CN112458082A - 快速一步法核酸提取试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸提取技术领域，具体为一种快速一步法核酸提取试剂及其制备方法，快速一步法核酸提取试剂包括下述原料：氢氧化钠（NaOH）、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、醋酸钾（KAc）。与传统的离心柱法、萃取法、磁珠法等核酸提取方法相比，本发明无需复杂的样本处理过程，在常温状态下，无需特殊的仪器和操作设备，仅需一次加入本提取试剂盒试剂，5分钟内即可对样本进行核酸提取并可用于PCR扩增，大大缩短核酸提取时间、降低试剂成本，提高检测效率。
Description
技术领域
本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及快速一步法核酸提取试剂及其应用。
背景技术
现有技术公开了一种用于提取植物DNA的提取液及其提取方法，包括NaAc、EDTANa2、NaCl、PVP、SDS和水，提取效果好，可以有效去除细胞中的蛋白质及有机杂质，不含对人体有害的酚、氯仿等化合物，使用安全方便；所述提取液用于提取植物DNA时快速简便，可在一个小时内完成提取，取得的DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。现有技术还提供了一种DNA提取液以及芝麻叶片基因组DNA的提取方法，属于生物技术领域，包括以下浓度的组分：1.2～1.8mol·L-1的氯化锂，20～40mmol·L-1的EDTA，2～6g·L-1的PVP-4000。现有这些方法都能获得高质量DNA，但是提取过程繁琐，技术、设备要求高、耗时长。因此，配制一种DNA快速提取液是实现POCT的第一步。目前市场上的一些快速一步提取液虽然缩短了提取时间，但是仍存在所提DNA纯度较差，会对后续扩增反应造成影响；需要高温加热的步骤，不适用于POCT等问题。
发明内容
本研究主要开发一种快速一步提取液，同时与2种商用试剂盒与2种商用一步法提取液进行对比，发现本发明是效果较好且所需时间短的最适宜的提取液，满足POCT的要求。
本发明采用如下技术方案：
快速一步法核酸提取试剂，由氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾、水组成；其中氢氧化钠的浓度为0.5 mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为10 mmol/L，醋酸钾的浓度为3 mol/L。
上述快速一步法核酸提取试剂的制备方法，将氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾加入水中，组成快速一步法核酸提取试剂。
本发明公开了上述快速一步法核酸提取试剂在提取组织DNA中的应用或者上述快速一步法核酸提取试剂在制备提取组织DNA的提取液中的应用。比如组织为猪肝。利用本发明提取试剂提取组织DNA的时候，静置的时间为1～6min，优选为2～5分钟，更优选为2分钟。本发明方法能够达到简单快速的标准，使用本发明DNA一步提取液进行组织DNA提取时，整个提取过程不到5 min。
本发明利用所述快速一步法核酸提取试剂作为提取液进行提取组织基因组DNA时，不仅能保证所提取的DNA浓度高、完整性好，可作为模板用于PCR扩增，还能节省提取的时间，并且耗费低、安全环保。
附图说明
图1为DNA模板进行PCR扩增后的电泳照片，注：泳道1~6分别为静置1、2、3、4、5、6min(原液为模板)；泳道7~12分别为静置1、2、3、4、5、6min(稀释10倍为模板)；13为阳性对照（TIANGEN提取DNA原液）；14为阴性对照。
具体实施方式
本发明的创造性在于提供新的提取试剂，可以在5分钟内完成组织DNA的提取，经过稀释后，作为模板进行扩增，具有扩增结果清晰、提取液浓度高、纯度好的优点。
实验材料
主要仪器
主要试剂耗材
实施例一 一步法DNA提取试剂（0.5 mol/L NaOH+10 mmol/L Na2EDTA+3 mol/L KAc）的配制
快速一步法核酸提取试剂由氢氧化钠（NaOH）、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）、醋酸钾（KAc）、水组成，将氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾加入水中，常规混合，组成快速一步法核酸提取试剂，即一步法DNA提取试剂；其中氢氧化钠的浓度为0.5 mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为10 mmol/L，醋酸钾的浓度为3 mol/L。
对比例一
将氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠加入水中，组成一步法DNA提取试剂，其中氢氧化钠的浓度为0.5 mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为10 mmol/L。
对比例二
将氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾加入水中，组成一步法DNA提取试剂，其中氢氧化钠的浓度为0.5 mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为10 mmol/L，醋酸钾的浓度为5 mol/L。
提取
称取猪肝样品20mg,剪成芝麻粒大小，加入提取试剂200μL，静置2min后常规吸取上清；将上清液用水稀释10倍作为PCR扩增模板，整个过程不到5分钟。提取试剂分别为实施例一、对比例一、对比例二的一步法DNA提取试剂。
另外分别按照所购买的两种试剂盒以及两种一步法快提试剂的提取步骤进行DNA提取，得到上清液。
浓度与纯度测定
将上述7种方法所提的猪肝DNA用Nanodrop2000c核酸蛋白仪检测，获得DNA浓度和A260nm/A280nm比值。具体数据见表1。
本发明实施例一的一步法DNA提取试剂对PCR扩增的效果
称取猪肝样品20mg,剪成芝麻粒大小，加入实施例一的提取试剂200μL，静置后取上清；从加入提取试剂开始计时，分别常规吸取静置1、2、3、4、5、6min后的样品上清并置于新的1.5ml离心管中；将上清稀释10 倍与未稀释的上清分别作为DNA模板进行PCR扩增、电泳。实验结果见图1。
称取猪肝样品20mg，剪成芝麻粒大小，采用现有试剂盒提取DNA，作为DNA模板进行上述同样的PCR扩增、电泳。实验结果见图1。
PCR反应体系配制：
PCR反应程序：
琼脂糖凝胶电泳检测
琼脂板放入电泳池，贴紧边缘，样品依次进样4.5µL，mark(100bp)进样1.5µL。电泳程序：U=140V I=200mA time=30min。
凝胶成像
将琼脂板置于凝胶成像仪，进行电泳跑样的部分处于正中央→启动凝胶成像系统→开启300nm光源，调整对焦，变焦，光圈，使图像清晰→扫描图像→关闭光源，保存图片，取出琼脂板。
实验结果
由表1可以看出，本发明的提取液与TIANGEN组织基因组提取试剂盒的提取浓度与纯度(A260/A280)均较好，但是TIANGEN组织基因组提取试剂盒所需时间较长，需2 h左右，不适用于快速的POCT，而本发明的提取液在5 min内即可完成DNA提取。在测试成本方面，本发明的提取液成本远低于试剂盒。在辅助设备方面，本发明无需辅助设备，室温静置2min即可取上清，而TIANGEN组织基因组提取试剂盒的操作过程需要加热、高速离心等步骤；柱式动物线粒体DNAout，PCR级（北京天恩泽）的提取纯度好，但是浓度较低；两种商品化的通用一步DNA提取液提取浓度较高，但是这两种方法都需要高温加热且时间长，不如本发明提取方法室温下进行，适用于POCT。对比例一和二结果显示，本发明的自配一步提取液在提取浓度和纯度上均有显著提高。
图1结果显示，使用实施例一提取试剂提取时，未稀释模板无法有效扩增，稀释10倍作为模板时，静置2~6min的5个不同时间所提DNA的扩增产物电泳条带均清晰，与13泳道条带相当，静置1min时电泳条带较暗。
本研究以猪肝为实验材料, 选择合适的提取液与商品化试剂盒以及市场上的通用一步法提取试剂进行DNA提取质量的比较，实验结果显示，使用本发明的自配一步提取方法整个提取过程只需不到5 min，提得的DNA能够满足PCR扩增的要求，该方法达到了简单、快速和现场提取的标准。
序列表
<110> 苏州普瑞姆生物科技有限公司
<120> 快速一步法核酸提取试剂及其制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (10)
1.快速一步法核酸提取试剂，其特征在于，所述快速一步法核酸提取试剂包括氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾。
2.根据权利要求1所述快速一步法核酸提取试剂，其特征在于，所述快速一步法核酸提取试剂由氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾、水组成。
3.根据权利要求2所述快速一步法核酸提取试剂，其特征在于，氢氧化钠的浓度为0.5mol/L。
4.根据权利要求2所述快速一步法核酸提取试剂，其特征在于，乙二胺四乙酸二钠的浓度为10 mmol/L。
5.根据权利要求2所述快速一步法核酸提取试剂，其特征在于，醋酸钾的浓度为3 mol/L。
6.权利要求1所述快速一步法核酸提取试剂的制备方法，将氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾加入水中，组成快速一步法核酸提取试剂。
7.权利要求1所述快速一步法核酸提取试剂在制备提取组织DNA的提取液中的应用。
8.权利要求1所述快速一步法核酸提取试剂在提取组织DNA中的应用。
9.氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾的混合物在制备提取组织DNA的提取液中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述混合物还包括水。
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