CN115820412A - 一种从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒及方法，该卡盒包括卡盒上盖、中间腔室体和下件管道层；中间腔室体内设置管件结构，管件结构包括样本管、磁珠提取腔管和试剂管，样本管用于卡盒上样和核酸释放；下件管道层包括下件本体，下件本体上设置流体管道和空心针结构，下件本体上还设置反应腔室，反应腔室内设置核酸富集滤纸，反应腔室用于核酸富集和核酸原位扩增。本发明将磁珠法核酸提纯技术与基于壳聚糖修饰的核酸富集滤纸及原位扩增检测技术相结合，用于全集成式从复杂样本中进行特异性、高灵敏的核酸检测。

Description

一种从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒及方法

技术领域

本发明涉及医学、生物分析检测技术领域，尤其涉及一种从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒及方法。

背景技术

分子诊断技术(molecular diagnosis)是建立在分子生物学理论基础上，是一种对人体内的内源性或外源性的生物分子进行分子生物学检测，依据与疾病相关的分子变化的基因组与蛋白质学分析，并将其存在、结构或表达水平的改变作为参考，并进行疾病预防或诊断的技术。其检测的对象是核酸，通过核酸检测进行病原体检测一般包含样本前处理、核酸提取、扩增、检测四个步骤，是实现病原体早期、快速、特异检测的最直接、最可靠、最灵敏的方法，其能快速对检测样本中病原体核酸进行检测，为感染病例确诊提供科学检验依据。进行核酸检测最传统的方法是利用磁珠提取仪基于磁珠法进行核酸提取，而后将提取产物中的一部分加入到预置配好的反应试剂中进行核酸扩增反应，以指数型的方式进行放大目标片段的过程，再通过实时产物信号检测或者末端终点产物检测的方式呈现扩增结果，具体包含：实时荧光检测、凝胶电泳产物检测、试纸条胶体金检测、电化学检测(电流电压检测)等产物检测手段。然而，传统的核酸检测过程需要多步人工操作进行液体转移，过程繁琐大大限制了临床上进行检测的效率与该技术的进一步应用推广。

自上个世纪九十年代以来，以微流控芯片为核心的微全分析系统得到了迅猛的发展，可把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一个微尺度的流体芯片上，具有低成本、分析时间短、分析设备体积小等优势，是一种能集成核酸检测于一体的载体工具，但是传统的微流控芯片是在微尺度的通道下，需要借助微泵、微阀等结构和复杂的宏观与微观的微流控接口进行分析化学领域内的相关检测与分析，这就使得该过程变得繁琐，需要多步人工操作，难以实现全集成的即时诊断，无法进行稳定的存储反应时所需的各种试剂；此外，临床上很多需要进行分析的样本类型复杂多样，一些样本内含有杂质众多，比如混检鼻咽拭子、组织、粪便、痰液等，以传统微流控芯片为载体的核酸检测技术则无法对复杂的样本进行处理。基于此，以赛沛为典型的一些公司开发了极具有代表性的全集成核酸分析系统，但这些系统仍然在检测通用性、灵活性、试剂存储能力、应对复杂样本的能力与检测灵敏度上存在显著不足，进一步阻止了全集成分子诊断系统在临床上与应用上的推广。因此，迫切需要一种全集成的微流控卡盒来应对临床上各类复杂样本，能满足试剂存储需求以实现对复杂样本的高灵敏的特异性检测。

由此，本发明人凭借多年从事相关行业的经验与实践，提出一种从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒及方法，以实现对复杂样本的高灵敏的特异性检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒及方法，将磁珠法核酸提纯技术与基于壳聚糖修饰的核酸富集滤纸及原位扩增检测技术相结合，用于全集成式从复杂样本中进行特异性、高灵敏的核酸检测。

本发明的目的是这样实现的，一种从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒，包括卡盒上盖、中间腔室体和下件管道层；所述中间腔室体内设置管件结构，所述管件结构至少包括样本管、磁珠提取腔管和试剂管，所述样本管用于卡盒上样和核酸释放；所述试剂管用于容置核酸原位扩增时的反应试剂；所述下件管道层包括能扣合于中间腔室体底部的下件本体，所述下件本体上设置流体管道和空心针结构，所述空心针结构能连通所述管件结构和所述流体管道，所述下件本体上还设置反应腔室，所述反应腔室能通过所述流体管道连通所述磁珠提取腔管和所述试剂管，所述反应腔室内能固定地设置核酸富集滤纸，所述试剂管能与所述反应腔室连通以向其提供核酸原位扩增时的反应试剂，所述反应腔室用于核酸富集和核酸原位扩增；所述卡盒上盖能拆卸地扣合于中间腔室体顶部。

在本发明的一较佳实施方式中，所述磁珠提取腔管内设有复用腔，所述复用腔内预置磁珠，所述磁珠用于磁吸捕获提取核酸，所述复用腔用于核酸提取、洗涤和洗脱。

在本发明的一较佳实施方式中，所述管件结构还包括洗涤液管、洗脱液管和富集液管，所述洗涤液管内容置有洗涤液，所述洗涤液管能与所述复用腔连通以向复用腔提供洗涤液；所述洗脱液管内容置有洗脱液，所述洗脱液管能与所述复用腔连通以向复用腔提供洗脱液；所述富集液管内容置有核酸重悬溶液，所述富集液管能与所述复用腔连通以向复用腔提供核酸重悬溶液。

