要是应用第二代遗传标记——短串联重复序列(STR)分型技术，即通过对DNA样品进行15-20个STRs的检测、分型和统计而达到计算出亲权概率的目的，若有3个及以上STR位点不同，可排除亲子关系。然而，在近20年的应用中，人们发现STR分型技术中由于不同等位基因的序列长度相似，区分和判型具有一定的困难，一般每个PCR反应的判型错误率可达1％-5％(Bonin et al.2004；Weller et al.2004)，判型错误会直接影响亲子鉴定的准确性和可重复性。

单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上，特定核苷酸位置上存在两种或两种以上不同的碱基，引起DNA系列的多态性，其中任何一种等位基因在群体中的频率不小于1％，已成为继限制性酶切片段长度多态(RFLP)和STR多态标记后的第三代分子遗传标记。在遗传制图、连锁性分析、疾病基因定位和物种多态性研究等诸多领域中，SNP已经逐渐取代STR，成为首选的遗传标记。

SNP的数量较为庞大，在人类基因组中分布极为广泛，大约每1000个碱基中就存在一个SNP，估计人类基因组中约含有数百万个SNP位点。与STR相比，具有以下优势：(1)其突变率低、扩增片段长度短，不存在着多个核心序列重复、核心序列的非整倍重复等现象，相较于STR更为稳定；(2)对DNA样本的要求更低，适应更多的特殊环境；(3)检测更加廉价，且通量更高；(4)同时，由于SNP为等位基因，一方面使得分析过程更容易自动化，另一方面，其多态信息含量低，需要多个位点联合才能达到个体识别的要求。目前，SNP分型技术在分子诊断、临床检验、法医学、病原检测、遗传疾病研究、指导个体化用药和新药研发等多方面具有极其重要应用价值，已成为众多研究者们广泛关注的焦点。因此，一种操作方便、成本低廉并且高通量的SNP检测技术是当前基因检测的关键所在。

高通量测序，又称“下一代”测序技术或深度测序，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。因其通量高、样本成本低、节省时间等优势已在临床上取得了相应的应用。目前，二代测序在肿瘤诊断、无创产前基因筛查、新生儿遗传病筛选、心血管疾病等遗传性疾病、法医学方面的应用越来越普遍，且发展前景不可估量。相比较其他高通量的基因检测技术，二代高通量测序技术更准确、灵敏、具有更高的通量。随着价格的不断降低，其应用于亲子鉴定的前景十分广阔，代表了未来的发展方向。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种高通量测序检测无创亲子鉴定的方法，利用SNP标记高通量、易检测的优点及高通量测序的通量高、节约时间等优势，建立了一个可用于人类无创亲子鉴定的多重PCR引物panel，该panel通过高通量测序的手段可以对400个SNP遗传标记进行检测，从而使得胎儿在无创伤性的条件下达到亲缘关系的比较和亲子鉴定的目的。

本发明的技术方案如下：

一种高通量测序检测无创亲子鉴定的方法，包括以下步骤：

步骤a、提取基因组DNA，包括提取孕妇新鲜血液中的胎儿游离DNA、提取孕妇DNA、提取疑似父亲的DNA；

步骤b、多重PCR扩增，利用多重PCR引物panel进行多重PCR扩增，并纯化扩增产物，采用含有多个SNP位点的扩增子试剂盒进行PCR扩增，分别对胎儿游离DNA、孕妇DNA、疑似父亲的DNA进行富集；

步骤c、文库构建，即采用文库构建试剂盒对纯化好的多重PCR扩增产物进行文库构建；

步骤d、文库质控，采用实时荧光定量PCR和Agilent 2100对构建好的文库进行质量控制，为上机测序做准备；

步骤e、测序，采用二代测序仪，包括Ion Torrent平台或Illumina平台的测序仪进行上机测序；

步骤f、数据分析，采用软件对上机测序结果进行生物信息学分析，进行亲子鉴定判断，并进行生物信息学数据分析，分析胎儿、孕妇和疑似父亲的DNA的SNP位点，并进行比对，鉴定出是否具有亲缘关系。

