CN108070584A - 一种血浆或血清游离dna和rna的硅胶吸附柱提取试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种血浆或血清游离DNA和RNA的硅胶吸附柱提取试剂盒及提取方法，涉及分子生物领域，试剂盒包括蛋白酶K、异丙醇、无水乙醇、三蒸水，还包括：含有核酸分离促进剂的裂解液；含有核酸吸附促进剂的吸附液，以及洗涤液；其方法主要利用的试剂盒进行。利用本发明提供的试剂盒可以迅速彻底地释放出血浆或血清中的游离DNA和RNA，并且使变性蛋白质保持溶解状态，在吸附液的作用下游离DNA和RNA高效地吸附在硅胶吸附柱的上，经洗涤液洗涤后，得到较高纯度和浓度的游离DNA和RNA。

Description

一种血浆或血清游离DNA和RNA的硅胶吸附柱提取试剂盒及 方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种血浆或血清游离DNA和RNA的硅胶吸附柱提取试剂盒及方法。

技术背景

游离DNA简称cf DNA(Free circulating/Cell-free DNA)最早被发现于1948年，是一种无细胞状态的、片段化的胞外DNA，主要存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中。目前游离DNA在无创产前检测和肿瘤的液态活检方面的应用是临床上两个火热的领域。除了此之外，游离DNA在器官移植、中风、自身免疫病和心肌梗死等疾病上的应用价值也日益清晰。

游离RNA(cell-freeRNA，cfRNA)是存在于细胞外的转录产物，包括mRNA和microRNA。MicroRNA在人的多种体液(血浆、血清、胸腹水、尿液，羊水和唾液等)中被发现，被广泛研究并成为疾病无创性诊断和研究的新分子标志物，为肿瘤、血液病和心血管疾病的研究开辟了新领域。

随着血浆(或血清)游离DNA和RNA在临床上的应用越来越广泛，血浆(血清)游离DNA和RNA提取也显得越来越重要。游离DNA和RNA在正常人的血液中含量甚微，能否获得高质量的游离DNA或RNA是进行分子生物学研究的第一步，也是关键的一步，直接影响实验成败。

成功的血浆(或血清)游离DNA或RNA提取需要四个重要的步骤：核酸与结合蛋白的分离，核酸的吸附，核酸酶的灭活以及污染物的去除。理想的抽提方法可以获取高质量的游离核酸，同时没有蛋白、糖、脂和其它核酸的污染。

目前市场上多采用酚-氯仿法、硅胶磁珠吸附法(磁珠法)和硅胶膜吸附柱法(柱式法)提取血浆(或血清)游离DNA或RNA。酚-氯仿游离DNA或RNA抽提方法操作繁琐，使用的有机溶剂对人体伤害大，提取效率低，重复性差，不适合血浆(或血清)微量DNA或RNA的提取。硅胶磁珠吸附法和硅胶膜吸附柱法是目前提取游离DNA或RNA主要的两种方法，这两种方法在提取游离DNA或RNA方面各有千秋。磁珠法对血浆(或血清)游离小片段DNA或RNA的提取效率高，相对丢失率少，重复性好，单位面积磁珠的吸附量大，尤其适合于自动化。但磁珠法提取的游离DNA或RNA仅适合于少量低浓度的游离核酸提取，因为磁珠法的血浆(或血清)浓缩倍数十分有限。硅胶膜吸附柱法虽然对小片段DNA提取效率低于磁珠法，但是其简便快速，提取的游离DNA或RNA纯度高，重复性好，并且能有效的去除各种PCR抑制物，尤其适合血浆(或血清)用量大的高浓度的游离DNA或RNA提取。如果要获得大量高浓度的游离DNA或RNA，硅胶膜吸附柱法是目前唯一的选择。目前硅胶膜吸附柱法最主要的产品为Qiagen公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit，由于其在游离DNA或RNA提取领域具有非常大的垄断性，因此价格十分昂贵。

为了有效提高硅胶膜吸附柱法对小片段DNA的提取效率，同时打破国外的垄断，本发明人积极加以研究创新，以期成功研发一种高效的硅胶吸附柱法血浆(或血清)游离DNA和RNA提取方法，使其更具市场推广价值。

发明内容

为了有效提高硅胶膜吸附柱法对小片段DNA的提取效率，同时打破国外的垄断，发明人进行了大量实验，针对可能的影响因素对提取方法不断进行完善和优化，由此完成了本发明。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种游离DNA和RNA的硅胶吸附柱提取试剂盒，包括：

具有核酸分离促进剂的裂解液；

具有核酸吸附促进剂的吸附液；以及

洗涤液；

其中，洗涤液具有：

除去硅胶膜上非特异性结合蛋白的洗涤液I；

除去硅胶膜上残留的胍、氯化钠等盐离子的洗涤液II。

需要说明的是，本发明所述的核酸是血清或血浆样本中游离DNA和游离RNA的总和。

其中，所述裂解液中的核酸分离促进剂是十二烷基硫酸三乙醇胺和二甲亚砜。

其中，所述裂解液还具有：Tris-HCl，异硫氰酸胍，氯化钠和EDTA成分。

其中，所述裂解液中的成分含量为：10-100mM Tris-HCl，3-5M异硫氰酸胍，0.5-1.5M氯化钠，2-10mM EDTA，2％十二烷基硫酸三乙醇胺和1％二甲亚砜，其中，裂解液的pH为6.0-7.5。

