CN110804609A - 一种全血rna快速裂解液及应用 - Google Patents

一种全血rna快速裂解液及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种不需要先裂解红细胞的全血RNA快速裂解液及RNA提取方法，该方法大限度的减少有毒试剂的使用，简化了RNA提取步骤，纯化获得的RNA完整性好，纯度高，可直接用于RT‑PCR、Northern blot、Dot blot等各种分子生物学实验；本发明公开了一种全血RNA快速裂解液，每1000ml体积由以下组分用量组成：硫氰酸胍，0.2M‑4M；硫氰酸铵，0.2M‑3M；无水乙酸钠，0.01M‑0.2M；冰乙酸，0.05‑0.3M；月桂酰基肌氨酸钠，0.1％‑2％(W/V)；氯化钠，0.02M‑0.3M；甘油，1％‑15％(V/V)；水饱和酚溶液，10％‑75％(V/V)；其余为DEPC处理水。

Description

一种全血RNA快速裂解液及应用
技术领域
本发明涉及血液RNA提取技术领域，尤其涉及一种全血RNA快速裂解液及应用。
背景技术
血液由于其易获得的特性，使其在临床辅助检查手段中使用占比最高。血液检查不仅是诊断各种血液病的主要依据，对其他系统疾病的诊断和鉴别也可以提供许多重要信息。RNA提取是分子生物学研究中一项基本内容，是进行基因表达分析的基础。全血RNA的快速提取节省了从事临床研究的科研工作者的时间，降低了RNA降解的概率，而且能加速对某些疾病的快速诊断。
根据提取RNA吸附介质的不同，血液RNA提取的主要方法有沉淀法、磁珠法及硅胶柱法。沉淀法是运用RNA不溶于乙醇和异丙醇的特性，将RNA进行离心沉淀的方法。该方法操作步骤繁琐，耗时长，且通量低，所获得RNA质量不稳定。磁珠法和硅胶柱法的基本原理相同，只是磁珠法是在分离液盐和外加磁场的作用下将RNA富集到磁珠上，从而实现分离。而硅胶柱法是在分离液盐的作用下将RNA富集到固相硅胶柱上，通过离心实现分离。
提取方法从细胞裂解的方式分，有Trizol法(苯酚法)、SDS法、CTAB法、硫氰酸胍法等多种，以及结合蛋白酶K运用的方法。
Trizol法由于通用性好，RNA提取质量高，常用于血液RNA提取；但其步骤中使用的氯仿为一种有毒试剂，对实验操作者的健康不利。本发明有效避开该种有毒试剂，提取效果却不亚于Trizol法提取效果。在其他各种细胞裂解方式方法中均需要先进行红细胞裂解，获得白细胞后再进行裂解,该类方法在操作上存在耗时的特点，不利于大量样本的RNA提取。本发明所述裂解液不需要先裂解红细胞，能有效缩短RNA提取时间。
当前柱法提取RNA的基本原理为：在样本前处理及裂解液裂解的作用下，RNA从细胞中释放；在高盐低pH的溶液下，将含RNA的上清转移到核酸纯化柱上，离心后RNA结合于核酸纯化柱；在洗液1的作用下，进一步将核酸纯化柱膜中的蛋白等杂质去除；在洗液2的条件下，进一步将核酸纯化柱膜中的盐离子进行去除；最后在低盐条件下将RNA从纯化柱中洗脱。
本发明提供一种不需先裂解红细胞的全血RNA快速裂解液及RNA提取方法，简化了实验步骤，缩短了整个RNA提取时间,同时大限度的减少有毒试剂的使用。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种全血RNA快速裂解液，每1000ml体积由以下组分质量/体积组成：
硫氰酸胍，0.2M-4M；
硫氰酸铵，0.2M-3M；
无水乙酸钠，0.01M-0.2M；
冰乙酸，0.05-0.3M；
月桂酰基肌氨酸钠，0.1％-2％(W/V)；
氯化钠，0.02M-0.3M；
甘油，1％-15％(V/V)；
水饱和酚溶液，10％-75％(V/V)；
其余为DEPC处理水。
所述全血RNA快速裂解液在全血柱法提取RNA的应用；
包括以下步骤：
步骤一，全血裂解：在2ml离心管中加入1ml所述快速裂解液，再加入500μl新鲜全血或骨髓，盖上管盖，涡旋振荡30秒，13,000rpm离心10分钟；
步骤二，含RNA上清过纯化柱：在一个新的1.5ml离心管中加入400μl无水乙醇，吸取700μl步骤一的离心上清转移到该管中，用吸头吹吸混匀；吸取600μl混合物转移到核酸纯化柱中，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，将余下的混合物转移到核酸纯化柱中，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤三，洗涤，去蛋白：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管，加入500μl洗液1，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤四，洗涤，去盐：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管，加入700μl洗液2，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤五，洗脱RNA：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，14,000rpm离心1分钟；弃去滤液和离心管，将核酸纯化柱置于一个无RNA酶的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50μl RNase-Free Water，盖紧管盖，室温静置1分钟，12,000rpm离心30秒；弃纯化柱，洗脱的RNA可立即用于分子生物学实验或者储存于-80℃备用。
优选的，所述的核酸纯化柱是表面覆盖有SiO2材料的硅胶吸附柱。
优选的，所述洗液1配方为硫氰酸胍0.5M-4M、Tris-HCl(pH6.0-pH8.0)10mM-100mM、EDTA-2Na(pH8.0)10mM-50mM，无水乙醇占比40％-60％。
优选的，所述洗液2为Tris-HCl(pH6.0-pH8.0)10mM-100mM、氯化钠20mM-300mM，无水乙醇占比60％-80％。
优选的，所述RNase-Free Water为0.1％的DEPC处理水。
本发明的有益效果：使得本发明的快速裂解液无需事先分离白细胞，使全血RNA的提取时间大大缩短，具有快速、简洁、高效的特点；纯化获得的RNA完整性好，纯度高，可直接用于RT-PCR、Northern blot、Dot blot等各种分子生物学实验。
全血样本既可为新鲜全血，也可为-80℃冻存全血，可在裂解完全血后，暂停后续操作，将裂解后的全血直接冻存于-20℃或-80℃，后续再进行实验操作时不影响RNA的完整性及得率。
