CN110724732A - 一种产前亲权关系鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
一种产前亲权关系鉴定的方法,利用环化扩增放大仅仅只需提供母亲外周10ul‑1.2ml血浆,在母亲外周血浆中提取的游离DNA已经包含了胎儿的游离DNA,所以母亲和胎儿只需一份样品即可。由于只需抽取孕妇的静脉血,操作简便,且血量少,因此不会对孕妇和胎儿造成创伤,且孕10周后即可鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及亲权鉴定领域,尤其是涉及一种能利用少量血浆进行有效产 前亲权关系鉴定的方法。
背景技术
亲子鉴定是根据人类遗传学的理论和实践,从子代和亲代的形态构造或 者生理机能方面的相似特点,分析遗传特征,对可疑的父子关系或母子关系 进行判断,并作出肯定或者否定的结论。而判断亲子关系最早用于检测遗传 多态性的方法是使用限制性内切酶对人类基因组中可变数目的串联重复 (VNTR)做限制性片段长度多态性分析。随着技术的进步,DNA聚合酶链式反 应(PCR),使得较短的核酸片段也能用于分析,将分析目标集中到VNTR中的 较短的短串联重复序列(STR),加上多重PCR技术的应用,迅速使STR基因座 的分型检测在法医和刑侦中应用起来。STR也成为目前最常用的遗传标记。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是第三代遗传 学标记,这种遗传标记是由于单碱基突变使特定核苷酸位置上出现两种碱基, 其中最少的一种在群体中的频率不少于1%。与第一代的RFLP及第二代的STR 以长度的差异作为遗传标记的特点截然不同。SNP的分布密集,如果以1%的 频率计算,在人基因组中就有300万个以上的SNP遗传标记,这可能达到了 人类基因组多态位点数目的极限,因此被认为是应用前景最好的遗传标记物。 在医学遗传学、群体遗传学和药物基因组学中有广泛的应用。在法医物证检 验中,也由于SNP的含量丰富、遗传稳定,而引起了高度重视。
产前亲子鉴定,也称胚胎期亲子鉴定、胎儿亲子鉴定,是指利用基因技 术鉴定胎儿生物学意义上的父亲。现有产前亲子鉴定技术是从胎儿绒毛或者 孕妇羊水中提取DNA物质,鉴定检测出胎儿的STR与疑似父亲的DNA进行比 对,以确认亲子关系。
现有技术建库方法和测序原理需要采集孕妇5ml的血液,血液的运输条件 和采集要求比较高。目前,针对血浆保存管保存温度是6-37度,在夏天或者 北方地区的冬天就需要采取控温措施,这样也加大了快递难度;同时,5ml血 液采集需要到有采血资格的采血点或者医院才能采集,给客户增加采血的难 度。
因此,如何改进产前亲权鉴定方法才能实现利用少量血浆进行测序,则 是本领域技术人员需要解决的重要技术问题之一。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供一种产前亲权关系鉴定的方法的技术方案 其包括如下步骤:
步骤一,设计位点及引物;
步骤二,提取孕妇样本和待定男性样本的样品DNA;
步骤三,样品DNA的片段制备;
步骤四,样品DNA片段于测序前的处理;
步骤五,测序;
步骤六,测序数据后处理,并筛选出孕妇样本和待定男性样本的纯合SNP 位点;
步骤七,将孕妇样本和待定男性样本在每个相同的纯合SNP位点进行对 比,最高碱基类型相同的位点定义为一个肯定位点,最高碱基类型不同则将 该位点定义为一个否定位点,统计出肯定位点和否定位点的数目;
步骤八,根据步骤七的到的肯定位点或者否定位点进行亲权关系判断。
进一步优选的:所述的步骤三具体包括:环化样品DNA,消化环化到的环 化产物,扩增消化到的循环核酸,并打断扩增到的循环核酸。
进一步优选的:所述的步骤五中所述测序为高通量测序。