在本发明的一较佳实施方式中，所述中间腔室体内还设置废液池管，所述废液池管能与所述反应腔室连通，所述废液池管用于容纳流过核酸富集滤纸后的废液。

在本发明的一较佳实施方式中，所述中间腔室体内还设置开关阀，所述开关阀用于连通或断开所述复用腔和所述下件本体上的流体管道。

在本发明的一较佳实施方式中，所述流体管道包括第一流道、第二流道和第三流道，所述下件本体上设置与所述第一流道连通的第一空心顶针、第二空心顶针、第三空心顶针、第四空心顶针、第五空心顶针和第六空心顶针，所述下件本体上设置与所述第二流道连通的第七空心顶针和第八空心顶针，所述下件本体上设置与所述第三流道连通的第九空心顶针；

所述样本管能通过所述第一空心顶针、所述第一流道连通所述磁珠提取腔管；所述洗涤液管能通过所述第二空心顶针、所述第一流道连通所述磁珠提取腔管；所述洗脱液管能通过所述第三空心顶针、所述第一流道连通所述磁珠提取腔管；所述富集液管能通过所述第四空心顶针、所述第一流道连通所述磁珠提取腔管；所述磁珠提取腔管能通过所述第五空心顶针连通所述第一流道；所述开关阀能通过所述第六空心顶针连通所述第一流道；所述开关阀能通过所述第七空心顶针、所述第二流道连通所述反应腔室，所述试剂管能通过所述第八空心顶针、所述第二流道连通所述反应腔室，所述废液池管能通过所述第九空心顶针、所述第三流道连通所述反应腔室。

在本发明的一较佳实施方式中，所述下件本体上设置用于插装第一空心顶针、第二空心顶针、第三空心顶针、第四空心顶针、第五空心顶针、第六空心顶针、第七空心顶针、第八空心顶针和第九空心顶针的多个插针孔，各所述插针孔的底端设置针末端溶液开口，各所述插针孔的顶端设置直径呈增大设置的点胶孔，所述点胶孔内用于点胶以分别固定第一空心顶针、第二空心顶针、第三空心顶针、第四空心顶针、第五空心顶针、第七空心顶针、第八空心顶针和第九空心顶针。

在本发明的一较佳实施方式中，所述样本管的底端自下而上间隔设置第一下胶塞和第一上胶塞，所述第一上胶塞的上方设置样本腔，所述第一下胶塞和所述第一上胶塞之间设有与所述样本腔连通的第一连通腔，所述第一空心顶针的顶端能穿过所述第一下胶塞连通所述第一连通腔，且所述第一空心顶针的顶端能插入所述第一上胶塞内封闭；所述样本管的顶端设置气动胶塞，所述气动胶塞上设置气源针刺道。

在本发明的一较佳实施方式中，所述磁珠提取腔管的底端设置复用腔胶塞，所述复用腔胶塞的上方设置所述复用腔，所述第五空心顶针的顶端能穿过所述复用腔胶塞连通所述复用腔，所述磁珠提取腔管的顶端设置气动胶塞，所述气动胶塞上设置气源针刺道。

在本发明的一较佳实施方式中，所述废液池管的底端自下而上间隔设置第二下胶塞和第二上胶塞，所述废液池管内设置废液腔，所述第二下胶塞和所述第二上胶塞之间设有与所述废液腔连通的第二连通腔，所述第九空心顶针的顶端能穿过所述第二下胶塞连通所述第二连通腔，且所述第九空心顶针的顶端能插入所述第二上胶塞内封闭；所述废液池管的顶端设置废液池管盖，所述废液池管盖上设置出气孔以使废液腔与外界大气连通。

本发明的目的还可以这样实现，一种从复杂样本中特异检测核酸的方法，包括以下步骤：

步骤a、试剂预存储：在前述的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒中的样本管、洗涤液管、洗脱液管、富集液管、磁珠提取腔管和试剂管内进行试剂预存；

步骤b、样品采集：将采集的样品放入样本管；

步骤c、核酸释放：样品在样本管内进行病原体裂解，释放核酸；

步骤d、核酸捕获：准备配合用全集成仪器，将样本管和磁珠提取腔管下压连通，向样本管内吹气，样本管内的溶液流入到磁珠提取腔管的复用腔内与磁珠混合，在全集成仪器配合下完成磁珠捕获核酸的过程；

步骤e、核酸洗涤：下压洗涤液管使其与磁珠提取腔管连通，向洗涤液管内吹气，洗涤液管内的洗涤液流入磁珠提取腔管的复用腔内，洗涤磁珠，在全集成仪器配合下完成洗涤液回抽，完成磁珠捕获核酸的洗涤过程；

步骤f、核酸洗脱：下压洗脱液管使其与磁珠提取腔管连通，向洗脱液管内吹气，洗脱液管内的洗脱液流入磁珠提取腔管的复用腔内，洗脱磁珠，在全集成仪器配合下完成磁珠捕获核酸的洗脱过程；

步骤g、核酸富集：下压富集液管使其与磁珠提取腔管连通，向富集液管内吹气，使其内部溶液进入到磁珠提取腔管的复用腔内；下压开关阀，向磁珠提取腔管内吹气，磁珠提取腔管内提纯后的核酸样本溶液会穿过开关阀经流体管道流向反应腔室，核酸样本溶液流过核酸富集滤纸上被滤纸富集，富集后的溶液进入到废液池管内；

步骤h、核酸扩增：下压试剂管使其通过流体管道连通反应腔室，向试剂管内吹气，使其内部溶液进入并充满反应腔室和富集了核酸样本的核酸富集滤纸上；

步骤i、输出检测结果：对下件管道层中的反应腔室与核酸富集滤纸进行实时荧光检测，并不断绘制出荧光数值成荧光曲线，最终根据Ct值进行定量判断。

由上所述，本发明的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒及方法具有如下有益效果：

本发明中，集成设置样本管、磁珠提取腔管、提供核酸原位扩增反应试剂的试剂管、容置核酸富集滤纸和进行核酸原位扩增的反应腔室，将磁珠法核酸提纯技术与基于壳聚糖修饰的核酸富集滤纸及原位扩增检测技术相结合，用于全集成式从复杂样本中进行特异性、高灵敏的核酸检测；