优选地，所述扩增子试剂盒包含400个SNP位点。

优选地，所述提取疑似父亲的DNA包括提取抗凝血DNA、口腔上皮细胞DNA、带毛囊的毛发中的DNA、精液中的DNA中的一种或几种。

本发明的有益效果是所述高通量测序检测无创亲子鉴定的方法经过高通量测序检测SNP多态及亲子推断实验验证，其亲子关系是显著的，并且鉴定结果与实际亲缘关系吻合；本发明提供了一组用于胎儿无创亲子鉴定的多重PCR引物panel，该SNP标记的多重PCR引物panel可对400个SNP遗传标记进行检测，用于胎儿无常亲子鉴定中，结果准确；利用高通量测序进行无创亲子鉴定检测，具有无创性、安全性、通量高、成本低等优点；并且相比于传统的检测方法，该发明方法可在孕妇怀孕的早期进行检测，且无创伤性，可以给家庭和社会具有巨大的价值，还可以应用在法医研究罪犯身份的鉴别或亲子鉴定中。

附图说明

图1是本发明所述高通量测序检测无创亲子鉴定的方法的步骤流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

如图所示，本发明公开一种高通量测序检测无创亲子鉴定的方法，包括以下步骤：步骤a、提取基因组DNA，包括提取孕妇新鲜血液中的胎儿游离DNA、提取孕妇DNA、提取疑似父亲的DNA；所述提取疑似父亲的DNA包括提取抗凝血DNA、口腔上皮细胞DNA、带毛囊的毛发中的DNA、精液中的DNA中的一种或几种；步骤b、多重PCR扩增，利用多重PCR引物panel进行多重PCR扩增，并纯化扩增产物，采用含有多个SNP位点的扩增子试剂盒进行PCR扩增，分别对胎儿游离DNA、孕妇DNA、疑似父亲的DNA进行富集，所述扩增子试剂盒包含400个SNP位点，这些SNP位点的引物的核苷酸序列参见下文中表1所示；步骤c、文库构建，即采用文库构建试剂盒对纯化好的多重PCR扩增产物进行文库构建；步骤d、文库质控，采用实时荧光定量PCR和Agilent 2100对构建好的文库进行质量控制，为上机测序做准备；步骤e、测序，采用二代测序仪，包括Ion Torrent平台或Illumina平台的测序仪进行上机测序；步骤f、数据分析，采用软件对上机测序结果进行生物信息学分析，进行亲子鉴定判断，并进行生物信息学数据分析，分析胎儿、孕妇和疑似父亲的DNA的SNP位点，并进行比对，鉴定出是否具有亲缘关系。

本发明中的高通量测序检测无创亲子鉴定的方法经过高通量测序检测SNP多态及亲子推断实验验证，其亲子关系是显著的，并且鉴定结果与实际亲缘关系吻合；本发明提供了一组用于胎儿无创亲子鉴定的多重PCR引物panel，该SNP标记的多重PCR引物panel可对400个SNP遗传标记进行检测，用于胎儿无常亲子鉴定中，结果准确；利用高通量测序进行无创亲子鉴定检测，具有无创性、安全性、通量高、成本低等优点；并且相比于传统的检测方法，该发明方法可在孕妇怀孕的早期进行检测，且无创伤性，可以给家庭和社会具有巨大的价值，还可以应用在法医研究罪犯身份的鉴别或亲子鉴定中。

实施例一：

一种高通量测序检测无创亲子鉴定的方法，包括以下步骤：

步骤a、提取基因组DNA；

(1)提取胎儿游离DNA

1)取出600μl血浆样品，常温放置，待样品融化后，立即加入10μl蛋白酶K，震荡混匀，短暂离心；

2)立即加入600μl GB Mix，震荡混匀，短暂离心；56℃水浴10分钟后，取出样品管，擦干管壁，室温放置5分钟，离心；把吸附柱和收集管套在一起，并根据样本信息在管盖上标记样本编号；