进一步优选的:所述的步骤四包括:扩增含有SNP位点的片段,纯化扩 增到的PCR产物,并将PCR产物末端修复,筛选得到平末端DNA片段,接头 连接,得加接头的DNA片段,PCR扩增及纯化得到小片段文库,检测小片段 文库的文库浓度和片段大小。
进一步优选的:所述的步骤五中所述测序为Nanopore测序。
进一步优选的:所述的步骤五包括:
1)打开Nanopore测序仪启动口,检查阀盖下是否有小气泡;
2)步骤四所获得的样品DNA片段准备和加样SpotON flow cell:准备 primingmix:将RBF,Nuclease-free water混匀后,吸800ul注 入到priming port,室温静置5min;文库准备:RBF,LLB, Nuclease-free water,DNA library混匀后,吸取75ul滴入进样孔,盖上盖子,准备测序;
3)根据MinKNOW指示运行程序,进行测序;
4)从nanopore测序仪上获得fastq测序结果的文件;
5)将上步每一条长序列得到的多条短序列采用多对齐算法,彼此对齐, 校准碱基。
进一步优选的:所述的步骤四包括:将样品DNA片段末端修复,筛选及 纯化得到粘性末端,接头连接,得加接头的DNA片段,将加接头的DNA片段 进行筛选及纯化得待测序DNA。
进一步优选的:所述的步骤二中孕妇样本为孕妇外周血或孕妇白细胞样 本。
进一步优选的:所述的步骤二中孕妇样本为孕妇外周血时,需采 10ul-1.2ml血浆,再利用磁珠法提取孕妇血浆样本中游离DNA。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
本发明所述的方法利用一种不同的DNA扩增方式:即环化扩增,该方法 降低了对血液样本量的需求,另外采用环化扩增,在测序方式上选择更加多 样,可以选择二代测序和三代测序,测序方式的不同意味对时间和成本都能 有更多选择;
另,本发明中使用了三代测序nanopore,环化扩增游离DNA,解决了这 款三代测序仪在血浆游离DNA方面的应用的劣势,同时于实验,测序和数据 分析SNP分型步骤都有不同,本实施例实验时间快且对实验环境要求低,进 一步减少血液运输的要求;
综上所述,本发明解决了客户不方便采集样品的技术问题,实现少量采 集血浆同样达到亲权鉴定准确性及实际操作性的目的,解决了大部分客户的 需求,使得样品采集方法普及,提升了整个产前亲权关系鉴定的实用性及实 际可操作性。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1:
一种产前亲权关系鉴定的方法的技术方案其包括如下步骤:
步骤一,设计位点及引物:
1)选择位点:在人类基因组中选择13000个位点,推荐选择位点的条件:
1、数据库中最小等位基因频率MAF在0.2-0.5范围;2、符合Hardy-Weinberg平衡并且任意两标记间距离大于5Mb;3、位点均匀 覆盖在全基因组上。上述条件是可选的,仅影响方法的准确率和稳定 性;
2)设计引物:根据选择的位点,在ION AMPLISEQ DESIGNER网站设计引 物。引物或者探针设计可选其他供应商。
步骤二,提取孕妇样本和待定男性样本的样品DNA;其中针对孕妇样本 而言可以是孕妇外周血或孕妇白细胞样本,当所述孕妇样本为孕妇外周血(所 述孕妇外周血含有孕妇本人和胎儿两个人的DNA)时,需采10ul-1.2ml血浆, 再利用磁珠法提取孕妇血浆样本中游离DNA,在本实施例中以采集10ul血浆 为例,并采用磁珠法提取血浆中游离DNA;男性样本DNA根据样本类型选择相 应试剂盒提取DNA,并且可以不做后续步骤三;可选的孕妇的白细胞可以根据 男性样本的实验方法实验。
步骤三,样品DNA的片段制备,其包括环化样品DNA,消化环化到的环化 产物,扩增消化到的循环核酸,并打断扩增到的循环核酸;
具体的说:
1)环化DNA:
a)将装有48.2ul cfDNA的pcr管在pcr仪器中95°孵育3min, 然后立即转移到冰浴,放置3min;
b)按照下表配置环化反应混合液:
