CN107904231B - 一种从血清血浆中提取游离dna的方法 - Google Patents

一种从血清血浆中提取游离dna的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107904231B
CN107904231B CN201711241217.1A CN201711241217A CN107904231B CN 107904231 B CN107904231 B CN 107904231B CN 201711241217 A CN201711241217 A CN 201711241217A CN 107904231 B CN107904231 B CN 107904231B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dissociative dna
concentration
added
dna
film
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711241217.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107904231A (zh
Inventor
艾鹏
陶勇
黄玉萍
王美锦
刘腾飞
陆嫚云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Decare Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Decare Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Decare Medical Technology Co ltd filed Critical Guangzhou Decare Medical Technology Co ltd
Priority to CN201711241217.1A priority Critical patent/CN107904231B/zh
Publication of CN107904231A publication Critical patent/CN107904231A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107904231B publication Critical patent/CN107904231B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种从血清血浆中提取游离DNA的方法。本发明提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法是：采用特定的裂解液对待测样本进行裂解，然后再采用自制的吸附柱膜对游离的DNA进行富集纯化，从而获得高质量的游离DNA。采用本发明提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法提取的游离DNA具有得率高、纯度高的优点；同时本发明提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法还可以防止自由基对游离DNA的破坏，保证提取的游离DNA的完整性，有利于后续的产前诊断和早期肿瘤筛查，对临床医学具有重大意义。

Description

一种从血清血浆中提取游离DNA的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种从血清血浆中提取游离DNA的方法。
背景技术
核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是一类带有遗传信息的生物大分子。真核生物的DNA主要以染色体的形式存在于细胞核内，但也有一小部分DNA位于细胞外，被称之为游离DNA(Cell-freeDNA)，这些游离DNA可以单链或双链DNA的形式存在，大多数游离DNA是以核蛋白形式存在的双链DNA且片段较小，长度一般在几十或几百个bp之间。
研究发现，游离DNA中含有非常重要的遗传信息；1997年YMDLo等人在怀有男胎的孕妇外周血中检测到了Y染色体存在，证明了孕妇外周血中存在胎儿游离DNA。目前临床上游离DNA主要运用于父源性DNA检测，如SRY基因型鉴定胎儿性别，检测RhD血型，产前诊断如21三体等非整倍体疾病检测等。也有研究证明：游离DNA与肿瘤基因组DNA具有相同的遗传变异，例如，基因突变、基因启动子甲基化等，因此，游离核酸可被用于一种预测肿瘤发生的新型标记物。
而使用游离的DNA进行检测的第一步就是要对人类血清血浆中的游离DNA进行提取纯化，提取产物的质量直接影响到后续检测结果的准确性和可靠性。而游离DNA的片段小、在血清和血浆中含量低，这无疑给试剂盒提取的得率提出了更高的要求。
