CN117070672A - 新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品及其制备方法和应用 - Google Patents

新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117070672A
CN117070672A CN202311249880.1A CN202311249880A CN117070672A CN 117070672 A CN117070672 A CN 117070672A CN 202311249880 A CN202311249880 A CN 202311249880A CN 117070672 A CN117070672 A CN 117070672A
Authority
CN
China
Prior art keywords
quality control
nucleic acid
novel coronavirus
vector
variant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311249880.1A
Other languages
English (en)
Inventor
赵冉
陈颖玮
王雪亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI CENTER FOR CLINICAL LABORATORY
Original Assignee
SHANGHAI CENTER FOR CLINICAL LABORATORY
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI CENTER FOR CLINICAL LABORATORY filed Critical SHANGHAI CENTER FOR CLINICAL LABORATORY
Priority to CN202311249880.1A priority Critical patent/CN117070672A/zh
Publication of CN117070672A publication Critical patent/CN117070672A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品及其制备方法和应用，所述质控品为利用构建的表达载体p‑MS2‑VLP1至p‑MS2‑VLP10所制备的噬菌体病毒样颗粒(VLP)VLP1至VLP10中的一种或多种。本发明制备的新冠病毒变异株质控品相较于其他质控品类型，假病毒颗粒与真实病毒样本相似度高，其外壳蛋白包裹RNA的结构可以耐受核酸酶降解，具有较好的稳定性，降低了质控品在使用、保存和运输过程中的要求，并且可以对从核酸提取到扩增的检测全过程进行监控。

Description

新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于新型冠状病毒检测领域，特别涉及新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品及其制备方法和应用。
背景技术
目前，针对新冠病毒核酸检测及变异株突变位点检测多采用实时荧光PCR法等分子生物学检测技术。实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强、检测周期短、可自动化、高通量批处理等特点，在快速检测、筛选和识别新发呼吸道病毒病原体方面发挥着重要作用，被认为是新冠检测的金标准。实时荧光定量PCR法检测新冠病毒及其变异株的步骤一般包括样本中病毒核酸提取、RNA逆转录、扩增、结果判断等。使用质控品对检测各环节进行质量控制对于确保检测结果的准确性具有重要意义，用于核酸检测质量控制的性能稳定、特征明确的质控品是不可或缺的。
然而，新冠病毒变异株检测质控品较难获得，目前已有的新冠病毒变异株检测质控品仅包括个别变异株，且均为病毒提取的RNA，不仅生产成本高，难以大量获得，且因裸露的RNA极易降解，对保存运输条件要求极高。因此，需要一种生产制备成本低廉、易于稳定保存、安全可靠并能够模拟真实病毒样本检测全过程的新冠病毒变异株及突变位点检测质控品，应用于各检测实验室试剂及方法的质量管理工作。