本发明集成磁珠法核酸提纯的优势在于可以从复杂样本中提纯低载量核酸，避免了常规手动提取核酸所具有的流程复杂、时间长、对操作人员依赖性大且核酸提取效率低等问题，也避免了常规硅胶膜以及滤纸进行核酸提取时无法应对复杂样本的缺陷；本发明集成壳聚糖修饰的核酸富集滤纸进行二次核酸富集，可避免常规磁珠法进行核酸提取时洗脱样本无法全部上样检测，造成灵敏度低的缺陷；

本发明可在当下应用于多混拭子的核酸检测，如50混1、100混1，可避免常规方法进行50混1、100混1样本检测时综合体现的灵敏度低的问题，也可降低费用消耗；此外，本发明也可进一步拓展到液体活检领域，如对癌症进行特异性高灵敏检测。

附图说明

以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。

其中：

图1：为本发明的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒的爆炸分解图。

图2：为本发明的卡盒上盖、下件管道层与中间腔室体的装配示意图。

图3：为本发明的样本管及其下方第一空心顶针、顶针固定孔的分解图。

图4：为本发明的磁珠提取腔管及其下方第五空心顶针、顶针固定孔的分解图。

图5：为本发明的废液池管及其下方第九空心顶针、顶针固定孔的分解图。

图6：为本发明的下件本体及核酸富集滤纸的分解图。

图中：

1、卡盒上盖；

2、中间腔室体；

200、气动胶塞；201、气源针刺道；2021、第一上胶塞；2022、第二上胶塞；2031、第一下胶塞；2032、第二下胶塞；204、废液池管盖；205、出气孔；206、复用腔胶塞；

21、外壳；22、侧贴；23、管架；

241、样本管；242、洗涤液管；243、洗脱液管；244、富集液管；245、磁珠提取腔管；246、开关阀；247、试剂管；248、废液池管；

3、下件管道层；

31、短空心顶针；

32、长空心顶针；

33、顶针固定孔；331、点胶孔；332、插针孔；333、针末端溶液开口；

34、下件本体；

35、核酸富集滤纸；

36、流体管道；361、第一流道；362、第二流道；363、第三流道；

37、滤纸固定孔；

38、反应腔室。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图说明本发明的具体实施方式。

在此描述的本发明的具体实施方式，仅用于解释本发明的目的，而不能以任何方式理解成是对本发明的限制。在本发明的教导下，技术人员可以构想基于本发明的任意可能的变形，这些都应被视为属于本发明的范围。需要说明的是，当元件被称为“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“上”、“下”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

如图1至图6所示，本发明提供一种从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒，包括卡盒上盖1、中间腔室体2和下件管道层3；

中间腔室体2内设置能沿轴向移动的管件结构，管件结构包括多个溶液管，各溶液管内可存储一定量试剂，供给样本处理与检测时所需试剂；管件结构至少包括样本管241、磁珠提取腔管245和试剂管247；

样本管241用于卡盒上样和核酸释放；样本来源可以是咽拭子涮洗液、血液、动物组织、食品、病原微生物等含有DNA或RNA的样本；在上样前，内部还可预置冻干的蛋白酶K用于进行杂质蛋白消化处理；

磁珠提取腔管245采用磁珠法核酸提纯技术，磁珠提取腔管245内设有复用腔，复用腔内预置磁珠，磁珠用于磁吸捕获提取核酸，复用腔用于核酸提取、洗涤和洗脱；

试剂管247用于容置核酸原位扩增时的反应试剂；该反应试剂可为PCR试剂或等温扩增试剂，如RPA、Lamp等；

下件管道层3包括能扣合于中间腔室体底部的下件本体34，下件本体34上设置流体管道36和空心针结构，空心针结构能连通管件结构和流体管道36，起到打开流路的作用；流体管道36可对试剂进行微量操作；

下件本体34上还设置反应腔室38，反应腔室38能通过流体管道36连通磁珠提取腔管245和试剂管247，反应腔室38内能固定地设置核酸富集滤纸35，核酸富集滤纸35基于壳聚糖修饰，可进行核酸富集，并在核酸富集滤纸35上对核酸进行原位扩增；试剂管247能与反应腔室38连通以向其提供核酸原位扩增时的反应试剂，反应腔室38用于核酸富集和核酸原位扩增；反应腔室38可固定核酸富集滤纸35进行核酸捕获富集且捕获后可供核酸进行原位扩增。

卡盒上盖1能拆卸地扣合于中间腔室体2顶部。卡盒上盖1用于固定中间腔室体内管件结构，保证倒置时，不会有部件遗失。

本发明构成用以处理高复杂程度样本的集成式结构：将常规基于磁珠式进行核酸提纯的所有步骤均浓缩在卡盒内，可避免常规磁珠提取仪进行磁珠提取所具有的分时、分步以及需要人工干预带来的繁琐操作，只需一步上样即可配合卡盒全自动、全封闭式完成磁珠提取，受外界干扰可能性低。

本发明通过两级核酸提取富集实现超高灵敏度核酸检测：常规基于磁珠式进行核酸提取，在检测时无法将洗脱后的提纯样本全部上样，因而造成由于方法缺陷的灵敏度无法进一步提高的问题，本发明在磁珠提取后，集成了壳聚糖修饰的滤纸，可进一步将集成式磁珠提取洗脱后的样本进行富集、实现全部上样，再进行原位扩增，可大大提高核酸检测的灵敏度。在本发明的一具体实施例中，核酸检测的灵敏度达到20copies/ml，较现有技术中的100copies/ml，核酸检测的灵敏度有很大的提高。