专利文献CN105112400A公开了一种提取游离DNA的试剂盒，所述提取游离DNA的试剂盒采取两步法磁珠吸附进行血浆或尿液中游离DNA的提取，第一步采用低浓度的异丙醇，磁珠主要吸附500bp以上的DNA大片段；第二步调高异丙醇的浓度，磁珠主要吸附500bp以下DNA小片段，从而实现两步法提取大于500bp和小于500bp两种DNA片段，该试剂盒可用于产前诊断和早期肿瘤筛查，在临床医学领域具有广阔的应用前景。但是，采用磁珠法提取核酸技术，其采用磁性纳米颗粒，利用在高盐低pH下吸附核酸，然后在低盐高pH下分离核酸的原理进行样本核酸的分离纯化，但因其操作过于复杂，并且需要一定温度下使用ProteinaseK进行孵育，同时需要多步洗涤等步骤，导致核酸提取的重复性差及提取效率低。
专利文献CN106011131A公开了一种从血浆中分离游离核酸的方法，该方法使用二氧化硅基质膜离心柱分离纯化游离核酸，该方法在提取核酸时，无需有机提取，完全去除污染物和抑制剂的使用，大大简化了从血浆中浓缩和纯化游离DNA的过程，但是，该吸附膜对游离DNA的富集效果不佳，导致提取的游离DNA的浓度较低。
发明内容
为了克服现有技术中从血清血浆中提取游离DNA的方法存在的缺陷。本发明的目的在于提供一种从血清血浆中提取游离DNA的方法，以解决上述缺陷。
本发明提供了一种从血清血浆中提取游离DNA的方法，包括以下步骤：
S1取待测样本至1.5ml离心管中，加入裂解液A，所述待测样本与裂解液A的体积比为1:3，上下颠倒混匀或涡旋混匀，在65℃温度下水浴5min，得混合液I；
S2将步骤S1得到的混合液I转移至吸附柱中，室温放置5min，在转速为11000～13000rpm的条件下离心1min，倒掉收集管中的废液；
S3将步骤S2处理后的吸附柱放回收集管中，加入漂洗液PC，所述漂洗液PC与待测样本的体积比为7:2，在转速为11000～13000rpm的条件下离心30s，倒掉收集管中的废液；
S4将步骤S3处理后的吸附柱放回收集管中，加入体积浓度为70～80％的乙醇，所述乙醇与待测样本的体积比为13:4，在转速为11000～13000rpm的条件下离心1min；
S5重复步骤S4一次，然后将吸附柱转移至洁净的1.5ml离心管中打开吸附柱管盖，室温放置1～3min，向吸附柱膜中间加入30～50μl洗脱液，盖上管盖，在56℃温度下放置5min；在转速为11000～13000rpm的条件下离心30s，丢弃吸附柱，即得。
进一步地，所述步骤S1中的裂解液A的制备方法为：
将浓度为60～80mmol/LTris-Hcl，0.3～0.6g氯化钠，0.8～1.5g乙二胺四乙酸二钠，10～20g白藜芦醇，8～16g葛根素，体积浓度为2～8％的烷基糖苷，体积浓度为40％的异丙醇溶液加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50ml，调节pH值为4.0～6.8，即得。
进一步地，所述步骤S1中的裂解液A的制备方法为：
将浓度为70mmol/LTris-Hcl，0.5g氯化钠，1.2g乙二胺四乙酸二钠，16g白藜芦醇，12g葛根素，体积浓度为6％的烷基糖苷，体积浓度为40％的异丙醇溶液加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50ml，调节pH值为5.2，即得。
进一步地，所述步骤S2中吸附柱的膜为二氧化硅纳米材料膜，所述二氧化硅纳米材料膜的制备方法为：
A将笼型介孔二氧化硅纳米材料加入去离子水中搅拌均匀，接着加入N-羧甲基壳聚糖搅拌均匀后，在65～75℃温度下搅拌3～4h，过滤，并用去离子水洗2～3遍，冻干后收集粉末，得修饰后的氧化硅纳米材料；
B将N-羧甲基壳聚糖溶于去离子中搅拌均匀，得成膜液；
C将步骤A的到的修饰后的氧化硅纳米材料加入步骤B得到的成膜液，烘干，成膜，即得。
进一步地，所述步骤A中笼型介孔二氧化硅纳米材料与N-羧甲基壳聚糖的重量比为3:2。
进一步地，所述步骤B中的成膜液为质量浓度为4～6％的N-羧甲基壳聚糖溶液。
进一步地，所述步骤C中修饰后的氧化硅纳米材料与成膜液的固液比为1g:5ml。
进一步地，所述步骤S3中的漂洗液PC的制备方法为：
将浓度为60～80mmol/LTris-Hcl，0.3～0.6g氯化钠，0.8～1.5g乙二胺四乙酸二钠，10～20g白藜芦醇，体积浓度为2～8％的烷基糖苷，体积浓度为30％的异丙醇溶液加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50ml，调节pH值为4.0～6.8，即得。
进一步地，所述步骤S3中的漂洗液PC的制备方法为：
将浓度为70mmol/LTris-Hcl，0.4g氯化钠，1.0g乙二胺四乙酸二钠，15g白藜芦醇，体积浓度为4％的烷基糖苷，体积浓度为30％的异丙醇溶液加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50ml，调节pH值为5.5，即得。