优选的，所述裂解液中的成分含量为：50mM Tris-HCl，4M异硫氰酸胍，1M氯化钠，5mM EDTA，2％十二烷基硫酸三乙醇胺和1％二甲亚砜，其中，裂解液的pH为6..5。

十二烷基硫酸三乙醇胺是一种较强的表面活性剂，能够迅速溶解蛋白质，促使核酸与蛋白质分离，释放大量的核酸，同时使变性后的蛋白质处于溶解状态，二甲亚砜能够使蛋白质变性，同时增加其它物质特别是胍类的溶解度。因此加入了本申请裂解液的待测样本，在裂解时能保证核酸与结合蛋白快速彻底分离，释放大量核酸；而且在裂解后能使是变性蛋白质仍然具有较高的溶解度，从而避免了待测样本在后续过程中因溶解性差而导致的难以通过硅胶膜的问题。

Tris-HCl可以提供pH5.0-7.0稳定的缓冲液，使核酸磷酸基团与硅胶膜处于带电性状态，利于氢键的形成；异硫氰酸胍可以提供高盐环境，在十二烷基硫酸三乙醇胺和二甲亚砜的共同作用下使蛋白质和核酸变性，促进核酸与蛋白质彻底快速分离；同时异硫氰酸胍使变性核酸表现出比其正确折叠或天然构象时更高的热动力学稳定性，促使核酸的磷酸基团与硅胶吸附柱中的硅烷醇基团之间更容易形成氢键，利于核酸吸附在硅胶柱内表面；氯化钠为核酸的磷酸基团与硅烷醇基团之间的阳离子桥提供Na⁺离子，进一步促进核酸与硅胶柱的吸附作用；同时异硫氰酸胍能灭活核酸内切酶，避免核酸被水解，从而保持核酸处于完整的受保护状态；由于核酸内切酶的活性需要Mg²⁺，因此本申请加入EDTA，用于螯合二价金属离子，从而抑制核酸内切酶活性，达到保护核酸的目的。因此，本申请使用的裂解液不但可以使蛋白质溶解，使蛋白质具有较高的溶解度，还利用异硫氰酸胍和EDTA抑制核酸内切酶活性从而保护核酸不被裂解，同时利用Tris-HCl、氯化钠和异硫氰酸胍分别提供的低pH、高盐环境促进氢键和阳离子盐桥的形成。

其中，所述吸附液中的核酸吸附促进剂为TritonX-100和硫脲。

其中，所述吸附液还具有：磷酸盐缓冲液，异硫氰酸胍和氯化钠。

其中，所述吸附液中的成分含量为：0.05-0.1M磷酸盐缓冲液，3-5M异硫氰酸胍，0.5-1.5M氯化钠，5％TritonX-100和3M硫脲，其pH为6-9。

优选地，所述吸附液中的成分含量为：0.07M磷酸盐缓冲液，4M异硫氰酸胍，1M氯化钠，5％TritonX-100和3M硫脲，其pH为6.5。

TritonX-100可以溶解脂质，同时具有促进氢键和阳离子桥形成的作用。硫脲提高蛋白质变性的能力，同时能增加变性蛋白质的溶解性，与核酸分离促进剂中的十二烷基硫酸三乙醇胺和二甲亚砜一起保证了变性蛋白的进一步溶解，确保吸附不被蛋白质沉淀干扰，同时也避免了因变性蛋白溶解性差堵塞吸附柱硅胶孔而导致的难以通过硅胶膜的问题，确保了溶液过柱通畅。

除了上述已叙述的作用外，吸附液中异硫氰酸胍还起到了补充和维持吸附液中高浓度胍盐的作用，从而促进核酸的吸附，避免胍盐浓度不足导致的氢键与阳离子桥形成不充分引起的吸附失败。

特别是，所述洗涤液I是由Tris-HCl，盐酸胍，氯化钠和乙醇组成。

其中，所述洗涤液I的组成成分的配比为：10-100mM Tris-HCl，pH6.0-7.5，3-5M盐酸胍，0.5-1.5M氯化钠，50-70％乙醇。

优选的，所述洗涤液I的组成成分的配比为：50mM Tris-HCl，pH6.5，4.5M盐酸胍，1M氯化钠，60％乙醇。

Tris-HCl可以提供pH5.0-7.0稳定的缓冲环境，维持核酸磷酸基团与硅胶膜的带电状态，利于氢键的保持；利用盐酸胍提供的高盐环境，保持已形成的氢键和阳离子盐桥，并在氯化钠提供阳离子盐桥所需的钠离子的条件下，巩固核酸与硅胶的吸附；乙醇能够保持核酸在硅胶膜表面的沉淀状态，使其与硅胶形成的氢键更牢固。因此，本发明所使用洗涤液I通过维持核酸与硅胶之间的氢键以及阳离子盐桥使核酸稳定地固定在硅胶吸附膜上，在洗涤掉非特异性结合蛋白的同时保证已吸附的核酸不被洗掉。