c)振荡混匀5s,瞬时离心将反应液收集至管底;
d)将上述环化反应混合液的pcr管置于pcr仪上,按照下表条件 进行反应:
温度 | 时间 |
热盖 | on |
37° | 30min |
4° | Hold |
2)消化环化产物:
a)按照下表配制消化反应混合液:
组分 | 体积 |
环化产物 | 60ul |
Digestion Buffer | 1.4ul |
Digestion Enzyme | 2.6ul |
Total | 64ul |
b)涡旋振荡混匀5s,瞬时离心将反应液收集至管底;
c)将上述环化反应混合液的pcr管置于pcr仪上,按照下表条件进 行反应:
d)反应结束后,立即向每个反应中加入7.5ul Digestion Stop Buffer,震荡混匀5秒,终止反应;
e)将所有反应液短暂离心,转移到新的1.5mL不粘管中,待纯化;
f)提前30min取出AMPure XP beads置于室温,使用前充分震荡混 匀;
g)吸取168ul AMPure XP beads至消化产物中,用移液器轻轻吹打 10次;
h)充分混匀,室温孵育10min;
i)瞬时离心,将不粘管置于磁力架,静置2min至液体澄清,用移液 器吸取并弃掉上清;
j)保持不粘管固定于磁力架上,加入200ul新鲜配制的80%乙醇, 取出不粘管并旋转180°后放回到磁力架,重复三次,室温静置1 分钟后小心弃去上清;
k)重复步骤i)一次,尽量吸干管底液体,有少量残留在管壁时可 将离心管瞬时离心10秒,在磁力架上分离后,用小量程的移液器 把管中液体吸干;
l)保持不粘管固定于磁力架上,打开不粘管管盖,室温干燥3-5min 或者直至磁珠无反光、无开裂;
m)将不粘管从磁力架上取下,加入14ul TE进行DNA洗脱,用移 液器吹打混匀并室温下溶解2min;
n)瞬时离心,将不粘管置于磁力架上,静置2min至液体澄清,将上 清液转移到新的0.2ml pcr管中。
3)扩增环化后的cfDNA:
a)将装有14ul环化后的cfDNA的pcr管在pcr仪器中95°孵育 5min,然后立即转移到冰浴,放置3min;
b)在冰盒上配置下方试剂:
c)涡旋振荡混匀5s,瞬时离心将反应液收集至管底;
d)将上述反应混合液的pcr管置于pcr仪上,按照下表条件进行反 应:
温度 | 时间 |
热盖 | on |
30° | 30min |
4° | Hold |
e)在冰盒上配置下方试剂:
f)涡旋振荡混匀5s,瞬时离心将反应液收集至管底;
g)将上述反应混合液的pcr管置于pcr仪上,按照下表条件进行反 应:
温度 | 时间 |
30° | 16H |
65° | 10min |
4° | Hold |
;
4)打断DNA,上述环化后扩增后的DNA片段很长,利用物理方法打断成 段片段;具体的打断方法可选的物理打断,超声打断,或者在RCA扩 增体系中加入限制性内切酶位点,利用限制性内切酶来打断;
5)可选的进行目标大小片段筛选。
步骤四,样品DNA片段于测序前的处理;
1)扩增含有SNP位点的片段:DNA片段,多重PCR反应酶和SNP Primer 混匀后进行PCR反应;
2)纯化扩增后的片段;
3)末端修复:将步骤10所得混合DNA片段、End repair Enzyme与5X End repairBuffer混合,室温下进行反应;
4)片段筛选:将步骤3)所得混合DNA片段进行片段筛选及纯化,得到 片段中的平末端DNA片段;
5)接头连接:将步骤12所得DNA片段,ligase Enzyme,10X ligase Buffer,接头,BarcodeX混合后,室温下进行反应;
6)片段筛选:将步骤13所得混合DNA片段进行片段筛选及纯化,得到 加了接头的DNA片段;
7)文库检测:将步骤14所得扩增产物采用Quibt和Agilent Bioanalyzer2100检测文库浓度和片段大小。
步骤五,测序;