进一步地，所述步骤S5中的洗脱液为：将10～30mmol/LTris-Hcl，10～30mg乙二胺四乙酸加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50ml，调节pH值为6.5～8，即得。
本发明采用的笼型介孔二氧化硅纳米材料购于西安格润纳米科技有限公司，笼型介孔SiO2材料(KIT-5)。
目前针对游离DNA的提取，现有技术改进的思路一般在于两方面，一方面在于尽量去除蛋白和脂类等杂质，来提高核酸纯度；另一方面在于游离DNA的富集，提高得率。目前一般采用以异硫氰酸胍或盐酸胍为主要成分的裂解液进行裂解去杂质，再采用二氧化硅基质膜离心柱进行纯化，富集。但是整体效果不够理想，提取的游离DNA纯度较低，结构不够完整，不利于后期的产前诊断与早期肿瘤的筛查。
经发明人深入研究发现，正常人的血清和血浆含有大量的自由基，其会导致脂质过氧化反应，游离DNA交联或氧化，蛋白质和氨基酸的交联和氧化，多糖分子的氧化和降解等
反应，导致杂质增加，同时也增大去除杂质的难度，而且其还会严重破坏游离DNA的结构，导致序列断裂，从而降低游离DNA提取的纯度和浓度。而本发明提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法：采用特定的裂解液对样本杂质进行裂解，再采用自制的吸附柱膜对游离的DNA进行富集纯化，可以获得高质量的游离DNA，可以有效的解决现有技术中存在的缺陷。
本发明采用的裂解液中的白藜芦醇、葛根素与烷基糖苷相协调作用可以有效的裂解血清或血浆样本中的脂类、蛋白质及盐类等杂质，同时还可裂解与游离DNA复合的蛋白质，释放出游离DNA；同时，其还可以有效的清除血清或血浆中的自由基，防止自由基对游离DNA结构的破坏，提高游离DNA的纯度和浓度。
另外，本发明采用N-羧甲基壳聚糖作为吸附膜的主要成分，其是两性聚电解质，生物相容性好，可以高效的吸附游离DNA，同时还具有抗自由基的作用，可以进一步地保护DNA的结构不受损坏，保证提取的游离DNA的完整性。
而且，经N-羧甲基壳聚糖修饰后的具有介孔结构的二氧化硅纳米材料，大大降低了二氧化硅纳米材料表面的负电荷性，从而改善二氧化硅纳米材料的相容性，提高二氧化硅纳米材料对游离DNA的吸附作用，将修饰后的氧化硅纳米材料按一定的比例嵌入N-羧甲基壳聚糖膜内，可以极大提高吸附膜对游离DNA的吸附作用，大大提高了游离DNA的纯度和产量。同时，修饰后的氧化硅纳米材料与N-羧甲基壳聚糖成膜液的固液比为低于或高于1g:5ml均会影响对游离DNA的吸附效果。
与现有技术相比，本发明提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法具有以下优势：
(1)本发明提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法提取游离DNA的得率高、纯度高，而且提取工艺简单，适合大规模的推广和应用。
(2)本发明提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法在提取游离DNA的过程中可以防止自由基对游离DNA结构的破坏，保证提取的游离DNA的完整性，利于后续的产前诊断与早期肿瘤的筛查。
附图说明：
图1为试验例一的扩增曲线图；
图2为试验例二的扩增曲线图；
图3为试验例三的扩增曲线图。
具体实施方式：
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1、二氧化硅纳米材料膜的制备：
A将笼型介孔二氧化硅纳米材料加入去离子水中搅拌均匀，接着加入N-羧甲基壳聚糖搅拌均匀后，在70℃温度下搅拌4h，所述氧化硅纳米材料与N-羧甲基壳聚糖的重量比为3:2，过滤，并用去离子水洗2遍，冻干后收集粉末，得修饰后的氧化硅纳米材料；
B将N-羧甲基壳聚糖溶于去离子中搅拌均匀，制得质量浓度为5％的N-羧甲基壳聚糖成膜液；
C将步骤A的到的修饰后的氧化硅纳米材料加入步骤B得到的成膜液，所述修饰后的氧化硅纳米材料与成膜液的固液比为1g:5ml，烘干，成膜，即得。
实施例2、一种从血清血浆中提取游离DNA的方法
S1取200μl血清样本至1.5ml离心管中，加入600μl裂解液A，上下颠倒混匀或涡旋混匀，在65℃温度下水浴5min，得混合液I；
所述裂解液A的制备方法为：将浓度为60mmol/LTris-Hcl，0.3g氯化钠，0.8g乙二胺四乙酸二钠，10g白藜芦醇，8g葛根素，体积浓度为4％的烷基糖苷，体积浓度为40％的异丙醇溶液加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50ml，调节pH值为6.0，制得；
S2将步骤S1得到的混合液I转移至吸附柱中，室温放置5min，在转速为12000rpm的条件下离心1min，倒掉收集管中的废液；