特别是，所述洗涤液II是由Tris-HCl，乙醇组成。

其中，所述洗涤液II的组成成分的配比是10-100mM Tris-HCl，pH6.0-7.5，60-80％乙醇。

优选的，所述洗涤液II的组成成分的配比是50mM Tris-HCl，pH6.5，70％乙醇，用于除去硅胶吸附柱中残留的4.5M盐酸胍，1M氯化钠，避免对后续分子生物学实验操作产生影响。

为实现本发明的技术目的，本发明另一方面提供一种利用上述试剂盒对游离DNA或RNA进行硅胶吸附柱提取的方法。

其中，所述利用上述试剂盒对游离DNA或RNA进行硅胶吸附柱提取包括：

向血浆或血清样本中加入具有核酸分离促进剂的裂解液和蛋白酶K进行混匀及孵育处理，使血浆中的游离DNA或RNA与结合蛋白分离，得到混合物；

向混合物中加入具有核酸吸附促进剂的吸附液，并加入异丙醇进行混匀，冰浴处理后转入硅胶吸附柱进行负压抽滤，使混合物中游离DNA或RNA高效地吸附在硅胶吸附柱上；

抽滤完成后，先使用无水乙醇对硅胶吸附柱进行两次洗涤，再依次使用洗涤液I、洗涤液II、无水乙醇对硅胶吸附柱分别进行一次洗涤，第一离心处理后，进行烘干，得到去除杂质的含有游离DNA和RNA的硅胶吸附柱；