已知某些天然存在的RNA病毒如MS2噬菌体其外壳可以耐受核糖核酸酶的作用，若将病毒靶基因序列包裹到这些病毒外壳内，就可以使特定的RNA序列免受环境中RNA酶的降解，同时，还可作为质控品模拟真实病毒颗粒，监测核酸提取过程中病毒裂解效率、RNA逆转录过程质量等。近年来，随着对该技术的不断探索，制备内含靶标RNA序列的MS2噬菌体病毒样颗粒(VLP)已成为可能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品及其制备方法和应用，该质控品安全、稳定且低成本，可应用于不同新冠病毒突变株及野生型分型检测质量监控，或作为不同新冠病毒变异株检测试剂盒阳性及阴性对照品使用。
本发明提供了一种新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品，利用构建的表达载体p-MS2-VLP1至p-MS2-VLP10所制备的噬菌体病毒样颗粒(VLP)VLP1至VLP10中的一种或多种。
所述质控品通过将合成序列克隆至原核表达载体中，获得载体p-MS2，然后在载体p-MS2下游插入相应添加了包装位点序列的病毒变异株突变位点cDNA序列获得假病毒颗粒表达载体，后通过蛋白诱导表达及纯化制备而得。
所述合成序列如SEQ NO.1所示。
所述添加了包装位点序列的病毒变异株突变位点cDNA序列如SEQ NO.2-11所示。
所述原核表达载体为单标达框载体或双表达框质粒。
所述单表达框载体骨架包括pET30、pET28中的至少一种；所述双表达框载体骨架包括pET-Duet、pACYC-Duet中的至少一种。
本发明还提供了一种新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品的制备方法，包括如下步骤：
将合成序列克隆至原核表达载体中，获得载体p-MS2，然后在载体p-MS2下游插入相应添加了包装位点序列的病毒变异株突变位点cDNA序列，最后进行放大培养，诱导表达和纯化，得到新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品。
本发明还提供了一种新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品在新冠病毒突变株及野生型分型检测中的应用。
本发明的特点如下：
(1)本发明通过优化MS2包膜蛋白包装序列密码子，采用携带一C碱基突变的包裹序列引导下游外源核酸，实现了包裹3000bp-4000bp长度的外源核酸序列的VLP高效率表达。此外，还通过单表达框载体(如pET30、pET28等)、双表达框载体(如pET-Duet、pACYC-Duet)等多种不同载体骨架选择，分别设计构建表达系统，并通过不同诱导条件选择等工艺优化，最终实现VLP生产效率的大幅提高，蛋白粗纯化产物从约6mg/L可提高至20g/L。
(2)在VLP生产制备过程中因使用到表达载体及大肠杆菌等原核表达系统，因此产物中会残留有大量的细菌蛋白、核酸以及质粒DNA，如果不去除将直接影响到质控样品的性能，特别是质粒DNA，未经核酸提取和反转录过程即可检测为阳性，即便只有微量残留，在指数级扩增后也会对结果构成显著影响。因此，生产制备的VLP终产物质量将直接影响其作为质控品的实际使用效果。如何在生产工艺中完全去除DNA残留，得到高纯度的VLP质控品终产物，是该技术的另一个难题。目前已知的多项研究中，其VLP产物或直接使用细胞裂解后的上清液，或仅经过简易纯化处理，在体系中仍残留的DNA及细胞蛋白等杂质不仅影响PCR反应效率，且无法如实反映RNA检测核酸提取及逆转录过程的质量。在本发明中，通过组合使用包括超速离心、超滤膜过滤、硫酸铵沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)沉淀、亲和纯化、分子筛纯化、核酸酶消化等在内的多种蛋白及核酸纯化手段，最终建立一种VLP产物纯化工艺流程，达到完全去除产物中残留核酸的目的，以得到高纯度VLP质控品，用于监测RNA病毒核酸检测从提取、逆转录到扩增的全过程质量。
(3)本发明通过序列两端添加含有C突变的RNA操纵子序列以及使用大肠杆菌双表达框载体，实现包含有较长外源序列(3800bp以上)VLP的高效率表达(图1、图2)
(4)本发明VLP内包裹序列以RNA形式存在(表1)，可较好地模拟真实病毒样本检测全过程以监控其检验过程质量。
(5)本发明通过多种生物理化手段去除VLP产物中的核酸残留(图2)，生产得到的VLP中没有质粒DNA的残留(表2、图6)，可较好地模拟真实病毒样本检测全过程，尤其是监控核酸提取及反转录过程质量。
(6)本发明所生产制备的VLP在不添加稳定剂的情况下，室温及以下温度条件下可稳定保存至少8周，在37℃条件下稳定保存4周(图7)，反复冻融5次不影响检测效果(图8)，可充分满足临床使用需求。
表1 VLP内包裹序列以RNA形式存在(可实现逆转录过程的质量监控)