S3将步骤S2处理后的吸附柱放回收集管中，加入700μl漂洗液PC，在转速为12000rpm的条件下离心30s，倒掉收集管中的废液；
所述漂洗液PC的制备方法为：将浓度为60mmol/LTris-Hcl，0.3g氯化钠，0.8g乙二胺四乙酸二钠，10g白藜芦醇，体积浓度为4％的烷基糖苷，体积浓度为30％的异丙醇溶液加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50ml，调节pH值为6.0，制得；
S4将步骤S3处理后的吸附柱放回收集管中，加入650μl体积浓度为70％的乙醇，在转速为12000rpm的条件下离心1min；
S5重复步骤S4一次，然后将吸附柱转移至洁净的1.5ml离心管中打开吸附柱管盖，室温放置2min，向吸附柱膜中间加入35μl洗脱液，所述洗脱液为：将10mmol/LTris-Hcl，10mg乙二胺四乙酸加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50ml，调节pH值为7.2，制得；盖上管盖，在56℃温度下放置5min；在转速为12000rpm的条件下离心30s，丢弃吸附柱，即得。
实施例3、一种从血清血浆中提取游离DNA的方法
S1取200μl血浆样本至1.5ml离心管中，加入600μl裂解液A，上下颠倒混匀或涡旋混匀，在65℃温度下水浴5min，得混合液I；
所述裂解液A的制备方法为：将浓度为70mmol/LTris-Hcl，0.5g氯化钠，1.2g乙二胺四乙酸二钠，16g白藜芦醇，12g葛根素，体积浓度为6％的烷基糖苷，体积浓度为40％的异丙醇溶液加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50ml，调节pH值为5.2，制得；
S2将步骤S1得到的混合液I转移至吸附柱中，室温放置5min，在转速为12000rpm的条件下离心1min，倒掉收集管中的废液；
S3将步骤S2处理后的吸附柱放回收集管中，加入700μl漂洗液PC，在转速为12000rpm的条件下离心30s，倒掉收集管中的废液；
所述漂洗液PC的制备方法为：将浓度为70mmol/LTris-Hcl，0.4g氯化钠，1.0g乙二胺四乙酸二钠，15g白藜芦醇，体积浓度为4％的烷基糖苷，体积浓度为30％的异丙醇溶液加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50ml，调节pH值为5.5，制得；
S4将步骤S3处理后的吸附柱放回收集管中，加入650μl体积浓度为75％的乙醇，在转速为12000rpm的条件下离心1min；
S5重复步骤S4一次，然后将吸附柱转移至洁净的1.5ml离心管中打开吸附柱管盖，室温放置2min，向吸附柱膜中间加入40μl洗脱液，所述洗脱液为：将20mmol/LTris-Hcl，20mg乙二胺四乙酸加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50ml，调节pH值为7.0，制得；盖上管盖，在56℃温度下放置5min；在转速为12000rpm的条件下离心30s，丢弃吸附柱，即得。
对比例1、一种从血清血浆中提取游离DNA的方法
制备方法的区别在于：所述步骤S1中的裂解液A的制备方法为：将浓度为70mmol/LTris-Hcl，0.5g氯化钠，1.2g乙二胺四乙酸二钠，28g白藜芦醇，体积浓度为6％的烷基糖苷，体积浓度为40％的异丙醇溶液加烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50ml，调节pH值为5.2制得；其余步骤如实施例3。
对比例2、一种从血清血浆中提取游离DNA的方法
制备方法的区别在于：所述步骤S1中的裂解液A的制备方法为：将浓度为70mmol/LTris-Hcl，0.5g氯化钠，1.2g乙二胺四乙酸二钠，16g异硫氰酸胍，12g葛根素，体积浓度为6％的烷基糖苷，体积浓度为40％的异丙醇溶液加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50ml，调节pH值为5.2制得；其余步骤如实施例3。
对比例3、一种从血清血浆中提取游离DNA的方法
制备方法的区别在于：所述步骤S1中的裂解液A的制备方法为：将浓度为70mmol/LTris-Hcl，0.5g氯化钠，1.2g乙二胺四乙酸二钠，16g白藜芦醇，12g盐酸胍，体积浓度为6％的烷基糖苷，体积浓度为40％的异丙醇溶液加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50ml，调节pH值为5.2，制得；其余步骤如实施例3。
对比例4、一种从血清血浆中提取游离DNA的方法
制备方法的区别在于：所述步骤S2中的吸附柱的膜为笼型介孔SiO2材料；其余步骤如实施例3。
对比例5、一种从血清血浆中提取游离DNA的方法