利用三蒸水对硅胶吸附柱进行洗脱，第二离心处理后收集洗脱液，得到游离DNA或RNA。

其中，所述裂解液中的核酸分离促进剂是十二烷基硫酸三乙醇胺和二甲亚砜，所述吸附液中的核酸吸附促进剂为TritonX-100和硫脲。

其中，所述血浆或血清样本与具有核酸分离促进剂的裂解液及蛋白酶K的使用量比例按体积份数比为：0.5-1.5：0.5-1.5：0.04-0.12。

优选的，所述血浆或血清样本与具有核酸分离促进剂的裂解液及蛋白酶K的使用量比例按体积份数比为：1：1：0.08。

其中，所述向血浆或血清样本中加入具有核酸分离促进剂的裂解液和蛋白酶K进行混匀的时长为30-60s。

优选地，所述向血浆或血清样本中加入具有核酸分离促进剂的裂解液和蛋白酶K进行混匀的时长为30s。

其中，所述孵育处理温度为56-80℃，孵育处理时长为20-60min。

优选地，所述孵育处理温度为60℃，孵育处理时长为30min。

其中，所述具有核酸吸附促进剂的吸附液的加入量与血浆或血清样本的比例按照体积份数比为1.5-2.5:0.5-1.5。

优选地，所述具有核酸吸附促进剂的吸附液的加入量与血浆或血清样本的比例按照体积份数比为2:1。

其中，所述异丙醇的加入量与吸附液的比例按照体积份数比为3.2-6.3:6-12。

优选地，所述异丙醇的加入量与吸附液的比例按照体积份数比为4.6:8。

其中，所述向混合物中加入具有核酸吸附促进剂的吸附液，并加入异丙醇进行混匀的时长为20-60s。

优选地，所述向混合物中加入具有核酸吸附促进剂的吸附液，并加入异丙醇进行混匀的时长为30s。

其中，所述冰浴处理温度为0-4℃，冰浴处理时间为5-10min。

优选地，所述冰浴处理温度为0℃，冰浴处理时间为5min。

其中，所述负压抽滤的操作方法与条件是均为现有技术，例如可以采用QIAamp操作手册进行，也可以采用针筒手工抽滤。

其中，所述离心处理的转速为10000-16000转/min，处理时长为1-2min。

优选的，所述第一离心处理的转速为14000转/min，处理时长为2min。

其中，所述烘干温度为50-60℃，烘干时长为5-10min。

优选地，所述烘干温度为56℃，烘干时长为10min。

其中，所述第二离心处理的转速为10000-16000转/min，处理时长为1-2min。

优选地，所述第二离心处理的转速为14000转/min，处理时长为1min。

其中，所述用于洗涤的乙醇使用量不能超过硅胶柱的容量，使用量为0.5-1ml。

优选地，乙醇使用量为0.6ml。

其中，所述用于洗涤的洗涤I使用量不能超过硅胶柱的容量，在本发明的一个实施例中，洗涤液I的使用量为0.5-1ml。

优选地，洗涤液I使用量为0.6ml。

其中，所述用于洗涤的洗涤II使用量不能超过硅胶柱的容量，在本发明的一个实施例中，洗涤液II的使用量为0.5-1ml。

优选地，洗涤II使用量为0.6ml。

发明的有益效果

1、由于本发明采用了具有以为成分的核酸分离促进剂的裂解液，在其他试剂的配合下，使血浆或血清游离DNA和RNA与结合蛋白分离，迅速彻底地释放出游离DNA和RNA，并且使变性蛋白质保持溶解状态；由于本发明采用了具有核酸吸附促进剂的吸附液，其中的TritonX-100成分使得游离DNA和RNA与硅胶膜更容易形成氢键和阳离子桥，并在其他试剂提供的高盐、低酸碱度以及钠盐等条件下，使游离DNA和RNA高效地吸附在硅胶吸附柱的上；其中的硫脲成分在核酸分离促进剂中的十二烷基硫酸三乙醇胺和二甲亚砜等物质的协同下保证了变性蛋白的进一步溶解，确保吸附不被蛋白质沉淀干扰，并确保溶液通过硅胶吸附柱时通畅。由于发明采用了用于除去硅胶膜上非特异性结合蛋白的洗涤液I和用于除去硅胶膜上残留的胍、氯化钠等盐离子的洗涤液II，确保了提取的游离DNA和RNA纯度和浓度。

2、利用本发明的试剂盒提取的游离DNA和RNA质量好，提取效率高、而且操作简单，成本低，根据实验结果数据表明，本发明方法提取的核酸浓度是Qiagen产品的3倍以上，而且进行片段分析时，本发明提取的结果不存在片段的丢失，并且扩增条带明亮，无杂带。

3、由于本发明的硅胶吸附柱法游离DNA和RNA提取试剂盒提取效率高、质量好，因此可广泛应用于分子生物学中的基因组研究、分子进化研究；医学中的遗传病研究、基因突变检测、肿瘤筛查、HLA分型、移植配型等；司法上的亲子鉴定、血缘关系的鉴定等；在考古学和大中小学的生物试验领域液有应用。

4、高质量的游离DNA或RNA是进行分子生物学研究的第一步，也是关键的一步，直接影响实验成败。随着血浆或血清游离DNA和RNA在临床上的应用越来越广泛，高质量和高浓度的血浆或血清游离DNA和RNA提取方法被国外垄断，影响了血浆或血清游离DNA和RNA研究在我国的开展。本发明的研发成功，打破了国外的垄断，提高了硅胶膜吸附柱法对小片段DNA和RNA的提取效率，具有广泛的应用前景和巨大的市场推广价值。

附图说明

图1是本发明试验例中血浆游离DNA片段长度分析结果电泳图，其中，A图为102bp的β-Globin基因片段结果；B图为137bp的SRY基因片段结果；C图为268bp的β-Globin基因片段结果；D图为402bp的p53基因片段的结果，图中的Lane1和Lane2是Qiagen提取的模板；Lane3和Lane4是本发明提取的模板；

图2是本发明与Qiagen产品血浆游离DNA浓度分析结果的比较；

图3是本发明试验例中MicroRNA-21cDNA的普通PCR产物电泳结果。其中，图中的Lane1和Lane2是Qiagen提取的模板；Lane3和Lane4是本发明提取的模板；

图4是本发明提取的血浆microRNA21浓度与Qiagen结果的比较。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例中涉及的实验材料：

1)引物和探针

为了验证本发明提取不同片段DNA的效率，发明人设计了102bp的β-Globin基因、137bp的SRY基因、268bp的β-Globin基因和402bp的p53基因引物，用普通PCR扩增目的片段，凝胶电泳观察这些片段的扩增效果，上述引物的基因序列如下所示：

102bpβ-Globin上游引物：5'-GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA-3'(SEQID NO:1)；

102bpβ-Globin下游引物：5'-CCTTGATACCAACCTGCCCAG-3'(SEQID NO:2)；

SRY上游引物序列：5'-TGGCGATTAAGTCAAATTCGC-3'(SEQID NO:3)；

SRY下游引物序列：5'-ATACATTGTCAGGGTACTAGGGGG-3'(SEQID NO:4)；

268bpβ-Globin上游引物：5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3'(SEQID NO:5)；

268bpβ-Globin下游引物：5'-GGTGAACGTGGATGAAGTTG-3'(SEQID NO:6)；

p53上游引物：5'-TTCCTACAGTACTCCCCTGC-3'(SEQID NO:7)；

p53下游引物：5'-GCCGCCTGAGGTCTGGTTTGCAACT-3'(SEQID NO:8)。

根据文献报道，血浆中的β-Globin基因浓度可以代表血浆中游离DNA的量。因此用荧光定量PCR测定β-Globin浓度。

荧光定量PCR利用β-Globin上下游引物序列与普通PCR进行。

β-Globin探针序列：5'-AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG-3'SEQID NO:9)，其5'端带有6-FAM基团，3'端带有基团BHQ1基团。

为了验证本发明提取小片段RNA的效率，发明人设计了microRNA-21的引物探针，以本发明方法和Qiagen方法提取的游离DNA和RNA为模板逆转录合成microRNA-21cDNA，普通PCR扩增microRNA-21cDNA目的片段(62bp)；用Taqman-MGB专用荧光定量PCR测定microRNA-21浓度。

microRNA-21上游引物：5'-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3'(SEQID NO:10)

microRNA-21下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'(SEQID NO:11)

microRNA-21探针序列：5'-CTGGATACGACTCAACA-3'(SEQID NO:12)，其5'端带有6-FAM基团，3'端带有基团MGB基团。

2)试剂

其中2×普通PCR Buffer pH8.3(江苏然科生物技术有限公司)含：20mM的Tris-HCl，100mM的KCl，3mM的MgCl₂，400μM的dNTP，2U的Takara Taq^TM HS酶。dNTP、琼脂糖购自上海生工，Takara Taq^TM HS酶、荧光定量反应预混液购自大连宝生物，硅胶吸附柱购自杭州莱枫公司，引物和探针由上海英骏合成。逆转录试剂盒、Taqman-MGB专用荧光定量反应预混液(江苏然科生物技术有限公司)，成分具体参见产品说明书。