具体的说:所述测序为高通量测序:对步骤四所得到的合格文库进行高 通量测序;
步骤六,测序数据后处理,并筛选出孕妇样本和待定男性样本的纯合SNP 位点;
步骤六中的具体操作如下:
1)数据预处理:将高通量测序得到的数据首先经过低质量过滤,同时筛 选出长度大于100bp的序列,因为设计的引物加上目标序列长度都大 于这个。(过滤的长度可根据设计的目标区域变化);
2)序列比对:将上步预处理后的序列与人类基因组序列(hg19)用 bowtie2经行比对(可用其他比对软件,参考基因组可用其他版本);
3)序列筛选:根据上步对比的结果,筛选出错配碱基在4个以下,只比 对到一处的序列,称之为unique read,(错配碱基数目可有其他标 准,如长度的百分之三,或者目标区域的SNP数目加上1);
4)SNP数据统计:根据比对结果及SNP位点的位置统计出每个SNP位 点的覆盖深度、碱基种类、每种碱基对应数目;
5)根据统计结果,对每个SNP位点中四种碱基出现次数进行排序,四种 碱基种类按照次数从多到少的顺序分别称作Major_alle、 Minor_alle、Third_alle及Fourth_alle,每种类型碱基出现的次数 依次为Major_num、Minor_num、Third_num及Fourth_num,并得出SNP位点的覆盖深度Depth,Depth等于四种碱基数目之和,即
Detph=Major_num+Minornum+Third_num+Fourth_num;
6)计算最高碱基比例:计算出在SNP位点中出现次数最多的碱基占该位 点总覆盖深度的比例,即
最高碱基比例Major_percent=Major_num/Detph;
7)筛选位点:筛选出覆盖深度Detph大于200层,且最高碱基比大于 99%的位点,对于待定男性样本筛选条件可设为Detph大于200层, 最高碱基比大于98%;
8)对于孕妇样本,由于母亲和胎儿在一个SNP位点上可能出现4种情 况,即具有四种SNP组合类型:类型1:母亲和胎儿都是纯合SNP; 类型2:母亲纯合SNP,胎儿杂合SNP;类型3:母亲杂合SNP,胎 儿纯合SNP;类型4:母亲和胎儿都是杂合SNP。由于类型2、3、4 中都包含有杂合的情况,所以本方法目前仅选用母亲胎儿均是纯合的 类型1来判定亲子关系,具体为当某一SNP位点最高碱基比大于99% 时,该位点即为类型1,母亲胎儿均为纯合,该最高碱基即为母亲和 胎儿的基因型;
9)对于待定男性样本,在一个SNP上可能出现的类型有两种,纯合或者 杂合,我们使用纯合的情况来判断他将要遗传给胎儿的基因型,从而 判断亲子关系,具体为当某SNP位点最高碱基比大于99%时,该位 点即为纯合,该最高碱基即为待定男性的基因型。
步骤七,将孕妇样本和待定男性样本在每个相同的纯合SNP位点进行对 比,最高碱基类型相同的位点定义为一个肯定位点,最高碱基类型不同则将 该位点定义为一个否定位点,统计出肯定位点和否定位点的数目;
步骤八:根据步骤七的到的肯定位点或者否定位点进行亲权关系判断。
步骤八具体判断如下:
判断方法一:简单的设定否定位点或者肯定位点阈值来判断关系;
具体:当否定位点数目大于等于5个即否定胎儿与待定疑父亲缘关系; 这种方法判断简单但对数据要求较高,需要较高测序层数,且否定位点的阈 值可以随鉴定位点数目调整。
判断方法二:将样本肯定位点和否定位点数目与确定关系的数据集对照, 比如不支持样本数据集做统计对照,是否有明显差异来判断;
具体实施将孕妇与包括疑父在内的多个不相关男性进行比对,统计得到 的支持位点与否定位点,把这样的称为样本,这样就会得到一组点集,利用 t-test等统计方法,判断孕妇与疑父的点是否与其他不相关男性的点有离群, 具体阈值如Z是否大于3,如果大于3就表明这个孕妇胎儿与这个男性关系不 同与其他不相关男性;
可选的可将确定不支持的孕妇与疑父的点作为参考,如果样本与这个点 集离群就提示不支持关系;
可选的可以将确定支持关系的孕妇和疑父的样本作为支持参考集,样本 和这个点集关系也可以计算得到Z值,通过两个Z值的比较来确定胎儿与疑 父关系;
判断方法三:将步骤24的到的位点,参考《法医SNP分型与应用规范》, 计算每个位点随机群体中男性候选者的亲子指数(PI),PI=Pr(Plasma| Mother,T)/Pr(Plasma|Mother,R)。Pr(Plasma|Mother,T)男性 候选人是生父的概率,Pr(Plasma|Mother,R)其代表随机人是生物父亲 的概率;然后将筛选位点的PI相乘的到累积亲权关系(CPI), CPI大于10000认为是亲生父亲。
在本实施例中于步骤三种增加有效的环化扩增技术(RCA处理),从而达 到于步骤二中采少量孕妇外周血浆同样获得处理后(即可测序的DNA片段), 具体如下:
经过上述步骤三从血浆中得到的的DNA量就会高于没有经过RCA扩增的 的得到DNA量,以两个样本的实验结果展示二者区别如下表显示:
实施例二:
一种产前亲权关系鉴定的方法的技术方案其包括如下步骤:
步骤一,设计位点及引物:
1)选择位点:在人类基因组中选择13000个位点,推荐选择位点的条件: 1、数据库中最小等位基因频率MAF在0.2-0.5范围;2、符合 Hardy-Weinberg平衡并且任意两标记间距离大于5Mb;3、位点均匀 覆盖在全基因组上。上述条件是可选的,仅影响方法的准确率和稳定 性;
2)设计引物:根据选择的位点,在ION AMPLISEQ DESIGNER网站设计引 物。引物或者探针设计可选其他供应商。
步骤二,提取孕妇样本和待定男性样本的样品DNA;其中针对孕妇样本 而言可以是孕妇外周血或孕妇白细胞样本,当所述孕妇样本为孕妇外周血(所 述孕妇外周血含有孕妇本人和胎儿两个人的DNA)时,需采10ul-1.2ml血浆, 再利用磁珠法提取孕妇血浆样本中游离DNA,在本实施例中以采集10ul血浆 为例,并采用磁珠法提取血浆中游离DNA;男性样本DNA根据样本类型选择相 应试剂盒提取DNA,并且可以不做后续步骤三;可选的孕妇的白细胞可以根据 男性样本的实验方法实验。
步骤三,样品DNA的片段制备,其包括环化样品DNA,消化环化到的环化 产物,扩增消化到的循环核酸,并打断扩增到的循环核酸;
具体的说:
1)环化DNA:
a)将装有48.2ul cfDNA的pcr管在pcr仪器中95°孵育3min,然 后立即转移到冰浴,放置3min;
b)按照下表配置环化反应混合液:
c)振荡混匀5s,瞬时离心将反应液收集至管底;
d)将上述环化反应混合液的pcr管置于pcr仪上,按照下表条件进 行反应:
温度 | 时间 |
热盖 | on |
37° | 30min |
4° | Hold |
2)消化环化产物:
a)按照下表配制消化反应混合液:
组分 | 体积 |
环化产物 | 60ul |
Digestion Buffer | 1.4ul |
Digestion Enzyme | 2.6ul |
Total | 64ul |
b)涡旋振荡混匀5s,瞬时离心将反应液收集至管底;
c)将上述环化反应混合液的pcr管置于pcr仪上,按照下表条件进 行反应:
温度 | 时间 |
热盖 | on |
37° | 30min |
4° | Hold |
d)反应结束后,立即向每个反应中加入7.5ul Digestion Stop Buffer,震荡混匀5秒,终止反应;
e)将所有反应液短暂离心,转移到新的1.5mL不粘管中,待纯化;
f)提前30min取出AMPure XP beads置于室温,使用前充分震荡混 匀;
g)吸取168ul AMPure XP beads至消化产物中,用移液器轻轻吹打 10次;
h)充分混匀,室温孵育10min;
i)瞬时离心,将不粘管置于磁力架,静置2min至液体澄清,用移液 器吸取并弃掉上清;
j)保持不粘管固定于磁力架上,加入200ul新鲜配制的80%乙醇, 取出不粘管并旋转180°后放回到磁力架,重复三次,室温静置1 分钟后小心弃去上清;