制备方法的区别在于：所述步骤S2中的吸附柱的膜采用专利号为201610004927.1制备得到的二氧化硅纳米纤维膜；其余步骤如实施例3。
试验例一、从血浆中提取游离DNA的试验
1、试验材料：取两个成人外周血浆样本，各取200μl，分别标记为样本1和样本2。
2、试验方法：采用实施例3提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法进行游离DNA提取，然后采用安捷伦2100生物分析仪检测游离DNA的浓度，采用GAPDH体系进行PCR检测。
3、试验结果：
试验结果如表1和图1所示。
3.1、游离DNA的浓度测定：
表1游离DNA的浓度试验数据
样本 C(ng/μl)
样本1 2.13
样本2 1.95
3.2、PCR检测：
(1)检测体系：
(2)上机程序：ABI(StepOnePlus)
50℃10min；95℃1min；95℃15s、65℃1min(收集荧光)、40Cycle。结果如图1所示，从图1可知，本发明提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法可以有效的提取出人类血浆中游离的DNA。
试验例二、从血浆中提取游离DNA的试验
1、试验材料：取三个成人外周血血清样本，各取200μl，分别标记为样本3、样本4和样本5。
2、试验方法：采用实施例3提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法进行游离DNA提取，然后采用安捷伦2100生物分析仪检测游离DNA的浓度，采用GAPDH体系进行PCR检测。
3、试验结果：
试验结果如表2和图2所示。
3.1、游离DNA的浓度测定：
表2游离DNA的浓度试验数据
3.2、PCR检测：
(1)检测体系：
(2)上机程序：ABI(StepOnePlus)
50℃10min；95℃1min；95℃15s、65℃1min(收集荧光)、40Cycle。结果如图2所示，从图2可知，本发明提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法可以有效的提取出人类血浆中游离的DNA。
实施例三、游离DNA提取的对比试验
1、试验材料：选取三个成人外周血浆样本，各取200μl，分别标记为样本A、样本B。
2、试验方法：采用实施例3提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法和天根的游离核酸提取试剂盒进行提取游离DNA，然后采用安捷伦2100生物分析仪检测游离DNA的浓度，采用GAPDH体系进行PCR检测。
3、试验结果：
试验结果如表3和图3所示。
3.1、游离DNA的浓度测定：
表3游离DNA的浓度试验数据
3.2、PCR检测：
(1)检测体系：
(2)上机程序：ABI(StepOnePlus)
50℃10min；95℃1min；95℃15s、65℃1min(收集荧光)、40Cycle。结果如图3所示，对于同一待测样本，使用本发明所提取的游离DNA的含量高于天根试剂盒的含量，且本发明制得的PCR曲线也比天根试剂盒制得的PCR曲线大幅度靠前，说明本发明提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法提取游离DNA的效率高于天根试剂盒。
实施例四、游离DNA提取的对比试验
1、试验材料：取同一成人外周血血浆样本，分成6份，每份200μl。
2、试验方法：采用实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法提取游离DNA，并做好相应的标记，使用安捷伦2100生物分析仪检测游离DNA的浓度；并用超微量紫外分光光度计检测OD260/280,核酸OD260/280的值正常范围一般在1.6～2.0，且值越接近1.8其纯度越高。
3、试验结果：
试验结果如表4所示。
表4游离DNA的浓度试验数据
C(ng/μl) OD260/280
实施例3 3.08 1.81
对比例1 1.03 1.85
对比例2 1.36 1.91
对比例3 1.65 1.93
对比例4 1.42 1.67
对比例5 1.98 1.75
由表4可知，本发明提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法提取游离DNA提取量多，纯度高；而且从对比例1～5提供的从血清血浆中提取游离DNA的方法提取游离DNA浓度大大下降，纯度也较实施例3差。

Claims (4)

1.一种从血清血浆中提取游离DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1取待测样本至1.5ml离心管中，加入裂解液A，所述待测样本与裂解液A的体积比为1:3，上下颠倒混匀或涡旋混匀，在65℃温度下水浴5min，得混合液I；
S2将步骤S1得到的混合液I转移至吸附柱中，室温放置5min，在转速为11000 ~13000rpm的条件下离心1 min，倒掉收集管中的废液；