以下实施例分别从试剂的配制、核酸的提取以及核酸测定三个方面进行说明，其中实施例1为试剂的配制，实施例3为核酸的提取，实验例为核酸的测定，本申请使用本技术领域中核酸提取效果最佳、最主要的Qiagen试剂盒及其方法提取为对照，对利用本申请的试剂盒进行核酸提取的效果进行说明。

实施例1试剂的配制

1、裂解液的配制

采用常规配制方法分别配制50mM Tris-HCl，4M异硫氰酸胍，1M氯化钠，5mM EDTA以及2％十二烷基硫酸三乙醇胺和1％二甲亚砜溶液，将其混合均匀，调节pH使其达到6.5后即得裂解液。

其中，Tris-HCl的物质的量浓度在10-100mM都可以实现本发明的技术目的，例如可以是：10mM、20mM、30mM、40mM、60mM、70mM、80mM、90mM等；

异硫氰酸胍的物质的量浓度在3-5M都可以实现本发明的技术目的，例如可以是：3M、3.5M、4M、4.5M、5M等；

氯化钠的物质的量浓度在0.5-1.5M都可以实现本发明的技术目的，例如可以是：0.5M、0.7M、0.9M、1.1M、1.3M、1.5M等；

EDTA的物质的量浓度在2-10mM都可以实现本发明的技术目的，例如可以是：2mM、3mM、4mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM等；

pH在6.0-7.5的范围内都可以实现本发明的技术目的，例如可以是6.0、6.2、6.7、6.9、7、7.3、7.5等。

2、吸附液的配制

采用常规配制方法分别配制.07M磷酸盐缓冲液，4M异硫氰酸胍，1M氯化钠，3M硫脲和5％TritonX-100，将其混合均匀，调节pH使其达到6.5后即得吸附液。

其中，磷酸盐缓冲液物质的量浓度在0.05-1M的范围内都可以实现本发明的技术目的，例如可以是：0.05M、0.07M、0.09M、1.0M、1.3M、1.5M等；

异硫氰酸胍物质的量浓度在3-5M都可以实现本发明的技术目的，例如可以是：3M、3.5M、3.9M、4.1M、4.3M、4.5M等；

氯化钠物质的量浓度在0.5-1.5M都可以实现本发明的技术目的，例如可以是：0.5M、0.7M、0.9M、1.1M、1.3M等；

pH在6.0-9的范围内都可以实现本发明的技术目的，例如可以是6.0、6.2、6.7、6.9、7、7.3、7.5、8、8.3、8.7、9等。

3、洗涤液的配制

3.1、洗涤液I的配制

采用常规配制方法分别配制50mM Tris-HCl，4.5M盐酸胍，1M氯化钠，60％乙醇,将其混合均匀，调节pH使其达到6.5后即得洗涤液I。

其中，Tris-HCl的物质的量浓度在10-100mM都可以实现本发明的技术目的，例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM等；

盐酸胍的物质的量浓度在3-5M的范围内都可以实现本发明的目的，例如可以是：3M、3.5M、3.9M、4.1M、4.3M等；

氯化钠物质的量浓度在0.5-1.5M都可以实现本发明的技术目的，例如可以是：0.5M、0.7M、0.9M、1.1M、1.3M等；

乙醇的质量百分比在50-70％的范围内可以实现本发明的技术目的，例如可以是50％、55％、57％、62％、65％等

pH在6.0-7.5都可以实现本发明的技术目的，例如可以是6.0、6.2、6.7、6.9、7、7.3、7.5等。

3.2、洗涤液II的配制

采用常规配制方法分别配制50mM Tris-HCl，70％乙醇，将其混合均匀，调节pH使其达到6.5后即得洗涤液II。

其中，Tris-HCl的物质的量浓度在10-100mM都可以实现本发明的技术目的，例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM、70mM、80mM、90mM、100mM等；

乙醇的质量百分比在60-80％的范围内可以实现本发明的技术目的，例如可以是60％、63％、70％、75％、80％等。

pH在6.0-7.5都可以实现本发明的技术目的，例如可以是6.0、6.2、6.7、6.9、7、7.3、7.5等。

实施例2血浆或血清中核酸的提取

1、血浆样本的制备：

取新鲜EDTA抗凝血，900G离心10分钟，吸取上清；上清15800G离心10分钟，吸取上清，得到血浆，将制备好的血浆平均分为4份，备用。

其中2份混合血浆采用本发明方法与试剂盒进行游离DNA和RNA的提取，剩余2份混合血浆用Qiagen的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取血浆游离DNA和RNA。

2、对血浆样本的裂解

向4ml血浆中加入等体积的裂解液，加320μl蛋白酶K混匀30s，60℃孵育30分钟。

其中，血浆、裂解液和蛋白酶K的用量的体积份数比在0.5-1.5：0.5-1.5：0.04-0.12的范围内都可以实现本发明的技术目的，例如血浆、裂解液和蛋白酶K的用量的体积份数比可以是0.5：1.5：0.04，还可以是0.5：1.5：0.12，还可以是1.5：0.5：0.04，还可以是1.5：0.5：0.12。

其中，混匀的时长在30-60s都可以实现发明的技术目的，例如40s、50s、60s等。

其中，孵育处理温度在56-80℃范围内，孵育处理时长在20-60min范围内都可以实现本发明的技术目的，例如温度为56℃、62℃、65℃、69℃、73℃、78℃等，处理时长为23min、32min、38min、45min、53min、58min等。

血浆游离DNA和RNA(即本实施例所称的核酸)一般是以与结合蛋白的状态存在于血浆或血清中，裂解的意义在于把与蛋白结合的游离DNA和RNA充分释放出来。裂解液中的异硫氰酸胍、十二烷基硫酸三乙醇胺和二甲亚风均具有使蛋白质变性的作用，同时十二烷基硫酸三乙醇胺具有溶解蛋白的作用。在蛋白质溶解状态下，蛋白酶K具有水解蛋白质的活性。在异硫氰酸胍、十二烷基硫酸三乙醇胺和二甲亚风等试剂的协同下，蛋白酶K能够使变性蛋白完全水解，使DNA分子完整地分离出来。蛋白酶K在pH4-12.5、温度37-60℃、3M以下胍盐的范围内均有活性，在一些5％浓度以内的表面活性剂中和一定浓度的二甲亚砜中也具有活性。为了保证蛋白酶K的活性，同时又能保证异硫氰酸胍、十二烷基硫酸三乙醇胺和二甲亚砜等试剂发挥作用，本发明选择裂解液与血浆的加入比例为1：1，使异硫氰酸胍、十二烷基硫酸三乙醇胺和二甲亚砜的终浓度分别为2M、1％和0.5％。蛋白酶K的工作浓度一般为50-100μg/ml，由于本发明使用了较多的蛋白质变性试剂，在保证蛋白酶K工作浓度的范围内，蛋白酶K的使用量相对较少。

3、对核酸的吸附

向孵育后的血浆中加入8ml吸附液，以及4.6ml异丙醇，混匀30s后冰浴5分钟，转入硅胶吸附柱，进行负压抽滤，使血浆中游离的DNA或RNA吸附在硅胶吸附柱表面。

其中，吸附液的加入量与血浆或血清样本的体积份数比例在1.5-2.5:0.5-1.5范围内都可以实现本发明的技术目的，例如吸附液的体积份数比可以是1.5、1.7、1.9、2.1、2.3、2.5等，血浆或血清的体积份数可以是0.5、0.7、1.1、1.5、1.9、2.1、2.3、2.5等。

其中，异丙醇的加入量与吸附液的体积份数比例在3.2-6.3:6-12范围内都可以实现本发明的技术目的，例如异丙醇的体积份数可以是3.2、3.7、4.2、4.6、5.0、5.4、5.9、6.3等，吸附液的体积份数可以是6、6.4、6.8、7.1、7.8、8.6、9.3、10.1、10.9、11.2、11.8、12等。

其中，该步骤的混匀的时长在20-60s范围内都可以实现本发明的技术目的，例如可以是23s、27s、35s、42s、49s、54s、59s等。

其中，冰浴处理温度在0-4℃，冰浴处理时间在5-10min的范围内都可以实现本发明的技术目的，例如温度在1℃、2℃、3℃、4℃，冰浴处理时间在5min、6min、7min、8min、9min、10min等。

其中，负压抽滤的操作方法与条件是均为现有技术，例如可以采用QIAamp操作手册进行，也可以采用针筒手工抽滤。

游离的DNA和RNA(即本发明所称的核酸)在高盐低pH值情况下被硅胶膜吸附。高浓度的胍盐是硅胶膜吸附核酸必须的条件，沉淀核酸有利于硅胶吸附，而本申请加入的异丙醇的量是沉淀核酸(DNA和RNA)所必须的浓度。加入异丙醇沉淀核酸的同时，也有部分蛋白沉淀下来，沉淀下来的蛋白溶液干扰核酸吸附，同时也会堵塞硅胶孔，使液体过柱不通畅。终浓度1M以上的硫脲才能起到使沉淀蛋白重新溶解蛋白的作用。

4、洗涤

抽滤完成后，先向硅胶吸附柱中加入600μl无水乙醇进行洗涤，重复两次后，再依次用600μl洗涤液I洗涤1次，600μl洗涤液II洗涤1次，最后用600μl无水乙醇洗涤1次。洗涤完成后，14000转离心硅胶吸附柱2分钟，56℃烘干10分钟。

其中，离心处理的转速在10000-16000转/min的范围内，处理时长在1-2min的范围内都可以实现本发明的技术目的，例如转速为11000转/min、12000转/min、13000转/min、15000转/min等，处理时长为1min、1.5min、1.8min等。

其中，烘干温度在50-60℃，烘干时长在5-10min范围内都可以实现本发明的技术目的，例如烘干温度可以是52℃、54℃、57℃、59℃等，烘干时长可以是6min、7min、8min、9min。

其中，洗涤的洗涤液I和洗涤液II的使用量都不能超过硅胶柱的容量，因此在洗涤液I或洗涤液II的使用量在0.5-1ml的范围内都可以实现本发明的技术目的，例如洗涤液I的用量可以是0.5、0.7、0.8、0.9ml等，洗涤液II的用量可以是0.5、0.7、0.8、0.9ml等。

乙醇对核酸的沉淀效应随分子量加大而增大，小分子的核酸可以溶于75％乙醇。因此本发明第一步用无水乙醇洗涤，在除去十二烷基硫酸三乙醇胺、二甲亚砜和硫脲等物质的同时，保证小分子核酸不丢失。洗涤液I在除去硅胶膜上非特异性结合蛋白的同时保证已吸附的DNA和RNA不被洗掉。洗涤液II在除去硅胶膜上残留的胍、氯化钠等盐离子的同时保证已吸附的DNA和RNA不被洗掉。最后再用无水乙醇洗涤保证了硅胶膜的干净无杂质，同时使膜容易挥发，易于干燥。所有洗涤液使用量不能超过硅胶柱的容量，因此在本实施例中优选600μl。

4、DNA和RNA的洗脱

向硅胶吸附柱中加120μl三蒸水，室温放置2分钟，14000转/min离心1分钟收集洗脱液，得到游离DNA或RNA。

其中，离心处理的转速在10000-16000转/min范围内，处理时长在1-2min的范围内都可以实现本发明的技术目的，例如转速为11000转/min、12000转/min、13000转/min、15000转/min等，处理时长为1min、1.5min、1.8min等。

其中，三蒸水的使用量在50-180μl范围内都可以实现本发明的技术目的，例如可以是60、90、120、150μl等。

游离DNA和RNA(即本发明所称的核酸)在低盐高pH值情况下释放核酸。加入三蒸水的量必须完全覆盖硅胶膜，同时又能使提取的核酸达到一定浓度，因此我们优选120μl的三蒸水作为洗脱液。室温静置2分钟使核酸充分溶解于三蒸水(即洗脱液)中。14000转/min离心可以使洗脱液得到充分收集。

需要说明的是，由于血浆与血清的区别只是有无抗凝剂的区别，其组成成分及组成成分性质并没有发生改变，因而，本发明可以用于血浆也可以用于血清游离DNA和RNA的提取。

对比例QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取血浆游离DNA和RNA

本申请以QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取血浆游离DNA和RNA的方法及其试剂盒为对照，提取方法参照QIAamp Circulating Nucleic Acid试剂说明书，具体方法如下：

1、裂解：取4ml血浆加3.2ml Buffer ACL，加400μl蛋白酶K混匀30s，60℃孵育30分钟。

2、吸附：加入7.2ml Buffer ACB，混匀30s后冰浴5分钟，转入硅胶吸附柱，负压抽滤。

3、洗涤：抽滤完成后，硅胶柱用600μl Buffer ACW1洗涤1次，750μl Buffer ACW2洗涤1次，750μl无水乙醇洗涤1次。洗涤完成后，14000转离心硅胶吸附柱3分钟，56℃烘干10分钟。

4、洗脱：硅胶吸附柱中加120μl三蒸水，室温放置2分钟，14000转离心1分钟收集洗脱液，得到游离DNA和RNA。

试验例

本试验例是对实施例3及对比例中提取的游离DNA和RNA进行的测定的实施例，主要从片段长度及浓度两方面分别对DNA和RNA进行，具体操作及试验结果如下：

1、血浆游离DNA分析

1.1、片段长度分析

以本发明方法和Qiagen方法提取的游离DNA和RNA为模板，分别扩增102bp的β-Globin基因片段、137bp的SRY基因片段、268bp的β-Globin基因片段和402bp的p53基因片段，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照。

PCR反应体系如下：

其中，该PCR体系在Veriti梯度PCR仪(ABI公司)中进行反应。

扩增条件为：94℃预变性60秒；94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸60秒，共35个循环；72℃5分钟。

电泳结果如图1所示，根据图1所示的电泳图可知，以本发明方法和Qiagen方法提取的血浆游离DNA为模板的扩增结果在102bp、137bp、268bp和402bp处均出现明显条带，并且本发明在条带亮度上明显比Qiagen明亮。结果表明，本发明提取的游离DNA在不同长度片段的提取效率上明显高于Qiagen结果。

1.2浓度分析

根据文献报道，血浆中的β-Globin基因浓度可以代表血浆中游离DNA的量。以本发明方法和Qiagen方法提取的游离DNA和RNA为模板，用荧光定量PCR对102bp的β-Globin基因片段进行定量检测。荧光定量PCR反应体系如下：

其中，上述PCR反应在荧光定量PCR仪ViiA 7Dx(ABI公司)中进行反应，反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火40秒，共40个循环。

试验结果如表1和图2所示；

表1本发明提取的游离DNA浓度与Qiagen结果的比较

根据表1所示的数据与图2所示的曲线可知，本发明方法提取模板的荧光定量的Ct值分别为：27.068和26.96，平均值为27.014；而以Qiagen方法提取模板的荧光定量的Ct值分别为28.954和28.648，平均值为28.801，两次结果的Ct值平均差值达1.787，也就是说本发明提取的游离DNA浓度是Qiagen提取浓度的3.45倍，再次说明本发明提取的游离DNA浓度高于Qiagen提取的结果。

2血浆游离microRNA分析

2.1片段长度分析

以本发明方法和Qiagen方法提取的游离DNA和RNA为模板逆转录合成microRNA-21cDNA，普通PCR扩增microRNA-21cDNA目的片段(62bp)，产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照。PCR反应体系如下：

该PCR体系在Veriti梯度PCR仪(ABI公司)中进行反应，反应条件为：94℃预变性60秒；94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸60秒，共35个循环；72℃5分钟。

电泳结果如图3所示,根据图3所示的电泳图可知，以本发明方法和Qiagen方法在62bp处均出现明显条带，并且本发明条带的亮度高于Qiagen的结果，提示本发明提取的microRNA浓度可能高于Qiagen提取的结果。

2.2浓度分析

以本发明方法和Qiagen方法提取的游离DNA和RNA为模板逆转录合成microRNA-21cDNA，用Taqman-MGB专用荧光定量PCR测定microRNA-21浓度。

其中，Taqman-MGB专用荧光定量PCR反应体系如下：

其中，上述PCR反应在荧光定量PCR仪ViiA 7Dx(ABI公司)中进行反应，反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火34秒，共40个循环。

试验结果如表2和图4所示：

表2本发明提取的血浆microRNA21浓度与Qiagen结果的比较

根据表2及图4的结果可知，本发明方法提取模板的microRNA-21的Ct值分别为：32.264.774和32.231，平均值为32.2475；而Qiagen方法提取模板的microRNA-21的Ct值分别为：33.863和33.864，平均值为33.8635，可见，本发明方法两次microRNA21定量的Ct值均低于Qiagen结果，两次结果的Ct值平均差值达1.616，也就是说本发明提取的microRNA浓度是Qiagen提取浓度的3 倍以上。

综上所述，本发明对小片段DNA和RNA特别是microRNA有较高的提取效率，提取的血浆游离RNA能够满足microRNA的研究需要。

Claims (10)

1.一种血浆或血清游离DNA和RNA的硅胶吸附柱提取试剂盒，包括蛋白酶K、异丙醇、无水乙醇、三蒸水，其特征在于，还包括：

含有核酸分离促进剂的裂解液，用于促进血浆或血清中游离DNA和RNA与结合蛋白的分离；

含有核酸吸附促进剂的吸附液，用于促进硅胶吸附柱对游离DNA和RNA的吸附，同时保持变性蛋白处于溶解状态；以及洗涤液；

其中，洗涤液包括：

用于除去硅胶膜上非特异性结合蛋白的洗涤液I；

用于除去硅胶膜上残留的胍、氯化钠等盐离子的洗涤液II。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液中的核酸分离促进剂是十二烷基硫酸三乙醇胺和二甲亚砜。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液还包括：Tris-HCl，异硫氰酸胍，氯化钠，EDTA成分。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述吸附液中的核酸吸附促进剂为TritonX-100和硫脲。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述吸附液还具有：磷酸盐缓冲液，异硫氰酸胍和氯化钠。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液I是由Tris-HCl，盐酸胍，氯化钠和乙醇组成。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液II是由Tris-HCl，乙醇组成。

8.一种血浆或血清游离DNA和RNA的硅胶吸附柱提取方法，其特征在于，其利用权利要求1所述的试剂盒对游离DNA和RNA进行硅胶吸附柱提取。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用权利要求1所述的试剂盒对游离DNA和RNA进行硅胶吸附柱提取包括：

向血浆或血清样本中加入具有核酸分离促进剂的裂解液和蛋白酶K进行混匀及孵育处理，使血浆或血清中的游离DNA和RNA与结合蛋白分离，得到混合物；

向混合物中加入具有核酸吸附促进剂的吸附液，并加入异丙醇进行混匀，冰浴后转入硅胶吸附柱进行负压抽滤，使混合物中游离DNA和RNA高效地吸附在硅胶吸附柱上；

抽滤完成后，先使用无水乙醇对硅胶吸附柱进行两次洗涤，再依次使用洗涤液I、洗涤液II、无水乙醇对硅胶吸附柱分别进行一次洗涤，第一离心处理后，进行烘干，得到去除杂质的含有游离DNA和RNA的硅胶吸附柱；

利用三蒸水对硅胶吸附柱进行洗脱，第二离心处理后收集洗脱液，得到游离DNA和RNA。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述裂解液中的核酸分离促进剂是十二烷基硫酸三乙醇胺和二甲亚砜，所述吸附液中的核酸吸附促进剂为TritonX-100和硫脲，所述洗涤液I是由Tris-HCl，盐酸胍，氯化钠和乙醇组成，所述洗涤液II是由Tris-HCl，乙醇组成。