本发明的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒中，集成设置样本管、磁珠提取腔管、提供核酸原位扩增反应试剂的试剂管、容置核酸富集滤纸和进行核酸原位扩增的反应腔室，将磁珠法核酸提纯技术与基于壳聚糖修饰的核酸富集滤纸及原位扩增检测技术相结合，用于全集成式从复杂样本中进行特异性、高灵敏的核酸检测；

本发明集成磁珠法核酸提纯的优势在于可以从复杂样本中提纯低载量核酸，避免了常规手动提取核酸所具有的流程复杂、时间长、对操作人员依赖性大且核酸提取效率低等问题，也避免了常规硅胶膜以及滤纸进行核酸提取时无法应对复杂样本的缺陷；本发明集成壳聚糖修饰的核酸富集滤纸进行二次核酸富集，可避免常规磁珠法进行核酸提取时洗脱样本无法全部上样检测，造成灵敏度低的缺陷；

本发明可在当下应用于多混拭子的核酸检测，如50混1、100混1，可避免常规方法进行50混1、100混1样本检测时综合体现的灵敏度低的问题，也可降低费用消耗；此外，本发明也可进一步拓展到液体活检领域，如对癌症进行特异性高灵敏检测。

进一步，如图1所示，管件结构还包括洗涤液管242、洗脱液管243和富集液管244，洗涤液管242内容置有洗涤液，洗涤液管242能与复用腔连通以向复用腔提供洗涤液，该洗涤液为含醇洗涤液，可洗去磁珠提取腔管245的复用腔内磁珠上非特异性吸附的蛋白质等杂质；

洗脱液管243内容置有洗脱液，洗脱液管243能与复用腔连通以向复用腔提供洗脱液，可从去除杂质的核酸-磁珠复合体上将核酸洗脱下来，以备富集、扩增检测用；

富集液管244内容置有核酸重悬溶液，富集液管244能与复用腔连通以向复用腔提供核酸重悬溶液，该核酸重悬溶液为稍偏酸性的DEPC溶液，可将洗脱后的核酸重悬，而后流过核酸富集滤纸35，进行核酸富集。

进一步，如图1所示，中间腔室体2内还设置废液池管248，废液池管248能与反应腔室38连通，废液池管248用于容纳流过核酸富集滤纸后的废液，避免检测过程开启中间腔室体2，减少污染。

进一步，如图1所示，中间腔室体2内还设置开关阀246，开关阀246用于连通或断开复用腔和下件本体34上的流体管道36。开关阀为连通结构，可将开关阀前后的流道置于连通或关闭状态。

进一步，如图6所示，流体管道36包括第一流道361、第二流道362和第三流道363，第一流道361与第二流道362和第三流道363均不连通，第二流道362和第三流道363均与反应腔室38连通；流体管道36可进行微升-纳升的流体操控；

如图1所示，下件本体34上设置与第一流道361连通的第一空心顶针、第二空心顶针、第三空心顶针、第四空心顶针、第五空心顶针和第六空心顶针，下件本体34上设置与第二流道362连通的第七空心顶针和第八空心顶针，下件本体34上设置与第三流道363连通的第九空心顶针；

第一空心顶针、第二空心顶针、第三空心顶针、第四空心顶针、第六空心顶针、第七空心顶针、第八空心顶针和第九空心顶针为短空心顶针31，第五空心顶针为长空心顶针32；各空心顶针均呈空心设置，可让试剂溶液贯穿流过；各短空心顶针具有一端斜口，可扎穿各溶液管及阀(样本管241、洗涤液管242、洗脱液管243、富集液管244、开关阀246、试剂管247、废液池管248)的底端，配合各溶液管的内腔进行溶液流路的开启与关闭，进行流体操控；

长空心顶针(第五空心顶针)具有一端斜口，处于磁珠提取腔管245的复用腔正下端，可进行复用腔内的流体操作。长度比短空心顶针稍长，可保证当复用腔下端被刺穿时，此长空心顶针可刺穿一定长距离，并与磁珠提取腔管245的复用腔内部下端形成一定的空间，进而可避免在进行磁珠操作时，磁珠会沉降导致堵住长空心顶针。

样本管241能通过第一空心顶针、第一流道361连通磁珠提取腔管245；洗涤液管242能通过第二空心顶针、第一流道361连通磁珠提取腔管245；洗脱液管243能通过第三空心顶针、第一流道361连通磁珠提取腔管245；富集液管244能通过第四空心顶针、第一流道361连通磁珠提取腔管245；磁珠提取腔管245能通过第五空心顶针连通第一流道361；开关阀246能通过第六空心顶针连通第一流道361，开关阀246能通过第七空心顶针、第二流道362连通反应腔室38，试剂管247能通过第八空心顶针、第二流道362连通反应腔室38，废液池管248能通过第九空心顶针、第三流道363连通反应腔室38。

进一步，如图1所示，下件本体34上设置用于插装固定第一空心顶针、第二空心顶针、第三空心顶针、第四空心顶针、第五空心顶针、第六空心顶针、第七空心顶针、第八空心顶针和第九空心顶针的多个顶针固定孔33；

如图3、图4、图5所示，各所述顶针固定孔33包括插针孔332，各插针孔332的底端设置针末端溶液开口333，各插针孔332的顶端设置直径呈增大设置的点胶孔331，点胶孔331内用于点胶以分别固定第一空心顶针、第二空心顶针、第三空心顶针、第四空心顶针、第五空心顶针、第七空心顶针、第八空心顶针和第九空心顶针。