k)重复步骤i)一次,尽量吸干管底液体,有少量残留在管壁时可 将离心管瞬时离心10秒,在磁力架上分离后,用小量程的移液器 把管中液体吸干;
l)保持不粘管固定于磁力架上,打开不粘管管盖,室温干燥3-5min 或者直至磁珠无反光、无开裂;
m)将不粘管从磁力架上取下,加入14ul TE进行DNA洗脱,用移 液器吹打混匀并室温下溶解2min;
n)瞬时离心,将不粘管置于磁力架上,静置2min至液体澄清,将上 清液转移到新的0.2ml pcr管中。
3)扩增环化后的cfDNA:
a)将装有14ul环化后的cfDNA的pcr管在pcr仪器中95°孵育 5min,然后立即转移到冰浴,放置3min;
b)在冰盒上配置下方试剂:
c)涡旋振荡混匀5s,瞬时离心将反应液收集至管底;
d)将上述反应混合液的pcr管置于pcr仪上,按照下表条件进行反 应:
温度 | 时间 |
热盖 | on |
30° | 30min |
4° | Hold |
e)在冰盒上配置下方试剂:
组分 | 体积 |
Random hexamer primers(100uM) | 1ul |
dNTP Mix(2.5mM each) | 1ul |
Denatured template DNA 1 | 17ul |
Nuclease-free Water 1 | 1ul |
Final Reaction Volume | 20ul |
f)涡旋振荡混匀5s,瞬时离心将反应液收集至管底;
g)将上述反应混合液的pcr管置于pcr仪上,按照下表条件进行反 应:
温度 | 时间 |
30° | 16H |
65° | 10min |
4° | Hold |
;
4)打断DNA,上述环化后扩增后的DNA片段很长,利用物理方法打断成 段片段;具体的打断方法可选的物理打断,超声打断,或者在RCA扩 增体系中加入限制性内切酶位点,利用限制性内切酶来打断;
5)可选的进行目标大小片段筛选。
步骤四,样品DNA片段于测序前的处理;
1)末端修复:将步骤三种得到的基因组DNA,Ultra II End-prep reactionbuffer,Ultra II End-prep enzyme mix,Nuclease-free water混 匀后,室温下孵育反应;
2)片段筛选:对步骤1)中反应后的DNA进行片段筛选及纯化,得到的 DNA为粘性末端(DNA产量需大于700ng);
3)接头连接:将End-prepped DNA,Adapter Mix 1D(AMX1D),Blunt/TA LigationMaster Mix混匀后,室温下孵育反应;
4)片段筛选:对步骤3)中反应后的DNA进行片段筛选及纯化,得到的 DNA直接用于测序。
步骤五,测序;
具体的说:所述的步骤五中所述测序为Nanopore测序。
所述的步骤五包括:
1)打开Nanopore测序仪启动口,检查阀盖下是否有小气泡;
2)步骤四所获得的样品DNA片段准备和加样SpotON flow cell:准备 primingmix:将RBF,Nuclease-free water混匀后,吸800ul注 入到priming port,室温静置5min;文库准备:RBF,LLB, Nuclease-free water,DNA library混匀后,吸取75ul滴入进样孔,盖上盖子,准备测序;
3)根据MinKNOW指示运行程序,进行测序;
4)从nanopore测序仪上获得fastq测序结果的文件;
5)将上步每一条长序列得到的多条短序列采用多对齐算法,彼此对齐, 校准碱基。
步骤六,测序数据后处理,并筛选出孕妇样本和待定男性样本的纯合SNP 位点;
步骤六中的具体操作如下:
1)数据预处理:将测序得到的数据首先经过低质量过滤,同时筛选出长 度大于100bp的序列,因为设计的引物加上目标序列长度都大于这 个。(过滤的长度可根据设计的目标区域变化);
2)序列比对:将上步预处理后的序列与人类基因组序列(hg19)用 bowtie2经行比对(可用其他比对软件,参考基因组可用其他版本);
3)序列筛选:根据上步对比的结果,筛选出错配碱基在4个以下,只比 对到一处的序列,称之为unique read,(错配碱基数目可有其他标 准,如长度的百分之三,或者目标区域的SNP数目加上1);
4)SNP数据统计:根据比对结果及SNP位点的位置统计出每个SNP位 点的覆盖深度、碱基种类、每种碱基对应数目;
5)根据统计结果,对每个SNP位点中四种碱基出现次数进行排序,四种 碱基种类按照次数从多到少的顺序分别称作Major_alle、 Minor_alle、Third_alle及Fourth_alle,每种类型碱基出现的次数 依次为Major_num、Minor_num、Third_num及Fourth_num,并得出SNP位点的覆盖深度Depth,Depth等于四种碱基数目之和,即
Detph=Major_num+Minornum+Third_num+Fourth_num;
6)计算最高碱基比例:计算出在SNP位点中出现次数最多的碱基占该位 点总覆盖深度的比例,即
最高碱基比例Major_percent=Major_num/Detph;
7)筛选位点:筛选出覆盖深度Detph大于200层,且最高碱基比大于 99%的位点,对于待定男性样本筛选条件可设为Detph大于200层, 最高碱基比大于98%;
8)对于孕妇样本,由于母亲和胎儿在一个SNP位点上可能出现4种情 况,即具有四种SNP组合类型:类型1:母亲和胎儿都是纯合SNP; 类型2:母亲纯合SNP,胎儿杂合SNP;类型3:母亲杂合SNP,胎 儿纯合SNP;类型4:母亲和胎儿都是杂合SNP。由于类型2、3、4 中都包含有杂合的情况,所以本方法目前仅选用母亲胎儿均是纯合的 类型1来判定亲子关系,具体为当某一SNP位点最高碱基比大于99% 时,该位点即为类型1,母亲胎儿均为纯合,该最高碱基即为母亲和 胎儿的基因型;
9)对于待定男性样本,在一个SNP上可能出现的类型有两种,纯合或者 杂合,我们使用纯合的情况来判断他将要遗传给胎儿的基因型,从而 判断亲子关系,具体为当某SNP位点最高碱基比大于99%时,该位 点即为纯合,该最高碱基即为待定男性的基因型。
步骤七,将孕妇样本和待定男性样本在每个相同的纯合SNP位点进行对 比,最高碱基类型相同的位点定义为一个肯定位点,最高碱基类型不同则将 该位点定义为一个否定位点,统计出肯定位点和否定位点的数目;
步骤八:根据步骤七的到的肯定位点或者否定位点进行亲权关系判断。
步骤八具体判断如下:
判断方法一、:简单的设定否定位点或者肯定位点阈值来判断关系;当否 定位点数目大于等于5个即否定胎儿与待定疑父亲缘关系。这种方法判断简 单但对数据要求较高,需要较高测序层数,且否定位点的阈值可以随鉴定位 点数目调整。
判断方法二:将样本肯定位点和否定位点数目与确定关系的数据集对照, 比如不支持样本数据集做统计对照,是否有明显差异来判断;具体实施将孕 妇与包括疑父在内的多个不相关男性进行比对,统计得到的支持位点与否定 位点,把这样的称为样本,这样就会得到一组点集,利用t-test等统计方法, 判断孕妇与疑父的点是否与其他不相关男性的点有离群,具体阈值如Z是否 大于3,如果大于3就表明这个孕妇胎儿与这个男性关系不同与其他不相关男 性。可选的可将确定不支持的孕妇与疑父的点作为参考,如果样本与这个点 集离群就提示不支持关系。可选的可以将确定支持关系的孕妇和疑父的样本 作为支持参考集,样本和这个点集关系也可以计算得到Z值,通过两个Z值 的比较来确定胎儿与疑父关系。
判断方法三:将步骤24的到的位点,参考《法医SNP分型与应用规范》, 计算每个位点随机群体中男性候选者的亲子指数(PI),PI=Pr(Plasma| Mother,T)/Pr(Plasma|Mother,R)。Pr(Plasma|Mother,T)男性 候选人是生父的概率,Pr(Plasma|Mother,R)其代表随机人是生物父亲 的概率;然后将筛选位点的PI相乘的到累积亲权关系(CPI), CPI大于10000认为是亲生父亲。