表2 VLP终产物完全去除质粒DNA残留(可实现核酸提取过程的质量监控)
有益效果
本发明制备的新冠病毒变异株质控品相较于其他质控品类型，假病毒与真实病毒样本相似度高，其外壳蛋白包裹RNA的结构可以耐受核酸酶降解，具有较好的稳定性，降低了质控品在使用、保存和运输过程中的要求，并且可以对从核酸提取到扩增的检测全过程进行监控。而相较于慢病毒载体系统，使用MS2噬菌体VLP技术研制质控品，生产成本低廉、设备要求简单，不依赖真核细胞培养，无感染性且复制缺陷，是理想的RNA病毒核酸检测评价物质制备方法。此外，除RNA病毒外，MS2噬菌体病毒样颗粒技术同样可应用于临床上其他RNA检测项目质控品的研发与制备，例如甲型流感病毒核酸检测、人免疫缺陷病毒核酸检测、白血病融合基因(BCR-ABL、AML1-ETO等)检测等，可有效缩短后续其他RNA检测质控品研发周期，降低制备成本，提高生产效率。
附图说明
图1为新冠参考株S基因野生型对照VLP质控品；
图2为去除核酸残留的新冠参考株S基因野生型对照VLP质控品、新冠Omicron变异株S基因突变检测VLP质控品；
图3为本发明质控品的制备工艺示意图；
图4为基于单表达框载体pET-30b改造的表达载体p-MS2示意图；
图5为基于双表达框载体pACYCduet1改造的表达载体p-MS2示意图；
图6为提取后扩增与未提取扩增曲线比较；
图7为未添加稳定剂的VLP质控品不同存储条件下的稳定性；
图8为VLP质控品反复冻融5次的稳定性；
图9为B.1.617.1变异株三突变位点检测VLP质控品表达载体示意图；
图10为高(1*106copy/ml，检测结果Ct值24.73)、中(2*104copy/ml，检测结果Ct值30.12)、低(1*103copy/ml，检测结果Ct值32.98)浓度质控品模拟样本检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
Kappa(B.1.617.1) L452R-E484Q-P681R Seq No.7 VLP6(690bp)
以VLP6为例(基于pET-30b载体，还可用于VLP1、VLP8等其他VLP)
步骤：
一、表达菌株的构建及验证
(1)顺序合成Seq No.1及Seq No.7序列并连接到pET-30b载体(BglII及NotI酶切位点)上，构建表达载体pET30b-MS2-VLP6(如图9)并测序验证。
(2)上述表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态：1μL载体质粒溶液加入到100μL感受态中，冰浴30min后42℃热激90s后冰浴2min，再加入800μL LB培养基，37℃200rpm孵育45min后取100μL涂布于卡那抗性平板(卡那霉素终浓度为50mg/L)。
(3)挑选单菌落(克隆子)5个及以上，同时使用携带pET-30b质粒的表达菌株作为空载对照，分别培养菌液后1％接种于30mL的LB液体培养基(加入卡那霉素至终浓度50mg/L)，37℃、200rpm培养至OD600约0.6-0.8。
(4)取其中一个含pET30b-MS2-VLP6载体的表达菌株作为未诱导对照，其余菌株各加入终浓度0.5mM的IPTG。37℃、220rpm诱导4h。
(5)使用50mL离心管，6000rpm、10min离心收集菌体，用3mL的2mM、pH7.0的PBS重悬。
(6)在25％功率、开2s关5s的工作条件下用宁波新芝型号为JY92-IIN的超声仪冰浴破碎3min(超声后液体呈透光状态)。
(7)超声破碎处理后的悬浮液在4℃、8000rpm下离心10min以去除细胞碎片。
(8)将离心后的破碎上清转移至新的4mL离心管内，选用3mL的2mM、pH7.0的PBS重悬破碎沉淀。
(9)选用12％Precast-GLgel Tris-Glycine预制胶进行SDS-PAGE检测验证各个表达菌株的破碎上清及沉淀。
(10)根据SDS-PAGE电泳结果选择具有最高目的蛋白(大小约14kDa)表达水平的克隆子作为出发菌株进行后续实验。
二、诱导表达条件优化
(1)上述最优表达菌株菌液1％接种于多个含30mL LB液体培养基(加入卡那霉素至终浓度50mg/L)的培养瓶中，37℃、220rpm振荡培养至OD600约0.6-0.8。分别设置不同的IPTG终浓度(0.2mM、1mM)、温度(37℃、16℃、25℃)及诱导时间(4h、18h)等条件，
(2)选用12％Precast-GLgel Tris-Glycine预制胶进行SDS-PAGE电泳检测比较不同诱导条件下的蛋白表达量，选择具有最高蛋白表达量的诱导条件进行后续放大培养。
三、放大培养及粗纯化