插针孔332用于插针，孔径比空心顶针略大，用于保证点胶时，针不会左右晃动。当空心顶针插在插针孔332时，在点胶孔331内点胶即可固定住空心顶针，并将空心顶针四周密闭上。点胶优先选择紫外固话胶。

进一步，如图3所示，样本管241的底端自下而上间隔设置第一下胶塞2031和第一上胶塞2021，第一上胶塞2021的上方设置样本腔，第一下胶塞2031和第一上胶塞2021之间设有与样本腔连通的第一连通腔，初始状态时，第一空心顶针的顶端插设于第一下胶塞2031内且不扎穿，第一空心顶针的顶端封闭；工作状态时，第一空心顶针的顶端能穿过第一下胶塞2031连通第一连通腔，且第一空心顶针的顶端能插入第一上胶塞2021内封闭，使样本腔与流道不相通，无法进行流体操控；样本管241的顶端设置气动胶塞200，气动胶塞200上设置气源针刺道201。气源针刺道201的下端具有薄壁，可供外部气源连接的空心针扎穿该胶塞时，不具有很强的穿刺阻力。

气动胶塞200的外周侧具有2段环槽，用于密封样本管241的顶端；气动胶塞200内具有气源针刺道201，可让外部气源连接着另一刺破空心针扎穿该气动胶塞200，与内部腔体(样本腔)连接；当样本管下端的第一空心顶针扎破第一下胶塞2031时，即可进行流体的操控。

洗涤液管242、洗脱液管243、富集液管244和试剂管247的结构与样本管241的结构呈相同或相似设置。

进一步，如图4所示，磁珠提取腔管245的底端设置复用腔胶塞206，复用腔胶塞206的上方设置复用腔，第五空心顶针的顶端能穿过复用腔胶塞206连通复用腔，磁珠提取腔管245的顶端设置气动胶塞200，气动胶塞200上设置气源针刺道201。

磁珠提取腔管245与前面的溶液管(样本管241、洗涤液管242、洗脱液管243、富集液管244和试剂管247)有两个区别：其一，复用腔胶塞206为单层胶塞，少了一个上胶塞，原因在于，复用腔内部预置有磁珠，使用前，第五空心顶针(长空心顶针)的顶端扎在复用腔胶塞206中，复用腔内部封闭，在进行磁珠操作前，需先将磁珠提取腔管245下压一段距离，让第五空心顶针(长空心顶针)扎穿复用腔胶塞206，并穿过一段距离，让复用腔与第一流道361相连通；其二，该磁珠提取腔管上端的气动胶塞，初始状态为松弛状态，并未塞紧，外部会有铝箔封住，保证其不会漏液，使用时需将铝箔撕开，进而可保证其内部与外部大气相连通，保证进行磁珠操作时流体的顺畅。

进一步，如图5所示，废液池管248的底端自下而上间隔设置第二下胶塞2032和第二上胶塞2022，废液池管248内设置废液腔，第二下胶塞2032和第二上胶塞2022之间设有与废液腔连通的第二连通腔，第九空心顶针的顶端能穿过第二下胶塞2032连通第二连通腔，且第九空心顶针的顶端能插入第二上胶塞2022内封闭；废液池管248的顶端设置废液池管盖204，废液池管盖204上设置出气孔205，出气孔205为圆形小孔，出气孔205可使废液腔与外界大气连通，保持进液时的内部压力。

初始状态下，第九空心顶针的顶端为扎穿第二下胶塞2032状态，一直持续到卡盒内全部流体操控结束，无需再进废液，随后将废液池管248往下压，让第九空心顶针的顶端扎进第二上胶塞2022内，密封废液池管248。

进一步，如图2所示，中间腔室体2包括外壳21，外壳21的外壁上设置侧贴22，外壳21内设置管架23，管架23内设置多个容置通道，多个容置通道内分别能滑动地设置洗涤液管242、洗脱液管243、富集液管244、磁珠提取腔管245、开关阀246、试剂管247和废液池管248，卡盒上盖1能拆卸地扣合于管架的上方；样本管241设置于管架的外侧；下件管道层3扣合于外壳的底端。

进一步，如图6所示，反应腔室38内设置滤纸固定孔37，用于固定核酸富集滤纸35。基于壳聚糖修饰的核酸富集滤纸35用于富集磁珠提纯后的核酸，并对滤纸上的核酸进行原位扩增。反应腔室38内设置反应试剂，供于核酸扩增所需原料及引物探针体系。

以通过PCR检测“50混1”口腔拭子涮洗液中的新冠病毒为例，使用本发明的微流控卡盒进行从复杂样本中特异检测核酸的方法，包括：

步骤a、试剂预存储：在前述的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒中的样本管、洗涤液管、洗脱液管、富集液管、磁珠提取腔管和试剂管内进行试剂预存；

具体地，每个独立的溶液管(样本管241、洗涤液管242、洗脱液管243、富集液管244、磁珠提取腔管245、试剂管247)进行试剂预存，以备后续实验。

预存过程中，样本管241、洗涤液管242、洗脱液管243、富集液管244、试剂管247顶端的气动胶塞与底端的第一上胶塞与第一下胶塞作相应配合，磁珠提取腔管245顶端的气动胶塞与底端的复用腔胶塞206作相应配合；

其中：样本管241内预设20微升蛋白酶K，洗涤液管242内有优化后的700微升含醇洗涤液，洗脱液管243内预设200微升洗脱液，富集液管244内预设PH＝5.5的1mLDEPC水(DNase、RNase free)，磁珠提取腔管245内预设10微升磁珠，试剂管247内存储试剂可为PCR扩增MIX试剂；