3)加入300μl的-20℃预冷的无水乙醇，轻柔颠倒混匀5～7次，静置5分钟，离心；

4)转移样本溶液750μl至吸附柱管中，8000rpm离心30秒，弃滤液，将吸附柱放回收集管中；将剩余样本溶液再转至该吸附柱管中，8000rpm离心30秒，弃滤液，将吸附柱放回收集管中；转管时须反复核对样本编号，谨防样本混淆；

5)往吸附柱加入500μl缓冲液GD，8000rpm离心30秒，弃滤液，将吸附柱放回收集管中；

6)往吸附柱加入500μl漂洗液PW，8000rpm离心30秒，弃滤液，将吸附柱放回收集管中；

7)重复一次步骤6)；

8)空吸附柱12000rpm离心2分钟，将吸附柱转至1.5mL低吸附离心管上，打开吸附柱盖子，室温自然晾干3分钟；

9)往吸附柱的硅胶膜正上方悬空加入43μl洗脱缓冲液TB，室温放置5分钟，12000rpm离心2分钟，则为最终的DNA文库，-20℃保存，备用。

(2)提取孕妇DNA

1)向血液中加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

2)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

3)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

4)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

5)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

6)重复操作步骤5；

7)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液；将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

8)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；

(3)提取疑似父亲的DNA(干血斑样品)

1)取三片3×3mm的干血斑样品到1.5ml的离心管(自备)中；

2)加入200μl的缓冲液GA；

3)加入20μl Proteinase K溶液，涡旋震荡10sec混匀后，放入预热至56℃的恒温震荡器中，900rpm恒温震荡1h；

4)短暂离心，加入200μl的缓冲液GB，震荡10sec充分混匀，将离心管放入预热至70℃的恒温震荡器中，900rpm恒温震荡10min，孵育结束后简短离心以去除管盖内壁的液滴；

5)加入100μl的无水乙醇，如果室温超过25℃，请将无水乙醇置冰上预冷，轻轻颠倒混匀样品，室温放置5min，简短离心以去除管盖内壁的液滴；

6)将上一步所得溶液都加到一个吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，弃收集管废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

7)向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，弃收集管废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

8)向吸附柱CR2中加入700μl漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，弃收集管废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

9)吸附柱CR2中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm离心30sec；弃收集管废液；

10)吸附柱CR2放回废液收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液；将吸附柱CR2置于室温放置2-5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

11)吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

步骤b、多重PCR扩增

(1)试剂从-20℃冰箱中拿至-4℃中解冻，备用；

(2)多重PCR扩增的反应体系如下：

组成成分	体积(μl)
		PCR Buffer	6.0
dNTP	0.6
		Primer	6.7
HotstarTaq Polymerase	0.5
		模板DNA	16.2
Total	30

(3)反应程序：

步骤c、文库构建

采用文库构建的相关试剂盒对纯化好的多重PCR扩增产物进行文库构建。

(1)末端修复、磷酸化并加dA尾

1)在灭菌PCR管中配制如下反应：

组成成分	体积(μl)
		VAHTS Turbo End Prep Enzyme Mix	30
VAHTS Turbo End Prep Reaction Buffer(10×)	6.5
		片段化DNA	15
ddH2O	13.5
		Total	65

2)使用移液器轻轻吹打混匀(请勿震荡混匀)，并短暂离心将反应液收集至管底；

3)将反应管置于PCR仪中，进行下述反应：

20℃	30min
		65℃	30min
4℃	hold

(2)接头连接

1)将下列组分直接添加至65μl末端修复产物中：

组成成分	体积(μl)
		VAHTS Turbo T4DNA Ligase	2.0
VAHTS Turbo Ligation Enhancer	30.5
		VAHTS Adapter for Illumina*	2.5
Total	100