S3将步骤S2处理后的吸附柱放回收集管中，加入漂洗液PC，所述漂洗液PC与待测样本的体积比为7:2，在转速为11000 ~13000rpm的条件下离心30s，倒掉收集管中的废液；
S4将步骤S3处理后的吸附柱放回收集管中，加入体积浓度为70~80%的乙醇，所述乙醇与待测样本的体积比为13:4，在转速为11000 ~13000rpm的条件下离心1min；
S5重复步骤S4一次，然后将吸附柱转移至洁净的1.5ml离心管中打开吸附柱管盖，室温放置1~3min，向吸附柱膜中间加入30~50μl洗脱液，盖上管盖，在56℃温度下放置5min；在转速为11000 ~13000rpm的条件下离心30s，丢弃吸附柱，即得；
所述步骤S2中吸附柱的膜为二氧化硅纳米材料膜，所述二氧化硅纳米材料膜的制备方法为：
A将笼型介孔二氧化硅纳米材料加入去离子水中搅拌均匀，接着加入N-羧甲基壳聚糖搅拌均匀后，在65~75℃温度下搅拌3~4h，过滤，并用去离子水洗2~3遍，冻干后收集粉末，得修饰后的氧化硅纳米材料；
B将N-羧甲基壳聚糖溶于去离子中搅拌均匀，得成膜液；
C将步骤A的到的修饰后的氧化硅纳米材料加入步骤B得到的成膜液，烘干，成膜，即得；
所述步骤A中笼型介孔二氧化硅纳米材料与N-羧甲基壳聚糖的重量比为3:2；
所述步骤B中的成膜液为质量浓度为4~6%的N-羧甲基壳聚糖溶液；
所述步骤C中修饰后的氧化硅纳米材料与成膜液的固液比为1g:5ml；
所述步骤S1中的裂解液A的制备方法为：
将浓度为60~80mmol/L Tris-Hcl，0.3~0.6g氯化钠，0.8~1.5g乙二胺四乙酸二钠，10~20g白藜芦醇，8~16g葛根素，体积浓度为2~8%的烷基糖苷，体积浓度为40%的异丙醇溶液加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50 ml，调节pH值为4.0~6.8，即得；
所述步骤S3中的漂洗液PC的制备方法为：
将浓度为60~80mmol/L Tris-Hcl，0.3~0.6g氯化钠，0.8~1.5g乙二胺四乙酸二钠，10~20g白藜芦醇，体积浓度为2~8%的烷基糖苷，体积浓度为30%的异丙醇溶液加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50 ml，调节pH值为4.0~6.8，即得。
2.如权利要求1所述的从血清血浆中提取游离DNA的方法，其特征在于，所述步骤S1中的裂解液A的制备方法为：
将浓度为70mmol/L Tris-Hcl，0.5g氯化钠，1.2g乙二胺四乙酸二钠，16g白藜芦醇，12g葛根素，体积浓度为6%的烷基糖苷，体积浓度为40%的异丙醇溶液加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50 ml，调节pH值为5.2，即得。
3.如权利要求1所述的从血清血浆中提取游离DNA的方法，其特征在于，所述步骤S3中的漂洗液PC的制备方法为：
将浓度为70mmol/L Tris-Hcl，0.4g氯化钠，1.0g乙二胺四乙酸二钠，15g白藜芦醇，体积浓度为4%的烷基糖苷，体积浓度为30%的异丙醇溶液加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50 ml，调节pH值为5.5，即得。
4.如权利要求1所述的从血清血浆中提取游离DNA的方法，其特征在于，所述步骤S5中的洗脱液为：将10~30mmol/L Tris-Hcl，10~30mg乙二胺四乙酸加入烧杯中溶解，转入容量瓶中，DEPC处理水定容到50 ml，调节pH值为6.5~8，即得。
CN201711241217.1A 2017-11-30 2017-11-30 一种从血清血浆中提取游离dna的方法 Active CN107904231B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711241217.1A CN107904231B (zh) 2017-11-30 2017-11-30 一种从血清血浆中提取游离dna的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711241217.1A CN107904231B (zh) 2017-11-30 2017-11-30 一种从血清血浆中提取游离dna的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107904231A CN107904231A (zh) 2018-04-13
CN107904231B true CN107904231B (zh) 2018-11-02

Family

ID=61848244