(1)使用步骤一表达菌株培养菌液，1％接种于装有125mL LB培养基的500ml摇瓶(加入卡那霉素至终浓度50mg/L)，后置于摇床中，37℃、250rpm培养，一段时间后酶标仪检测OD600至0.9。
(2)将20mL的种子液接种至装有1.5L无菌培养基的3L发酵罐，37℃培养24h至OD600为82，根据步骤二的诱导条件加入IPTG并诱导表达(培养过程中补料至1.8L)。
(3)培养结束后离心收集菌体，用TBS缓冲液(25mM Tris-Hcl，140mM NaCl，3mMKCl)重悬菌体至900mL。使用高压均质机进行对其破碎至不再粘稠。
(4)加入PEI至终浓度0.77％，离心去除沉淀，收集破碎上清，使用10kD的滤膜进行超滤处理。超滤处理过程中使用超纯水、10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)进行pH调节及Na+的稀释，最终超滤得到等体积粗纯化溶液。
(5)SDS-PAGE分别验证均质破碎后的上清、沉淀，PEI处理后的上清、沉淀，超滤处理后的蛋白溶液稀释液及超滤处理过程中得到的透过液。同时使用BSA配制标准蛋白溶液(2μg、1μg、0.5μg)作为蛋白定量对照。选用12％Precast-GLgel Tris-Glycine预制胶电泳后计算均质液离心上清中目的蛋白含量及PEI离心上清超滤液中目的蛋白量，估算产率。
(6)同时使用BCA法分别检测均质液离心上清、PEI离心上清、PEI离心沉淀、PEI离心上清超滤液及透过液中蛋白浓度，估算产率。
四、VLP产物进一步纯化
(1)取上述包含高浓度VLP的PEI离心上清超滤液(粗纯化溶液)，加入Benzonase核酸酶(终浓度50-100U/ml)及MgCl2(终浓度2mM)，37℃消化2h，期间摇匀。
(2)按照下述条件进行Ni柱亲和层析纯化：平衡缓冲液：PBS,300mM NaCl,10％glycerol,pH7.4；清洗缓冲液：PBS,300mM NaCl,10％glycerol,pH7.4 with 20mM and50mMimidazole；洗脱缓冲液：PBS,300mM NaCl,10％glycerol,pH7.4 with 500mMimidazole，产物进行SDS-PAGE分析。
(3)上述层析纯化流出样进一步进行凝胶过滤层析(GE Superdex75)纯化(柱体积：400mL，流速：2mL/min，柱压：＜0.3Mpa；分子筛纯化缓冲液：PBS，300mM NaCl，10％Glycerol，pH7.4)，产物进行SDS-PAGE分析。
五、鉴定与应用
(1)按上述步骤制备包括各新冠变异株突变位点序列的VLP，使用病毒核酸提取试剂(如西安天隆科技有限公司Ex-DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒、重庆中元汇吉生物技术有限公司病毒核酸提取试剂盒(磁珠法)、上海之江生物医药科技有限公司病毒核酸提取试剂、凯杰QIAamp Viral RNA Mini Kit等)提取核酸，反转录PCR(Thermo ScientificRevertAid RT试剂盒)并测序鉴定VLP内含有靶标RNA，所用引物如下：
T7-F：TAATACGACTCACTATAGGG；
S-tag-F：GAACGCCAGCACATGGACAG；
MS2-F：TCGCGTTCACAGGCTTACAA；
T7-ter：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG；
MS2-R：TCTGGGTTGCCACTTTAGGC。
(2)使用国家标准物质(如GBW09315新型冠状病毒(2019-nCoV)贝塔B.1.351变异株基因组RNA标准物质、GBW09317新型冠状病毒(2019-nCoV)伽马P.1变异株基因组RNA标准物质、GBW09316新型冠状病毒(2019-nCoV)德尔塔B.1.617变异株基因组RNA标准物质、GBW09318新型冠状病毒(2019-nCoV)奥密克戎BA.1.1变异株基因组RNA标准物质)进行定量：将VLP样本稀释103-106倍后分别提取核酸，将国家标准物质进行10倍梯度稀释后作为定量标准品，使用ABI 7500及相应检测试剂盒(如江苏硕世生物科技股份有限公司(硕世)新型冠状病毒(B.1.1.7株)S基因N501Y和69-70del突变检测试剂盒、硕世新型冠状病毒(B.1.1.7株)S基因N501Y和P681H突变检测试剂盒、硕世新型冠状病毒S基因E484K突变、K417N突变、K417T突变、E484Q突变、L452R突变、P681R突变、N501Y突变等检测试剂盒，上海伯杰医疗科技有限公司(伯杰)新型冠状病毒2019-nCoV-N501Y-69-70del-E484K-K417T/N突变核酸检测试剂盒、伯杰新型冠状病毒2019-nCoV-B.1.617突变核酸检测试剂盒等)按照说明书对各提取的核酸进行实时荧光RT-PCR，检测定量计算所制备VLP拷贝数。