2)使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；

3)将反应管置于PCR仪中，进行下述反应：

20℃	15min
		4℃	hold

(3)连接产物纯化

1)涡旋震荡混匀AMPure XP beads；

2)吸取100μl(1×)AMPure XP beads至100μl连接产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；

3)室温孵育5分钟；

4)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体；待溶液澄清后(大约5分钟)，小心移除上清；

5)保持EP管始终处于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠；室温孵育30秒，小心移除上清；

6)重复步骤5两次，总计漂洗三次；

7)保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠10分钟；

8)将EP管从磁力架中取出，加入28μl灭菌超纯水进行DNA洗脱，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(大约5分钟)，小心吸取22μl上清至灭菌PCR管中；

9)进行文库扩增。

(4)PCR扩增

1)在灭菌PCR管中配制如下反应：

组成成分	体积(μl)
		连接反应纯化产物	22
VAHTS Super-Fidelity 2×PCR Buffer	25
		VAHTS Universal PCR Primer for Illumina*	1
VAHTS Index Primer for Illumina*	1
		VAHTS Super-Fidelity DNA Polymerase	1
Total	50

2)使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；

3)将反应管置于PCR仪中，进行下述反应：

(5)PCR扩增产物纯化

1)涡旋震荡混匀AMPure XP beads；

2)吸取50μl(1×)AMPure XP beads至PCR产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；

3)室温孵育5分钟；

4)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，小心移除上清；

5)保持EP管始终处于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清；

6)重复步骤5两次，总计漂洗三次；

7)保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠10分钟；

8)将EP管从磁力架中取出，加入30μl灭菌超纯水进行DNA洗脱，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(大约5分钟)，小心吸取25μl上清至灭菌PCR管中；

9)将制备好的DNA文库置于-20℃保存；

步骤d、文库质控

采用实时荧光定量PCR和Agilent 2100对构建好的文库进行质量控制，为上机测序做准备；

步骤e、测序

采用二代测序仪，包括Ion Torrent平台或Illumina平台的测序仪进行上机测序；

步骤f、数据分析

采用软件对上机测序结果进行生物信息学分析，进行亲子鉴定判断，并进行生物信息学数据分析，分析胎儿、孕妇和疑似父亲的DNA的SNP位点，并进行比对，鉴定出是否具有亲缘关系。

表1、400个SNP位点的引物的核苷酸序列

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (3)

1.一种高通量测序检测无创亲子鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a、提取基因组DNA，包括提取孕妇新鲜血液中的胎儿游离DNA、提取孕妇DNA、提取疑似父亲的DNA；

步骤b、多重PCR扩增，利用多重PCR引物panel进行多重PCR扩增，并纯化扩增产物，采用含有多个SNP位点的扩增子试剂盒进行PCR扩增，分别对胎儿游离DNA、孕妇DNA、疑似父亲的DNA进行富集；

步骤c、文库构建，即采用文库构建试剂盒对纯化好的多重PCR扩增产物进行文库构建；

步骤d、文库质控，采用实时荧光定量PCR和Agilent 2100对构建好的文库进行质量控制，为上机测序做准备；

步骤e、测序，采用二代测序仪，包括Ion Torrent平台或Illumina平台的测序仪进行上机测序；

步骤f、数据分析，采用软件对上机测序结果进行生物信息学分析，进行亲子鉴定判断，并进行生物信息学数据分析，分析胎儿、孕妇和疑似父亲的DNA的SNP位点，并进行比对，鉴定出是否具有亲缘关系。

2.根据权利要求书1所述的高通量测序检测无创亲子鉴定的方法，其特征在于：所述扩增子试剂盒包含400个SNP位点。

3.根据权利要求书1所述的高通量测序检测无创亲子鉴定的方法，其特征在于：所述提取疑似父亲的DNA包括提取抗凝血DNA、口腔上皮细胞DNA、带毛囊的毛发中的DNA、精液中的DNA中的一种或几种。