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711241217.1A Active CN107904231B (zh) 2017-11-30 2017-11-30 一种从血清血浆中提取游离dna的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107904231B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104531681A (zh) * 2014-12-31 2015-04-22 广东粤检生物科技有限公司 提取茶叶核酸的试剂及用该试剂提取茶叶核酸的提取方法
CN106011131A (zh) * 2016-07-29 2016-10-12 北京旌准医疗科技有限公司 一种从血浆中分离游离核酸的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104531681A (zh) * 2014-12-31 2015-04-22 广东粤检生物科技有限公司 提取茶叶核酸的试剂及用该试剂提取茶叶核酸的提取方法
CN106011131A (zh) * 2016-07-29 2016-10-12 北京旌准医疗科技有限公司 一种从血浆中分离游离核酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107904231A (zh) 2018-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103820431B (zh) 基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒
EP3684948B1 (en) Method for using aqueous two-phase system for the isolation, purification and/or concentration of short nucleic acid fragments
CN106834277A (zh) 一种用磁珠法分离游离dna的方法及分离试剂盒
CN108060159B (zh) 一种富含多糖多酚植物的dna提取方法
CN107779451A (zh) 一种人类游离dna提取方法及其试剂盒
CN106591297A (zh) 一种磁珠法核酸提取方法
CN107904229A (zh) 基因组dna提取方法及提取试剂盒
CN102154264B (zh) 一种快速提取血液总核糖核酸的方法
US20110117628A1 (en) Method for concentrating and isolating biomolecules or viruses
CN107794260A (zh) 一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法
CN106011131A (zh) 一种从血浆中分离游离核酸的方法
JP2006311803A (ja) 核酸精製方法、及び核酸精製器具
CN110904097A (zh) 一种用于血液游离dna提取的试剂盒
CN109762874B (zh) 核酸助沉剂、孕妇血浆游离dna提取试剂盒及方法
CN112646803B (zh) 一种病毒基因组核酸提取试剂盒、方法及应用
CN113151397A (zh) 一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒
CN112899266A (zh) 一种核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用
CN110468125A (zh) 一种用于病毒核酸提取的试剂盒及其提取方法
CN107904231B (zh) 一种从血清血浆中提取游离dna的方法
CN105002160A (zh) 中成药或含中药材保健品的dna的提取方法
CN113604465A (zh) 一种基于十六烷基三甲基溴化铵的磁珠核酸提取方法
CN102115739B (zh) 分离核酸的方法、试剂及套组
CN112941067A (zh) 一种全血核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用
BE1027863B1 (fr) Une inuline de farine de helianthus tuberosus (L. 1753) L. pour améliorer la dyspepsie fonctionnelle et un procédé de préparation et une utilisation de celle-ci
CN107119039A (zh) 一种组织不研磨直接提取核酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant