CN108865658B - 一种管式血浆游离核酸提取方法及系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种管式血浆游离核酸提取方法及系统。所述提取系统包括：加样腔体，其能够盛装混合裂解样品，所述加样腔体内设置有吸附机构，能够与混合裂解样品中的游离核酸结合；按压机构，其能够于所述加样腔体内向下移动；一个以上的洗涤液储存腔体，其能够盛装洗涤缓冲液；洗脱液储存腔体，其能够盛装洗脱液，设置于所述洗涤液储存腔体的下方；以及，被触碰漏液机构，其分布于所述加样腔体与洗涤液储存腔体或者洗脱液储存腔体相结合的设定位置，并在与所述按压机构的触碰结构接触时，使所述洗涤液储存腔体或者洗脱液储存腔体与所述加样腔体相连通。本发明结构设计巧妙，将试剂和装置结合到一起，可完全杜绝交叉污染的可能性。

Description

一种管式血浆游离核酸提取方法及系统

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及遗传物质的提取装置领域，特别是涉及一种用管式游离核酸分离法提取血浆中游离核酸的提取方法及相应的系统。

背景技术

游离DNA又称循环DNA(circulating nucleic acid)，是指循环血中游离于细胞外的内源性DNA，以单链或双链DNA的形式存在，大多数游离DNA是以核蛋白形式存在的双链DNA。游离DNA片段较小，长度在150-200bp左右。

血中游离DNA在疾病的早期诊断、预后、监测等方面具有重要潜在价值，其具体医学应用大致包括以下方面：

1.用于肿瘤相关分析，用药指导；

2.用于产前诊断，产前亲子鉴定；

3.用于免疫性疾病等非肿瘤类疾病的病情分析与疗效观察。

游离DNA的提取纯化是进行产前筛查或肿瘤检测的首要条件，提取产物的总量和质量直接影响检测结果的可靠性和准确性。由于游离DNA片段较小，在血浆中含量低，因此如何获取更高质量的游离DNA事关重要。如果要满足大规模的筛查检测需要，游离DNA提取试剂还需要满足操作简单、成本低、交叉污染可能性小、能够实现自动化等要求。

然而，目前业界游离核酸的提取方式一般大多依靠人为操作，如各种离心柱式的提取试剂盒。需要在分子实验室中，通过离心机、磁力架、真空泵等仪器设备的辅助。通过各种试剂耗材进行核酸的分离操作，操作过程中需要反复打开样品管加入不同的试剂，存在很大的交叉污染的可能性。再者，现有的操作流程通常耗时较长，至少在2个小时左右。

再者一些现有专利，如专利CN 105296327A，它的结构要连接泵才能使用，利用真空泵提供的压力进行液体样品的转移；且洗涤液是外置在外界环境中，这就使得这种方法便携性大大下降，只能特定的实验条件下才能完成。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种管式血浆游离核酸提取方法及系统，以克服现有技术中的不足。

为实现前述目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种管式血浆游离核酸提取系统，其包括：

加样腔体，其能够盛装混合裂解样品，所述加样腔体内设置有吸附机构，所述吸附机构能够与混合裂解样品中的游离核酸结合；

按压机构，其能够于所述加样腔体内向下移动，所述按压机构包括触碰结构；

一个以上的洗涤液储存腔体，其能够盛装洗涤缓冲液；

洗脱液储存腔体，其能够盛装洗脱液，设置于所述洗涤液储存腔体的下方；

以及，被触碰漏液机构，其分布于所述加样腔体与洗涤液储存腔体或者洗脱液储存腔体相结合的设定位置，并在与所述按压机构的触碰结构接触时，使所述洗涤液储存腔体或者所述洗脱液储存腔体与所述加样腔体相连通。

本发明实施例还提供了一种管式血浆游离核酸提取方法，所述提取方法主要基于前述的管式血浆游离核酸提取系统而实施，并且所述提取方法包括：

使混合裂解样品进入加样腔体，并使该加样腔体内设置的吸附机构与混合裂解样品中的游离核酸结合；

向下触压按压机构，使其触碰结构沿所述加样腔体的内壁向下移动；

使所述按压机构分别与分布于所述加样腔体与洗涤液储存腔体的连接壁上的被触碰漏液机构接触，使所述洗涤液储存腔体内的洗涤缓冲液进入所述加样腔体，对混合裂解样品进行洗涤；

以及，使所述按压机构的触碰结构分别与分布于所述加样腔体与洗脱液储存腔体的连接壁上的被触碰漏液机构接触，使所述洗脱液储存腔体内的洗脱液进入所述加样腔体，对混合裂解样品进行洗脱，并收集，从而实现血浆游离核酸的提取。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

1)本发明提供的管式血浆游离核酸提取方法及系统将试剂和提取装置整合到一起，无需操作人员反复加试剂，在操作过程中不需要再次打开样品盖将其暴露在外界环境中，解决了传统提取方法中存在的交叉污染和操作繁杂的缺点，且可完全杜绝交叉污染的可能性；

2)本发明提供的管式血浆游离核酸提取系统操作简单，提高了提取效率，无需离心机、真空泵、磁力架等电力设备，可大大减少成本；

3)本发明提供的管式血浆游离核酸提取系统结构小巧，非常容易随身携带，克服了场地和条件的限制，只需要简单的移液器和少量耗材即可完成游离核酸的分离操作，能有效提高游离核酸提取的便利性；同时，操作时间短相对于传统提取方法而言，耗时更短，并且可与自动化装置配合，完成游离核酸的自动化提取；

4)本发明实现了无需真空泵等外接装置辅助，只需要简单操作即可获得的游离核酸。

附图说明

图1是本发明一典型实施方案中一种管式血浆游离核酸提取系统的结构示意图。

附图标记说明：1-活塞装置，2-第一洗涤液储存腔体，3-第二洗涤液储存腔体，4-洗脱液储存腔体，5-第一被触碰漏液薄膜，6-第二被触碰漏液薄膜，7-第三被触碰漏液薄膜，8-硅胶吸附滤芯，9-加样腔体。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

本发明实施例的一个方面提供了一种管式血浆游离核酸提取系统，其包括：

加样腔体，其能够盛装混合裂解样品，所述加样腔体内设置有吸附机构，所述吸附机构能够与混合裂解样品中的游离核酸结合；

按压机构，其能够于所述加样腔体内向下移动，所述按压机构包括触碰结构；

一个以上的洗涤液储存腔体，其能够盛装洗涤缓冲液；

洗脱液储存腔体，其能够盛装洗脱液，设置于所述洗涤液储存腔体的下方；

以及，被触碰漏液机构，其分布于所述加样腔体与洗涤液储存腔体或者洗脱液储存腔体相结合的设定位置，并在与所述按压机构的触碰结构接触时，使所述洗涤液储存腔体或者所述洗脱液储存腔体与所述加样腔体相连通。

在一些实施例中，所述的管式血浆游离核酸提取系统包括两个所述的洗涤液储存腔体，且所述洗涤液储存腔体分别分布于所述加样腔体的两侧，所述洗脱液储存腔体设置于任一所述洗涤液储存腔体的下方。

在一些实施例中，所述被触碰漏液机构分布于所述加样腔体与洗涤液储存腔体或者洗脱液储存腔体的连接壁上，且处于所述加样腔体内。

在一些实施例中，所述被触碰漏液机构向所述加样腔体一侧延伸凸出，并在与所述按压机构的触碰结构接触时，使所述洗涤液储存腔体内的洗涤缓冲液或者所述洗脱液储存腔体的洗脱液进入所述加样腔体。

在一些优选实施例中，所述触碰结构能够沿所述连接壁的垂直方向向下移动，可方便向下触碰被触碰漏液机构。

进一步地，所述被触碰漏液机构包括触碰式漏液薄膜，但不限于此。

在一些实施例中，所述加样腔体与其中任一洗涤液储存腔体的连接壁上设置有第一被触碰漏液机构，所述加样腔体与其中另一洗涤液储存腔体的连接壁上设置有第二被触碰漏液机构，所述第一被触碰漏液机构与第二被触碰漏液机构的水平位置不相同。

进一步地，所述加样腔体与洗脱液储存腔体的连接壁上设置有第三被触碰漏液机构，且所述第三被触碰漏液机构的水平位置低于所述第一被触碰漏液机构、第二被触碰漏液机构中的任一者。

进一步地，所述管式血浆游离核酸提取系统底部还设置有过滤机构，其能够使所述混合裂解样品中的大分子蛋白从所述加样腔体内排出。

进一步地，所述吸附机构可以与过滤机构一体结合，例如，所述吸附机构可以包括硅胶吸附滤芯，但不限于此。

进一步地，所述按压机构能够于所述加样腔体内向下移动，且与所述加样腔体的内壁密封结合，所述按压机构包括活塞装置，且所述活塞装置具有能够使被触碰漏液机构破裂的触碰结构，所述触碰结构为一尖锐部件，所述尖锐部的结构不做限制，只要是能达到本发明的要求，在与触碰式漏液机构接触时能够使其破裂的结构，都在本发明的保护范围内。

进一步地，所述按压机构与一操作手柄相连接，方便按压用力。

进一步地，所述加样腔体的出口还与一样品收集机构连通，便于收集样品进行下一步实验。

相应的，本发明实施例的另一个方面还提供了一种管式血浆游离核酸提取方法，所述提取方法主要基于前述的管式血浆游离核酸提取系统而实施，并且所述提取方法包括：

使混合裂解样品进入加样腔体，并使该加样腔体内设置的吸附机构与混合裂解样品中的游离核酸结合；

向下触压按压机构，使其触碰结构沿所述加样腔体的内壁向下移动；

使所述按压机构分别与分布于所述加样腔体与洗涤液储存腔体的连接壁上的被触碰漏液机构接触，使所述洗涤液储存腔体内的洗涤缓冲液进入所述加样腔体，对混合裂解样品进行洗涤；

以及，使所述按压机构的触碰结构分别与分布于所述加样腔体与洗脱液储存腔体的连接壁上的被触碰漏液机构接触，使所述洗脱液储存腔体内的洗脱液进入所述加样腔体，对混合裂解样品进行洗脱，并收集，从而实现血浆游离核酸的提取。

综上所述，本发明提供的管式血浆游离核酸提取方法及系统将试剂和提取装置整合到一起，无需操作人员反复加试剂，在操作过程中不需要再次打开样品盖将其暴露在外界环境中，解决了传统提取方法中存在的交叉污染和操作繁杂的缺点，且可完全杜绝交叉污染的可能性。

以下结合附图和若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。

参见图1，本发明的一典型实施例中，一种管式血浆游离核酸提取系统包括加样腔体9、活塞装置1、第一洗涤液储存腔体2、第二洗涤液储存腔体3和洗脱液储存腔体4。

所述加样腔体9内能够盛装混合裂解样品，所述加样腔体9内设置有硅胶吸附滤芯8，所述硅胶吸附滤芯8能够与混合裂解样品中的游离核酸结合，并且能够使所述混合裂解样品中的大分子蛋白从所述加样腔体内排出。所述加样腔体9的出口还可与一样品收集机构连通，便于收集样品进行下一步实验。

活塞装置1具有触碰结构，能够于所述加样腔体9内向下移动，且与所述加样腔体的内壁密封结合。所述活塞装置可具有能够使被触碰漏液机构破裂的尖锐部，所述尖锐部的结构不做限制，只要是能达到本发明的要求，在与被触碰漏液机构接触时能够使其破裂的结构，都在本发明的保护范围内。所述活塞装置1还与一操作手柄相连接，便于按压用力。

洗涤液储存腔体用以盛装洗涤缓冲液，其个数在一个以上，优选为两个，分别分布于所述加样腔体的两侧，参见图1中的第一洗涤液储存腔体2、第二洗涤液储存腔体3。洗脱液储存腔体4能够盛装洗脱液，所述洗脱液储存腔体4设置于第一洗涤液储存腔体2的下方。本实施例的提取系统由PC材质制成，预先在洗涤液储存腔体和洗脱液储存腔体边缘加入试剂，试剂可在常温中保持1年。

所述触碰结构能够沿所述连接壁的垂直方向向下移动，在本实施例中所述被触碰漏液机构包括触碰式漏液薄膜。所述加样腔体9与第一洗涤液储存腔体2的连接壁上设置有第一被触碰漏液薄膜5，所述加样腔体9与第二洗涤液储存腔体2的连接壁上设置有第二被触碰漏液薄膜6，由图1可知，所述第一被触碰漏液薄膜5的水平位置高于第二被触碰漏液薄膜6。其实，两者的高度只要不相同即可，也可以是第二被触碰漏液薄膜6的水平位置高于第一被触碰漏液薄膜5。

所述加样腔体9与洗脱液储存腔体4的连接壁上设置有第三被触碰漏液薄膜7，且所述第三被触碰漏液薄膜7的水平位置低于所述第一被触碰漏液薄膜5和第二被触碰漏液薄膜6。

在另一优选实施例中，所述第三被触碰漏液薄膜7还可以设置一保护机构，防止误碰操作或者第三被触碰漏液薄膜7的自然破损而导致洗脱液进入加样腔室，对样品进行洗脱，从而带走游离的核酸，造成样品的浪费。

采用本实施例的一种管式血浆游离核酸提取系统进行游离核酸提取的具体方法步骤如下：

1.拔除活塞装置1，往加样腔体9中加入已混合裂解好的样品；

2.缓慢按下活塞装置1，使样品慢慢透过薄膜，大分子蛋白会被硅胶吸附滤芯8过滤，核酸与硅胶吸附柱结合；

3.继续缓慢按下活塞装置1，待活塞装置1的触碰结构戳破第一被触碰漏液薄膜5时，第一洗涤液储存腔体2中的第一洗涤缓冲液流入加样腔体9中，并流过硅胶吸附滤芯8；

4.继续缓慢按下活塞装置1，待活塞装置1的触碰结构戳破第二被触碰漏液薄膜6时，第二洗涤液储存腔体3中的第二洗涤缓冲液流入加样腔体9中，并流过硅胶吸附滤芯8；

5.继续缓慢按下活塞装置1，待活塞装置1的触碰结构戳破第三被触碰漏液薄膜7时，洗脱液储存腔体4中的洗脱液流入加样腔体9中，静置3min后更换样品收集管(普通1.5EP管)继续按压活塞装置1；

6.收集样品进行下一步实验。

本发明的管式血浆游离核酸提取系统的工作原理可能在于：本系统是整合了试剂存储和样品处理的一管式游离核酸分离装置，通过活塞的方式，利用大气压力将处理好的液体样品(pH5.0-6.5)通过硅胶吸附膜。在pH 5.0-6.5的状态下，硅胶吸附膜上的硅羟基可特异性的与游离核酸上的羧基基团结合，通过氢键的作用力将游离核酸截留在硅胶吸附柱上。随着活塞继续往下行进，液体样品将全部通过硅胶吸附柱，大部分的游离核酸也将被保留下来。由于液体样品中含有各种离子和大分子蛋白在通过硅胶吸附柱时也会被截留一部分。随着活塞继续往下行进，活塞将捅破第一被触碰漏液机构的密封薄膜使洗涤液将流到底部的硅胶柱上。随着活塞继续往下行进，洗涤液将通过硅胶吸附柱，并带走残留在硅胶吸附柱上的离子。随着活塞继续往下行进，活塞将捅破第二被触碰漏液机构的密封薄膜使洗涤液流到底部的硅胶柱上。随着活塞继续往下行进，洗涤液将通过硅胶吸附柱，溶解并带走残留在硅胶吸附柱上的大分子蛋白。随着活塞继续往下行进，活塞将捅破洗脱液的被触碰漏液机构的密封薄膜使洗脱液将流到底部的硅胶柱上。洗脱液pH7.0-7.5可将游离核酸和硅胶吸附柱结合的氢键破坏，并使得游离核酸溶于洗脱液中。随着活塞继续往下行进，收集洗脱液，即可。

综上所述，藉由上述技术方案，本发明提供的管式血浆游离核酸提取系统将试剂和装置结合到一起，无需操作人员反复加试剂，解决了传统提取方法中存在的交叉污染和操作繁杂的缺点，且可完全杜绝交叉污染的可能性；并且，操作简单，提高了提取效率，无需离心机、磁力架等设备，可大大减少成本；再者，本发明的结构小巧，可随身携带，能有效提高游离核酸提取的便利性。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种管式血浆游离核酸提取系统，其特征在于包括：

加样腔体，其能够盛装混合裂解样品，所述加样腔体内设置有吸附机构，所述吸附机构能够与混合裂解样品中的游离核酸结合；

按压机构，其能够于所述加样腔体内向下移动，所述按压机构包括触碰结构；

两个洗涤液储存腔体，其能够盛装洗涤缓冲液；

洗脱液储存腔体，其能够盛装洗脱液，设置于所述洗涤液储存腔体的下方；

以及，被触碰漏液机构，其分布于所述加样腔体与洗涤液储存腔体或者洗脱液储存腔体的连接壁上，且处于所述加样腔体内，并在与所述按压机构的触碰结构接触时，使所述洗涤液储存腔体或者所述洗脱液储存腔体与所述加样腔体相连通；

其中，所述两个洗涤液储存腔体分别分布于所述加样腔体的两侧，所述洗脱液储存腔体设置于所述洗涤液储存腔体的下方，所述加样腔体与其中任一洗涤液储存腔体的连接壁上设置有第一被触碰漏液机构，所述加样腔体与其中另一洗涤液储存腔体的连接壁上设置有第二被触碰漏液机构，所述第一被触碰漏液机构与第二被触碰漏液机构的水平位置不相同；以及，所述加样腔体与洗脱液储存腔体的连接壁上设置有第三被触碰漏液机构，且所述第三被触碰漏液机构的水平位置低于所述第一被触碰漏液机构、第二被触碰漏液机构中的任一者。

2.根据权利要求1所述的管式血浆游离核酸提取系统，其特征在于：所述被触碰漏液机构向所述加样腔体一侧延伸凸出，并在与所述按压机构的触碰结构接触时，使所述洗涤液储存腔体内的洗涤缓冲液或者所述洗脱液储存腔体的洗脱液进入所述加样腔体。

3.根据权利要求2所述的管式血浆游离核酸提取系统，其特征在于：所述触碰结构能够沿所述连接壁的垂直方向向下移动。

4.根据权利要求2所述的管式血浆游离核酸提取系统，其特征在于：所述被触碰漏液机构包括触碰式漏液薄膜。

5.根据权利要求1所述的管式血浆游离核酸提取系统，其特征在于：所述管式血浆游离核酸提取系统底部还设置有过滤机构，其能够使所述混合裂解样品中的大分子蛋白从所述加样腔体内排出。

6.根据权利要求5所述的管式血浆游离核酸提取系统，其特征在于：所述吸附机构与过滤机构一体结合。

7.根据权利要求1所述的管式血浆游离核酸提取系统，其特征在于：所述吸附机构包括硅胶吸附滤芯。

8.根据权利要求1所述的管式血浆游离核酸提取系统，其特征在于：所述按压机构能够于所述加样腔体内向下移动，且与所述加样腔体的内壁密封结合，所述按压机构包括活塞装置，且所述活塞装置具有能够使被触碰漏液机构破裂的触碰结构，所述触碰结构为一尖锐部件，所述按压机构与一操作手柄相连接。

9.根据权利要求1所述的管式血浆游离核酸提取系统，其特征在于：所述加样腔体的出口还与一样品收集机构连通。

10.一种管式血浆游离核酸提取方法，其特征在于所述提取方法主要基于权利要求1-9中任一项所述的管式血浆游离核酸提取系统而实施，并且所述提取方法包括：

使混合裂解样品进入加样腔体，并使该加样腔体内设置的吸附机构与混合裂解样品中的游离核酸结合；

向下触压按压机构，使其触碰结构沿所述加样腔体的内壁向下移动；

使所述按压机构分别与分布于所述加样腔体与洗涤液储存腔体的连接壁上的被触碰漏液机构接触，使所述洗涤液储存腔体内的洗涤缓冲液进入所述加样腔体，对混合裂解样品进行洗涤；

以及，使所述按压机构的触碰结构分别与分布于所述加样腔体与洗脱液储存腔体的连接壁上的被触碰漏液机构接触，使所述洗脱液储存腔体内的洗脱液进入所述加样腔体，对混合裂解样品进行洗脱，并收集，从而实现血浆游离核酸的提取。