步骤b、样品采集：将采集的样品放入样本管241；

具体地，使用50mL离心管(采样时的拭子涮洗管，现有技术)，内放30mL病毒裂解液，采集50个口腔拭子，采集后直接涮洗在离心管内，随即在管内进行核酸释放；选用新型冠状病毒(2019-nCoV)假病毒核糖核酸标准物质代替。样品采集时是将样本从离心管中转移到样本管241中，样本管241的容积为1～2ml；

步骤c、核酸释放：样品在样本管241内进行病原体裂解，释放核酸；

具体地，离心管内为病毒裂解液，一旦样本进去后，便可进行病原体裂解，释放核酸。

步骤d、核酸捕获：准备配合用全集成仪器，将样本管241和磁珠提取腔管245下压连通，向样本管241内吹气，样本管241内的溶液流入到磁珠提取腔管245的复用腔内与磁珠混合，在全集成仪器配合下完成磁珠捕获核酸的过程；

具体地，准备配合用全集成仪器，全集成仪器的结构不唯一，只需满足以下四个条件即可：具有小型集成式气泵，气泵末端需带有进出气的空心针，保证可与各个溶液管顶端的气动胶塞配合进行流体操控；具有可控磁控模块，用于在磁珠提取腔管245内磁珠进行核酸提取-洗涤-洗脱全过程中提供可控的磁场；具有温度控制模块，也即温控部件，可供反应时所需温度；具有荧光检测模块，也即荧光检测部件，对反应腔室38及核酸富集滤纸35处的荧光进行实时读取即可。

在进行核酸捕获时，需先将样本管241和磁珠提取腔管245下压，第一空心顶针的顶端穿过样本管241底端的第一下胶塞2031连通第一连通腔，第五空心顶针的顶端穿过复用腔胶塞206连通复用腔，样本管241和磁珠提取腔管245的内腔连通；

接着将外接气泵空心针(现有技术)插进样本管241顶端气动胶塞200的气源针刺道201中，开始往样本管241内吹气，此时，样本管241内的溶液流入到磁珠提取腔管245的复用腔内与磁珠混合，并持续缓慢吹气，起到“吐泡泡”吹打混匀的效果；一段时间后，停止吹气，配合全集成仪器进行磁吸，让磁珠贴附在磁珠提取腔管的侧壁上，然后样本管241内进行抽气，将复用腔内的溶液抽回至样本管241内；再下压样本管241，第一空心顶针的顶端扎进第一上胶塞2021中，将第一空心顶针关闭，即完成了整个磁珠捕获核酸的过程。

步骤e、核酸洗涤：下压洗涤液管242使其与磁珠提取腔管245连通，向洗涤液管242内吹气，洗涤液管242内的洗涤液流入磁珠提取腔管245的复用腔内，洗涤磁珠，在全集成仪器配合下完成洗涤液回抽，完成磁珠捕获核酸的洗涤过程；

具体地，将洗涤液管242下压一段距离，第二空心顶针的顶端穿过洗涤液管242底端的第一下胶塞2031，将洗涤液管242与磁珠提取腔管245连通；

接着，将外接气泵空心针(现有技术)插进洗涤液管242顶端气动胶塞200的气源针刺道201中，并持续往里吹气，此时，其内部溶液进入到磁珠提取腔管245的复用腔内；此时，移去全集成仪器的磁吸模块，继续吹气，磁珠将充分重悬至洗涤液中，持续吹气一段时间，充分洗涤，除去非特异性吸附的蛋白等杂质；停止吹气，配合全集成仪器磁吸模块进行磁珠吸附，将磁珠吸附至磁珠提取腔管两侧，然后让洗涤液管242开始抽气，将磁珠提取腔管245内的洗涤废液抽回至洗涤液管242；再下压洗涤液管242，让第二空心顶针扎进第一上胶塞2021中，将第二空心顶针关闭，即完成了整个磁珠捕获核酸的洗涤过程。

步骤f、核酸洗脱：下压洗脱液管243使其与磁珠提取腔管245连通，向洗脱液管243内吹气，洗脱液管243内的洗脱液流入磁珠提取腔管245的复用腔内，洗脱磁珠，在全集成仪器配合下完成磁珠捕获核酸的洗脱过程；

具体地，将洗脱液管243下压一段距离，第三空心顶针的顶端穿过洗脱液管243底端的第一下胶塞2031，将洗脱液管243与磁珠提取腔管245连通；

接着，将外接气泵空心针(现有技术)插进洗脱液管243顶端气动胶塞200的气源针刺道201中，并持续往里吹气，此时，其内部溶液进入到磁珠提取腔管245的复用腔内；此时移去全集成仪器的磁吸模块，随着继续吹气，磁珠将充分重悬至洗脱液中，持续吹气一段时间，充分洗脱；停止吹气，下压洗脱液管243，让第三空心顶针的顶端扎进第一上胶塞2021中，将第三空心顶针关闭，即完成了整个磁珠捕获核酸的洗脱过程。

步骤g、核酸富集：下压富集液管244使其与磁珠提取腔管245连通，向富集液管244内吹气，使其内部溶液进入到磁珠提取腔管245的复用腔内(富集液和洗脱液混合，进而将洗脱液内含有的核酸分散在富集液中，以备后续进行滤纸的捕获富集)；下压开关阀246，向磁珠提取腔管245内吹气，磁珠提取腔管245内提纯后的核酸样本溶液会穿过开关阀246经流体管道36流向反应腔室38，核酸样本溶液流过核酸富集滤纸35上被滤纸富集，富集后的溶液进入到废液池管248内；

具体地，将富集液管244下压一段距离，第四空心顶针的顶端穿过富集液管244底端的第一下胶塞2031，将富集液管244与磁珠提取腔管245连通；

接着，将外接气泵空心针(现有技术)插进富集液管244顶端气动胶塞200的气源针刺道201中，并持续往里吹气，此时，其内部溶液进入到磁珠提取腔管245的复用腔内；此时配合全集成仪器的磁吸模块，随着缓慢吹气，磁珠将慢慢被吸附到磁珠提取腔管两侧壁上；停止吹气，下压富集液管244，让第四空心顶针的顶端扎进第一上胶塞2021中，将第四空心顶针关闭；

密封磁珠提取腔管245的气动胶塞，让其密封住磁珠提取腔管245的复用腔；下压开关阀246一段距离，第六空心顶针和第七空心顶针均与开关阀内腔连通，开关阀246呈打开流通状态；接着，将外接气泵空心针(现有技术)插进磁珠提取腔管245顶端的气动胶塞200的气源针刺道201中，并持续往里吹气，此时，磁珠提取腔管245内提纯后的核酸样本溶液会穿过开关阀246经第二流道362流向反应腔室，核酸样本溶液流过核酸富集滤纸35上被滤纸富集，富集后的溶液经第三流道363、第九空心顶针进入到废液池管248内。

步骤h、核酸扩增：下压试剂管247使其通过流体管道36连通反应腔室38，向试剂管247内吹气，使其内部溶液进入并充满反应腔室38和富集了核酸样本的核酸富集滤纸35上；

具体地，将试剂管247下压一段距离，第八空心顶针的顶端穿过试剂管247底端的第一下胶塞2031，将试剂管247与第二流道362相连通；接着，将外接气泵空心针(现有技术)插进试剂管247顶端的气动胶塞200的气源针刺道201中，并持续缓慢往里吹气，此时，试剂管247内部溶液会进入并充满反应腔室38和富集了核酸样本的核酸富集滤纸35上；

步骤i、输出检测结果：配合全集成仪器的荧光检测模块(现有技术)，对下件管道层3中的反应腔室38与核酸富集滤纸35进行实时荧光检测，并不断绘制出荧光数值成荧光曲线，最终根据Ct值进行定量判断。

由上所述，本发明的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒及方法具有如下有益效果：

本发明中，集成设置样本管、磁珠提取腔管、提供核酸原位扩增反应试剂的试剂管、容置核酸富集滤纸和进行核酸原位扩增的反应腔室，将磁珠法核酸提纯技术与基于壳聚糖修饰的核酸富集滤纸及原位扩增检测技术相结合，用于全集成式从复杂样本中进行特异性、高灵敏的核酸检测；

本发明集成磁珠法核酸提纯的优势在于可以从复杂样本中提纯低载量核酸，避免了常规手动提取核酸所具有的流程复杂、时间长、对操作人员依赖性大且核酸提取效率低等问题，也避免了常规硅胶膜以及滤纸进行核酸提取时无法应对复杂样本的缺陷；本发明集成壳聚糖修饰的核酸富集滤纸进行二次核酸富集，可避免常规磁珠法进行核酸提取时洗脱样本无法全部上样检测，造成灵敏度低的缺陷；

本发明可在当下应用于多混拭子的核酸检测，如50混1、100混1，可避免常规方法进行50混1、100混1样本检测时综合体现的灵敏度低的问题，也可降低费用消耗；此外，本发明也可进一步拓展到液体活检领域，如对癌症进行特异性高灵敏检测。

以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作出的等同变化与修改，均应属于本发明保护的范围。

Claims (11)

1.一种从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒，其特征在于，包括卡盒上盖、中间腔室体和下件管道层；所述中间腔室体内设置管件结构，所述管件结构至少包括样本管、磁珠提取腔管和试剂管，所述样本管用于卡盒上样和核酸释放；所述试剂管用于容置核酸原位扩增时的反应试剂；所述下件管道层包括能扣合于中间腔室体底部的下件本体，所述下件本体上设置流体管道和空心针结构，所述空心针结构能连通所述管件结构和所述流体管道，所述下件本体上还设置反应腔室，所述反应腔室能通过所述流体管道连通所述磁珠提取腔管和所述试剂管，所述反应腔室内能固定地设置核酸富集滤纸，所述试剂管能与所述反应腔室连通以向其提供核酸原位扩增时的反应试剂，所述反应腔室用于核酸富集和核酸原位扩增；所述卡盒上盖能拆卸地扣合于中间腔室体顶部。

2.如权利要求1所述的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒，其特征在于，所述磁珠提取腔管内设有复用腔，所述复用腔内预置磁珠，所述磁珠用于磁吸捕获提取核酸，所述复用腔用于核酸提取、洗涤和洗脱。

3.如权利要求2所述的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒，其特征在于，所述管件结构还包括洗涤液管、洗脱液管和富集液管，所述洗涤液管内容置有洗涤液，所述洗涤液管能与所述复用腔连通以向复用腔提供洗涤液；所述洗脱液管内容置有洗脱液，所述洗脱液管能与所述复用腔连通以向复用腔提供洗脱液；所述富集液管内容置有核酸重悬溶液，所述富集液管能与所述复用腔连通以向复用腔提供核酸重悬溶液。

4.如权利要求3所述的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒，其特征在于，所述中间腔室体内还设置废液池管，所述废液池管能与所述反应腔室连通，所述废液池管用于容纳流过核酸富集滤纸后的废液。

5.如权利要求4所述的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒，其特征在于，所述中间腔室体内还设置开关阀，所述开关阀用于连通或断开所述复用腔和所述下件本体上的流体管道。

6.如权利要求5所述的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒，其特征在于，所述流体管道包括第一流道、第二流道和第三流道，所述下件本体上设置与所述第一流道连通的第一空心顶针、第二空心顶针、第三空心顶针、第四空心顶针、第五空心顶针和第六空心顶针，所述下件本体上设置与所述第二流道连通的第七空心顶针和第八空心顶针，所述下件本体上设置与所述第三流道连通的第九空心顶针；

所述样本管能通过所述第一空心顶针、所述第一流道连通所述磁珠提取腔管；所述洗涤液管能通过所述第二空心顶针、所述第一流道连通所述磁珠提取腔管；所述洗脱液管能通过所述第三空心顶针、所述第一流道连通所述磁珠提取腔管；所述富集液管能通过所述第四空心顶针、所述第一流道连通所述磁珠提取腔管；所述磁珠提取腔管能通过所述第五空心顶针连通所述第一流道；所述开关阀能通过所述第六空心顶针连通所述第一流道；所述开关阀能通过所述第七空心顶针、所述第二流道连通所述反应腔室，所述试剂管能通过所述第八空心顶针、所述第二流道连通所述反应腔室，所述废液池管能通过所述第九空心顶针、所述第三流道连通所述反应腔室。

7.如权利要求6所述的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒，其特征在于，所述下件本体上设置用于插装第一空心顶针、第二空心顶针、第三空心顶针、第四空心顶针、第五空心顶针、第六空心顶针、第七空心顶针、第八空心顶针和第九空心顶针的多个插针孔，各所述插针孔的底端设置针末端溶液开口，各所述插针孔的顶端设置直径呈增大设置的点胶孔，所述点胶孔内用于点胶以分别固定第一空心顶针、第二空心顶针、第三空心顶针、第四空心顶针、第五空心顶针、第七空心顶针、第八空心顶针和第九空心顶针。

8.如权利要求6所述的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒，其特征在于，所述样本管的底端自下而上间隔设置第一下胶塞和第一上胶塞，所述第一上胶塞的上方设置样本腔，所述第一下胶塞和所述第一上胶塞之间设有与所述样本腔连通的第一连通腔，所述第一空心顶针的顶端能穿过所述第一下胶塞连通所述第一连通腔，且所述第一空心顶针的顶端能插入所述第一上胶塞内封闭；所述样本管的顶端设置气动胶塞，所述气动胶塞上设置气源针刺道。

9.如权利要求6所述的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒，其特征在于，所述磁珠提取腔管的底端设置复用腔胶塞，所述复用腔胶塞的上方设置所述复用腔，所述第五空心顶针的顶端能穿过所述复用腔胶塞连通所述复用腔，所述磁珠提取腔管的顶端设置气动胶塞，所述气动胶塞上设置气源针刺道。

10.如权利要求6所述的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒，其特征在于，所述废液池管的底端自下而上间隔设置第二下胶塞和第二上胶塞，所述废液池管内设置废液腔，所述第二下胶塞和所述第二上胶塞之间设有与所述废液腔连通的第二连通腔，所述第九空心顶针的顶端能穿过所述第二下胶塞连通所述第二连通腔，且所述第九空心顶针的顶端能插入所述第二上胶塞内封闭；所述废液池管的顶端设置废液池管盖，所述废液池管盖上设置出气孔以使废液腔与外界大气连通。

11.一种从复杂样本中特异检测核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a、试剂预存储：在如权利要求3至10任一项所述的从复杂样本中特异检测核酸的微流控卡盒中的样本管、洗涤液管、洗脱液管、富集液管、磁珠提取腔管和试剂管内进行试剂预存；

步骤b、样品采集：将采集的样品放入样本管；

步骤c、核酸释放：样品在样本管内进行病原体裂解，释放核酸；

步骤d、核酸捕获：准备配合用全集成仪器，将样本管和磁珠提取腔管下压连通，向样本管内吹气，样本管内的溶液流入到磁珠提取腔管的复用腔内与磁珠混合，在全集成仪器配合下完成磁珠捕获核酸的过程；

步骤e、核酸洗涤：下压洗涤液管使其与磁珠提取腔管连通，向洗涤液管内吹气，洗涤液管内的洗涤液流入磁珠提取腔管的复用腔内，洗涤磁珠，在全集成仪器配合下完成洗涤液回抽，完成磁珠捕获核酸的洗涤过程；

步骤f、核酸洗脱：下压洗脱液管使其与磁珠提取腔管连通，向洗脱液管内吹气，洗脱液管内的洗脱液流入磁珠提取腔管的复用腔内，洗脱磁珠，在全集成仪器配合下完成磁珠捕获核酸的洗脱过程；

步骤g、核酸富集：下压富集液管使其与磁珠提取腔管连通，向富集液管内吹气，使其内部溶液进入到磁珠提取腔管的复用腔内；下压开关阀，向磁珠提取腔管内吹气，磁珠提取腔管内提纯后的核酸样本溶液会穿过开关阀经流体管道流向反应腔室，核酸样本溶液流过核酸富集滤纸上被滤纸富集，富集后的溶液进入到废液池管内；

步骤h、核酸扩增：下压试剂管使其通过流体管道连通反应腔室，向试剂管内吹气，使其内部溶液进入并充满反应腔室和富集了核酸样本的核酸富集滤纸上；

步骤i、输出检测结果：对下件管道层中的反应腔室与核酸富集滤纸进行实时荧光检测，并不断绘制荧光数值成荧光曲线，最终根据Ct值进行定量判断。

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