附图说明
图1中左1、右1分别是本发明使用实施例1及实施例2中裂解液对人抗凝全血进行裂解，并在13,000rpm离心10分钟后的分层情况图。
图2是采用本发明实施例1配方，对4份新鲜人抗凝全血进行RNA提取的电泳检测图；其中泳道M为DL 2,000DNAMarker。
图3是采用本发明实施例3，对-80℃存储一个月抗凝全血进行RNA提取的电泳检测图；其中泳道M为DL 2,000DNAMarker。
图4是采用本发明实施例4，对3份新鲜抗凝全血进行快速裂解后，取上清于-20℃存储一周，然后进行后续提取步骤所得RNA电泳检测图。
具体实施方式
实施例1
一种快速全血RNA裂解液配制方法，每1000ml体积由以下组分质量/体积组成：
硫氰酸胍，236.32g
硫氰酸铵，60.89g
无水乙酸钠，4.102g
冰乙酸，14.25ml
月桂酰基肌氨酸钠，2.5g
氯化钠，11.68g
甘油，75ml
水饱和酚溶液，500ml
其余为DEPC处理水。
对4份500μl人抗凝全血进行快速裂解液并提取RNA，包括以下步骤：
步骤一，全血裂解：在2ml离心管中加入1ml所述快速裂解液，再加入500μl新鲜人抗凝全血，盖上管盖，涡旋振荡30秒，13,000rpm离心10分钟；4份分层情况一致，取一份拍照，如图1左1所示；
步骤二，含RNA上清过纯化柱：在一个新的1.5ml离心管中加入400μl无水乙醇，吸取700μl步骤一的离心上清转移到该管中，用吸头吹吸混匀；吸取600μl混合物转移到核酸纯化柱中，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，将余下的混合物转移到核酸纯化柱中，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤三，洗涤，去蛋白：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管，加入500μl洗液1，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤四，洗涤，去盐：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管，加入700μl洗液2，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤五，洗脱RNA：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，14,000rpm离心1分钟；弃去滤液和离心管，将核酸纯化柱置于一个无RNA酶的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50μl RNase-Free Water，盖紧管盖，室温静置1分钟，12,000rpm离心30秒；弃纯化柱，洗脱的RNA可立即用于分子生物学实验或者储存于-80℃备用。
表1为四份全血按实施例1方案提取RNA,在多功能酶标仪上检测的OD数值。
Figure BDA0002220482520000051
表1
实施例2
一种全血RNA快速裂解液配制方法，每1000ml体积由以下组分质量/体积组成：
硫氰酸胍，118.16g
硫氰酸铵，30.45g
无水乙酸钠，8.20g
冰乙酸，21.5ml
月桂酰基肌氨酸钠，5g
氯化钠，5.84g
甘油，50ml
水饱和酚溶液，300ml
其余为DEPC处理水。
对1份500μl人抗凝全血进行快速裂解液并提取RNA，包括以下步骤：
步骤一，全血裂解：在2ml离心管中加入1ml所述快速裂解液，再加入500μl新鲜人抗凝全血，盖上管盖，涡旋振荡30秒，13,000rpm离心10分钟；分层情况如图1右1所示；
步骤二，含RNA上清过纯化柱：在一个新的1.5ml离心管中加入400μl无水乙醇，吸取700μl步骤一的离心上清转移到该管中，用吸头吹吸混匀；吸取600μl混合物转移到核酸纯化柱中，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，将余下的混合物转移到核酸纯化柱中，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤三，洗涤，去蛋白：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管，加入500μl洗液1，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤四，洗涤，去盐：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管，加入700μl洗液2，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤五，洗脱RNA：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，14,000rpm离心1分钟；弃去滤液和离心管，将核酸纯化柱置于一个无RNA酶的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50μl RNase-Free Water，盖紧管盖，室温静置1分钟，12,000rpm离心30秒；弃纯化柱，洗脱的RNA可立即用于分子生物学实验或者储存于-80℃备用。
实施例3
一种全血RNA快速裂解液配制方法，每1000ml体积由以下组分质量/体积组成：
硫氰酸胍，236.32g
硫氰酸铵，152.24g
无水乙酸钠，2.75g
冰乙酸，9.5ml
月桂酰基肌氨酸钠，2.5g
氯化钠，5.84g
甘油，75ml
水饱和酚溶液，500ml
其余为DEPC处理水。
对3份-80℃存储一个月的人抗凝全血进行RNA提取，包括以下步骤：
步骤一，全血裂解：在2ml离心管中加入1ml所述快速裂解液，再加入500μl解冻后的人抗凝全血，盖上管盖，涡旋振荡30秒，13,000rpm离心10分钟；
步骤二，含RNA上清过纯化柱：在一个新的1.5ml离心管中加入400μl无水乙醇，吸取700μl步骤一的离心上清转移到该管中，用吸头吹吸混匀；吸取600μl混合物转移到核酸纯化柱中，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，将余下的混合物转移到核酸纯化柱中，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤三，洗涤，去蛋白：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管，加入500μl洗液1，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤四，洗涤，去盐：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管，加入700μl洗液2，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤五，洗脱RNA：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，14,000rpm离心1分钟；弃去滤液和离心管，将核酸纯化柱置于一个无RNA酶的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50μl RNase-Free Water，盖紧管盖，室温静置1分钟，12,000rpm离心30秒；弃纯化柱，洗脱的RNA可立即用于分子生物学实验或者储存于-80℃备用。
实施例4
按照实施例3的裂解液配方，对3份新鲜人抗凝全血进行RNA提取，包括以下步骤：
步骤一，全血裂解：在2ml离心管中加入1ml所述快速裂解液，再加入500μl解冻后的人抗凝全血，盖上管盖，涡旋振荡30秒，13,000rpm离心10分钟；
步骤二，将700μl上清转移至一个新的1.5ml离心管中，-20℃存储一周后再进入步骤三；
步骤三，在上述含上清的1.5ml离心管中加入400μl无水乙醇，用吸头吹吸混匀；吸取600μl混合物转移到核酸纯化柱中，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，将余下的混合物转移到核酸纯化柱中，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤四，洗涤，去蛋白：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管，加入500μl洗液1，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤五，洗涤，去盐：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管，加入700μl洗液2，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤六，洗脱RNA：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，14,000rpm离心1分钟；弃去滤液和离心管，将核酸纯化柱置于一个无RNA酶的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50μl RNase-Free Water，盖紧管盖，室温静置1分钟，12,000rpm离心30秒；弃纯化柱，洗脱的RNA可立即用于分子生物学实验或者储存于-80℃备用。
提取RNA进行琼脂糖凝胶电泳结果见图4。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种全血RNA快速裂解液，其特征在于，每1000ml体积由以下组分质量/体积组成：
硫氰酸胍，0.2M-4M；
硫氰酸铵，0.2M-3M；
无水乙酸钠，0.01M-0.2M；
冰乙酸，0.05M-0.3M；
月桂酰基肌氨酸钠，0.1％-2％(W/V)；
氯化钠，0.02M-0.3M；
甘油，1％-15％(V/V)；
水饱和酚溶液，10％-75％(V/V)；
其余为DEPC处理水。
2.根据权利要求1所述全血RNA快速裂解液在全血柱法提取RNA的应用。
3.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，全血裂解：在2ml离心管中加入1ml所述快速裂解液，再加入500μl新鲜全血或骨髓，盖上管盖，涡旋振荡30秒，13,000rpm离心10分钟；
步骤二，含RNA上清过纯化柱：在一个新的1.5ml离心管中加入400μl无水乙醇，吸取700μl步骤一的离心上清转移到该管中，用吸头吹吸混匀；吸取600μl混合物转移到核酸纯化柱中，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，将余下的混合物转移到核酸纯化柱中，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤三，洗涤，去蛋白：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管，加入500μl洗液1，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤四，洗涤，去盐：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管，加入700μl洗液2，盖紧管盖，13,000rpm离心1分钟；
步骤五，洗脱RNA：弃去滤液，将核酸纯化柱放回到2ml离心管中，14,000rpm离心1分钟；弃去滤液和离心管，将核酸纯化柱置于一个无RNA酶的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50μl RNase-Free Water，盖紧管盖，室温静置1分钟，12,000rpm离心30秒；弃纯化柱，洗脱的RNA可立即用于分子生物学实验或者储存于-80℃备用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的核酸纯化柱是表面覆盖有SiO2材料的硅胶吸附柱。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述洗液1配方为硫氰酸胍0.5M-4M、Tris-HCl(pH6.0-pH8.0)10mM-100mM、EDTA-2Na(pH8.0)10mM-50mM，无水乙醇占比40％-60％。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述洗液2为Tris-HCl(pH6.0-pH8.0)10mM-100mM、氯化钠20mM-300mM，无水乙醇占比60％-80％。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述RNase-Free Water为0.1％的DEPC处理水。
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