在本实施例中于步骤三种增加有效的环化扩增技术(RCA处理),从而达 到于步骤二中采少量孕妇外周血浆同样获得处理后(即可测序的DNA片段), 具体如下:
经过上述步骤三从血浆中得到的的DNA量就会高于没有经过RCA扩增的 的得到DNA量,以两个样本的实验结果展示二者区别如下表显示:
本发明虽然以较佳实施例公开如上,但其并不是用来限定本发明,任何 本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内,都可以做出可能的变动和 修改,因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围为准。
Claims (9)
1.一种产前亲权关系鉴定的方法,其特征在于:其包括如下步骤:
步骤一,设计位点及引物;
步骤二,提取孕妇样本和待定男性样本的样品DNA ;
步骤三,样品DNA的片段制备;
步骤四,样品DNA片段于测序前的处理;
步骤五,测序;
步骤六,测序数据后处理,并筛选出孕妇样本和待定男性样本的纯合SNP 位点;
步骤七,将孕妇样本和待定男性样本在每个相同的纯合SNP 位点进行对比,最高碱基类型相同的位点定义为一个肯定位点,最高碱基类型不同则将该位点定义为一个否定位点,统计出肯定位点和否定位点的数目;
步骤八,根据步骤七的到的肯定位点或者否定位点进行亲权关系判断。
2.根据权利要求1所述的一种产前亲权关系鉴定的方法,其特征在于:所述的步骤三具体包括:环化样品DNA,消化环化到的环化产物,扩增消化到的循环核酸,并打断扩增到的循环核酸。
3.根据权利要求1所述的一种产前亲权关系鉴定的方法,其特征在于:所述的步骤五中所述测序为高通量测序。
4.根据权利要求3所述的一种产前亲权关系鉴定的方法,其特征在于:所述的步骤四包括:扩增含有SNP 位点的片段,纯化扩增到的PCR 产物,并将PCR 产物末端修复,筛选得到平末端DNA 片段,接头连接,得加接头的DNA 片段,PCR 扩增及纯化得到小片段文库,检测小片段文库的文库浓度和片段大小。
5.根据权利要求1所述的一种产前亲权关系鉴定的方法,其特征在于:所述的步骤五中所述测序为Nanopore测序。
6.根据权利要求4所述的一种产前亲权关系鉴定的方法,其特征在于:所述的步骤五包括:
打开Nanopore测序仪启动口,检查阀盖下是否有小气泡;
步骤四所获得的样品DNA片段准备和加样SpotON flow cell:准备priming mix:将RBF, Nuclease-free water混匀后,吸800ul注入到priming port,室温静置5min;文库准备:RBF, LLB ,Nuclease-free water ,DNA library混匀后,吸取75ul滴入进样孔,盖上盖子,准备测序:
根据MinKNOW指示运行程序,进行测序;
从nanopore测序仪上获得fastq测序结果的文件;
将上步每一条长序列得到的多条短序列采用多对齐算法,彼此对齐,校准碱基。
7.根据权利要求5所述的一种产前亲权关系鉴定的方法,其特征在于:所述的步骤四包括:将样品DNA片段末端修复,筛选及纯化得到粘性末端,接头连接,得加接头的DNA 片段,将加接头的DNA 片段进行筛选及纯化得待测序DNA。
8.根据权利要求1所述的一种产前亲权关系鉴定的方法,其特征在于:所述的步骤二中孕妇样本为孕妇外周血或孕妇白细胞样本。
9.根据权利要求7所述的一种产前亲权关系鉴定的方法,其特征在于:所述的步骤二中孕妇样本为孕妇外周血时,需采10ul-1.2ml血浆,再利用磁珠法提取孕妇血浆样本中游离DNA。
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