(3)按照定量结果进行稀释，
为使质控品更加准确地模拟临床样本，根据新冠星都核酸检测临床样本主要为咽拭子等，故使用与常规采样一致的通用型病毒保存液稀释VLP样本，并另加入正常人的咽拭子样本以使质控品样本中含有口腔黏膜上皮细胞等成分。咽拭子样本的采集过程参考WHO的指导文件进行，使用病毒采样拭子采集两个月内未患疾病的多位健康成人咽拭子样本50份，拭子头放入收集器或直接浸入装有2～3mL通用型病毒保存液的15mL离心管中，并剪去杆部。待咽拭子样本收集完毕后将所有咽拭子样本混合加入到制备的VLP质控品样本盘中，混匀后-80℃冰箱保存待用。
(4)VLP制备各新冠变异株检测质控品样本盘：
除单突变位点检测试剂盒(如硕世新型冠状病毒S基因E484K突变、K417N突变、K417T突变、E484Q突变、L452R突变、P681R突变、N501Y突变等检测试剂盒)外，为满足各变异株核酸检测质控需求(如使用伯杰新型冠状病毒2019-nCoV-B.1.617突变核酸检测试剂盒等)，可将制备的各VLP进行组合得到新冠各变异株主要突变位点核酸检测质控品，用于区分鉴定各不同变异株时的质量控制。各变异株包括主要的变异位点主要集中在S基因上，各VLP可组合如下：
变异株 VLP组合
Alpha(B.1.1.7) VLP1+VLP2+VLP3
Beta(B.1.351) VLP4
Gamma(P.1) VLP5
Kappa(B.1.617.1) VLP6
Delta(B.1.617.2) VLP7+VLP8
Omicron(B.1.1.529) VLP9
参考株(野生型) VLP10
同时根据定量结果计算得出各VLP所含特定RNA的拷贝数，制备各个浓度的核酸检测模拟样本(每份样本中所包含的各个基因序列的拷贝数比例为1:1)，具体浓度如下：高浓度(105-106copy/ml)、中浓度(104-105copy/ml)、低浓度(103-104copy/ml)，结果如图10所示。
(5)均匀性、稳定性评价
根据中国合格评定国家认可委员会(CNAS)公布实施的《能力验证样品均匀性和稳定性评价》文件要求及建议，对制备的各质控品样本进行均匀性及稳定性评价(图7、图8)，确保制备的质控品满足临时实际使用需求。

Claims (8)

1.一种新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品，其特征在于：利用构建的表达载体p-MS2-VLP1至p-MS2-VLP10所制备的噬菌体病毒样颗粒VLP1至VLP10中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的质控品，其特征在于：所述质控品通过将合成序列克隆至原核表达载体中，获得载体p-MS2，然后在载体p-MS2下游插入相应添加了包装位点序列的病毒变异株突变位点cDNA序列，经诱导表达并纯化而得。
3.根据权利要求2所述的质控品，其特征在于：所述合成序列如SEQ NO.1所示。
4.根据权利要求2所述的质控品，其特征在于：所述添加了包装位点序列的病毒变异株突变位点cDNA序列如SEQ NO.2-11所示。
5.根据权利要求2所述的质控品，其特征在于：所述原核表达载体为单标达框载体或双表达框质粒。
6.根据权利要求5所述的质控品，其特征在于：所述单表达框载体骨架包括pET30、pET28中的至少一种；所述双表达框载体骨架包括pET-Duet、pACYC-Duet中的至少一种。
7.一种如权利要求1-6任一所述的新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品的制备方法，包括如下步骤：
将合成序列克隆至原核表达载体中，获得载体p-MS2，然后在载体p-MS2下游插入相应添加了包装位点序列的病毒变异株突变位点cDNA序列，最后进行放大培养，蛋白诱导表达和纯化，得到新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品。
8.一种如权利要求1-6任一所述的新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品在新冠病毒突变株及野生型分型检测中的应用。
CN202311249880.1A 2023-09-26 2023-09-26 新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品及其制备方法和应用 Pending CN117070672A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311249880.1A CN117070672A (zh) 2023-09-26 2023-09-26 新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311249880.1A CN117070672A (zh) 2023-09-26 2023-09-26 新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117070672A true CN117070672A (zh) 2023-11-17

Family

ID=88708169

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311249880.1A Pending CN117070672A (zh) 2023-09-26 2023-09-26 新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117070672A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107502608B (zh) 用于敲除人ALDH2基因的sgRNA、ALDH2基因缺失细胞株的构建方法及应用
CN106318934B (zh) 胡萝卜β(1,2)木糖转移酶的基因全序列及用于转染双子叶植物的CRISPR/CAS9的质粒构建
CN106755089B (zh) 表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用
CN112029803A (zh) 一种慢病毒过表达病毒载体及其制备方法、用途
CN117070672A (zh) 新型冠状病毒变异株或突变位点核酸检测质控品及其制备方法和应用
CN111690669A (zh) Sva 3c蛋白在促进猪源病毒复制中的应用
CN111500586A (zh) 特异结合狂犬病毒l蛋白加帽区的核酸适配体及其应用
CN111454910A (zh) 表达猪cd163和cd169分子的悬浮pk15细胞系
CN114277048A (zh) 一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质及其应用
CN115786384A (zh) 威尼斯镰刀菌tb01的整合位点及其应用
CN109777818B (zh) 标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组ev71疫苗外源基因拷贝数的方法及方法的应用
CN109777819B (zh) 一种检测重组cva16疫苗外源基因拷贝数的标准质粒、检测方法及其应用
CN109485714B (zh) Tlk蛋白及其在虾蟹类抗病毒品系育种中的应用
CN113584080A (zh) 一种Nluc标记的重组猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建及其应用
CN114107176A (zh) 一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系及其构建方法和应用
CN107034232B (zh) Atg16l1基因在增强新城疫病毒的复制能力中的用途
CN103421764A (zh) 一种真菌病毒双链rna快速提取试剂盒及其应用
CN113416713A (zh) 一种重组腺病毒的构建及其应用
CN108265059B (zh) 一种重组粉尘螨2类变应原蛋白及其制备方法与应用
CN117363644B (zh) Vigs沉默效率报告质粒、评价沉默效率的方法及应用
CN114990078B (zh) 带有His标签的重组新城疫病毒的构建方法及用途
CN112574995B (zh) 用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA基因编辑的gRNA引物及其应用
CN114921485B (zh) 病毒样颗粒质控检测品及其制备方法
CN112538460B (zh) 一种提高猪圆环病毒增殖的方法
CN114410813B (zh) 一种在全基因组水平鉴定植物基因组dna胞嘧啶四联体位点的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination