CN115786384A - 威尼斯镰刀菌tb01的整合位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种威尼斯镰刀菌TB01的整合位点，包括两个整合位点，其分别位于：威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游5438bp处和威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游4499bp处，以及威尼斯镰刀菌TB01的整合位点在威尼斯镰刀菌TB01基因工程中的应用，保证靶基因能够可靠、高效、稳定的表达。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种威尼斯镰刀菌TB01的整合位点及其应用。
背景技术
威尼斯镰刀菌是从3000多株真菌中筛选到的可用于发酵生产菌丝蛋白的工业菌株。该菌株发酵产生的菌丝蛋白与单细胞蛋白相比更加味美，具有类似肉质的组织结构，并且能够提供很好的营养平衡，包括脂肪含量低，氨基酸种类齐全，富含微量元素、维生素及利于人胃肠蠕动的可食性粗纤维。因此，具有部分或全部替代动物性和植物性蛋白质食品的潜力。
为了获得性状更加优良的威尼斯镰刀菌菌株以促进其在菌丝蛋白发酵生产上的应用，目前已成功建立该菌株的遗传转化体系和基因编辑体系。基于这些体系，我们可以顺利完成对靶标基因的敲除，但是如何保证靶基因可靠、高效、稳定的表达还有待探索。当前，真菌中实现靶基因表达的主要方式又依赖于真菌自我复制质粒和在基因组上随机整合。然而，利用自我复制质粒表达标靶基因的明显缺点是，其在没有选择压力的情况下很容易在宿主中(包括威尼斯镰刀菌TB01)丢失；而靶标基因在基因组上随机整合往往表现出基因表达水平不一至，同时可能破坏宿主内源重要基因。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种威尼斯镰刀菌TB01的整合位点，包括两个配套CRISPR/Cas9系统使用的整合位点，其分别位于：威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游5438bp处和威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游4499bp处。
还提供了一种威尼斯镰刀菌TB01的整合位点在威尼斯镰刀菌TB01基因工程中的应用，便于对威尼斯镰刀菌TB01的基因组进行定点修饰，保证了靶基因能够可靠、高效、稳定的表达。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种威尼斯镰刀菌TB01的整合位点，包括两个配套CRISPR/Cas9系统使用的整合位点，其分别位于：威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游5438bp处和威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游4499bp处。
优选的是，GFP表达盒在所述威尼斯镰刀菌TB01上的插入位点为1号染色体FVRRES_00686基因上游4886bp处。
一种包含威尼斯镰刀菌TB01的整合位点的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
一种向所述的威尼斯镰刀菌TB01的整合位点定点插入不同启动子驱动下的GFP表达盒，含有用于GFP表达盒在威尼斯镰刀菌TB01定点插入所需的CRISPR/Cas9表达载体和供体DNA。
一种向所述的威尼斯镰刀菌TB01的整合位点插入基因的方法，针对向威尼斯镰刀菌TB01整合位点定向插入靶基因，构建包含CRISPR/Cas9序列和sgRNA序列的表达载体及相应的供体DNA片段，将所述的载体和供体片段转化所述的威尼斯镰刀菌TB01。
一种威尼斯镰刀菌TB01的整合位点的鉴定方法，包括以下步骤：
S1、通过原生质体转化法将GFP表达盒导入到威尼斯镰刀菌TB01中，获得GFP表达文库；
S2、从所述GFP表达文库中筛选出中性插入且能够高表达的荧光菌株；
S3、鉴定GFP表达盒在所述荧光菌株中的插入位点，其插入位点具体为1号染色体FVRRES_00686基因上游4886bp处；
S4、以步骤S3确定的插入位点为中心，选取其上下游各600bp区域作为候选序列，采用CRISPR/Cas9介导的基因同源定向重组插入；
S5、通过CRISPR/Cas9介导靶标基因对步骤S4中选取的候选序列进行整合效率、遗传稳定性、菌株生长评估后，确认威尼斯镰刀菌TB01的整合位点包括权利要求1所述的两个整合位点。
一种威尼斯镰刀菌TB01的整合位点在威尼斯镰刀菌TB01基因工程中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、包括两个整合位点，其分别位于：威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游5438bp处和威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游4499bp处。
第二、提供了一种威尼斯镰刀菌TB01的整合位点在威尼斯镰刀菌TB01转基因中的应用，便于对威尼斯镰刀菌TB01的基因组进行定点修饰，保证了靶基因能够可靠、高效、稳定的表达。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为GFP表达盒载体构建电泳图和GFP随机表达文库构建示意图；
图2为GFP中性插入及高表达菌株的获得图；
图3为荧光菌株中GFP表达盒在基因组上插入位点的鉴定图；
图4为鉴定位点在威尼斯镰刀菌TB01基因组上的分布示意图；
图5为CRISPR/Cas9介导靶标基因在鉴定位点的整合效率评估；
图6为GFP表达盒定点插入鉴定位点的荧光转化子平均荧光强度测定图；
图7为GFP表达盒定点插入鉴定位点的荧光转化子发酵3天后生物量和碳源转化率测定图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本申请提供的威尼斯镰刀菌TB01，其保藏编号为CGMCC NO.20740，分类命名为镰刀菌Fusarium venenatum，于2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。
实施例1、GFP表达文库的建立
1.1引物
1.2片段扩增及同源重组程序
1.3实验方法
以引物对Ptef-1/2从威尼斯镰刀菌TB01的DNA基因组中扩出内源tef启动子序列(FVRRES_13282)，以引物对GFPT-1/2从前期构建好的pK2-GFP-hpt载体上扩增包含GFP阅读框和Ttrpc终止子的片段。随后通过融合PCR进行两轮扩增，将tef启动子片段与GFP-Ttrpc片段进行融合获得Ptef-GFP-Ttrpc，并通过同源重组酶将融合后的片段连接到骨架载体pK2-hpt上获得pK2-Ptef-GFP-Ttrpc-hpt载体，并将其导入到大肠杆菌DH5α后挑选单菌落用引物对GFP-1/2对其进行PCR验证，获得阳性转化子。随后利用载体骨架上的引物对pK-1/2从构建好的pK2-Ptef-GFP-Ttrpc-hpt载体上扩增GFP表达盒，并通过原生质体转化法导入到威尼斯镰刀菌中构建GFP随机表达文库。GFP表达盒载体构建电泳图和GFP随机表达文库构建示意图如图1所示。注：图1中：图A为GFP-Ttrpc片段与tef启动子片段的扩增电泳图；图B为pK2-Ptef-GFP-Ttrpc-hpt大肠杆菌转化子验证电泳图；图C为表达盒Ptef-GFP-Ttrpc-hpt扩增电泳图；图D为GFP随机表达文库构建示意图。
1.4结果
实验结果如图1所示，电泳结果显示已成功构建pK2-Ptef-GFP-Ttrpc-hpt表达载体，并以此为模板扩出表达盒Ptef-GFP-Ttrpc-hpt，通过原生质体转化完成GFP表达文库的构建。
实施例2、GFP中性插入及高表达菌株的获得
2.1培养基
GYA培养基：30g/L葡萄糖,8g/L酵母粉，15/L琼脂糖；
GYB培养基：30g/L葡萄糖,8g/L酵母粉；
发酵培养基：40g/L葡萄糖,0.5g/L酵母粉,6g/L硫酸铵,1.5g/L硫酸镁,0.7g/L氯化钾,0.5g/L硫酸钠,2g/L磷酸二氢钾,0.5g/L碳酸钙。
2.2实验方法
菌落荧光观察：菌体切块接种到GYA培养基上于28℃培养5天后，放置于黑暗环境中利用手持荧光激发器LUYOR-3415GR照射菌株，并通过滤片进行拍照。
菌丝形态观察：取500μL 5×106孢子/mL威尼斯镰刀菌孢悬液接种于50mL GYB液体培养基至于28℃摇床中180rpm培养16小时，随后取少了菌体制片放于显微镜下观察并拍照。
菌落直径观察：取2μL 5×106孢子/mL威尼斯镰刀菌孢悬液接种于GYA平板上，至于28℃培养箱中培养3天拍照并测量菌落直径。
生物量和碳源转化率测定：取300μL 5×106孢子/mL威尼斯镰刀菌孢悬液接种于50mL发酵培养基中，随后基至于28℃摇床中180rpm培养。待发酵3天后抽滤收集菌体，对其烘干至恒重后测定生物量；同时收集无细胞发酵液，对其用去离子水稀释到合适浓度后进行葡萄糖浓度的测定，最后计算碳源转化效率(生物量/(初始糖浓度-发酵后糖浓度))。
2.3结果
实验结果如图2所示，筛选的荧光菌株FS与野生型菌株在菌丝形态、菌落直径、生物量、碳源转化方面都无明显差异。注：图2中图A为菌株FS和野生型菌株的荧光代表性图片；图B为菌株FS和野生型菌株的菌丝显微观察代表性图片；图C为菌株FS和野生型菌株在GYA培养基上培养3天后的菌落直径图；图D为菌株FS和野生型菌株在发酵培养基中培养3天后的菌体生物量图；图E为菌株FS和野生型菌株在发酵培养基中培养3天后的葡萄糖碳源转化率。WT：野生型菌株；FS：按实施例1中筛选到的GFP中性插入及高表达荧光菌株。
实施例3、荧光菌株中GFP表达盒在基因组上插入位点的鉴定
3.1引物
3.2 Y型接头制备及靶标片段扩增程序
3.3实验方法
1)提取菌株的基因组DNA，随后用同尾酶BamHI和BglII对其进行酶切；
2)将长接头序列Adaptor-L和短接头序列Adaptor-S互补配对形成Y型接头；
3)利用T4连接酶将酶切产物与Y形接头进行连接；
4)以上述并连接产物作为模板，以Pcassette-2为引物进行线性扩增；
5)以线性扩增产物为模板，Padap-1/Pcassette-3为引物对进行扩增，获得包含GFP表达盒插入位点的靶标序列，并回收测序；
6)将靶标序列的测序结果与威尼斯镰刀菌TB01基因组及GFP表达盒进行比对，最终确定GFP表达盒在威尼斯镰刀菌基因组上的插入位置。
3.4结果
实验结果如图3所示，酶切处理后基因组DNA被完全切碎，随以酶切产物与Y形接头连接产物为模板依次经过线性扩增和指数扩增后获得包含插入位点的靶标片段，对其测序比对后发现GFP表达盒在基因组上的插入位点位于1号染色体FVRRES_00686基因上游4886bp处。
注：图3中图A为包含插入位点的靶标片段扩增示意图；图B为基因组DNA酶切电泳图；图C为包含插入位点的靶标片段扩增电泳图；图D和E为GFP表达盒在威尼斯镰刀菌TB01基因组上的插入位置；WT：野生型菌株；FS：按实施例1中筛选到的GFP中性插入及高表达荧光菌株。.-:未进行酶切处理；+:酶切处理。倒三角形为GFP表达盒在基因组上的插入位点；圆角矩形为以GFP表达盒在基因组上的插入位点为中心选取其上下游各600bp区域作为的候选序列。
实施例4、设计用于CRISPR/Cas9介导的同源定向重组插入位点的靶向sgRNA
4.1实验方法
以实施例3中鉴定的插入位点为中心，选取其上下游各600bp区域作为候选序列。随后利用sgRNACas9软件在上述候选序列上设计并筛选合适的sgRNA(识别插入位点)，用于CRISPR/Cas9介导的基因同源定向重组插入。
4.2结果
实验结果如图4所示，利用sgRNACas9工具在以GFP表达盒插入位点为中心上下各600bp为候选序列上设计了两个新的鉴定位点用于CRISPR/cas9介导的同源定向重组。注：图4中倒三角形为GFP表达盒在基因组上的插入位点；圆角矩形为红色插入位点为中心选取其上下游各600bp区域作为的候选序列；位点1和2表示由sgRNACas9工具设计的用于CRISPR/cas9介导的靶标基因同源定向重组的位点。
实施例5、CRISPR/Cas9介导靶标基因在鉴定插入位点的整合效率评估
5.1试剂
菌丝裂解液：取1.2gNaOH用去离子水溶解后定容至100mL；
菌丝中和液：10mL 1M Tris-HCl(pH8.0)，40mL 0.3M HCl，用去离子水定容至800mL。
5.2引物
| 5S-1 | TAGCTGTTTCCGCTGAGGGTTTAATTAAACATACGACCAAAGGTAGTGG |
| 5Ssite1-2 | CCAAGTATCTTTCATGTCGGAACATACAACAGCGGGGATTCG |
| 5Ssite2-2 | CTAGGCTCTTGAGCCTGAATAACATACAACAGCGGGGATTCG |
| Site1sg-1 | CCGACATGAAAGATACTTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
| Site2sg-1 | ATTCAGGCTCAAGAGCCTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
| Sg-2 | CTGCTGTCTCGGCTGAGGTCTTAATTAAAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC |
| tef-1 | CCACCCGTGGGGAGCTGTAT |
| gpdA-1 | TGTTGATCGTCAACCAAGTCCG |
| Ttrpc-2 | CCTCTAAACAAGTGTACCTG |
| S1L-1 | ACGCTTCGCTTCTCAGTATG |
| S1L-t-2 | ATACAGCTCCCCACGGGTGGCCTTACCAAGTGCCTGGATA |
| S1L-g-2 | GACTTGGTTGACGATCAACACCTTACCAAGTGCCTGGATA |
| S1R-gt-1 | GCACAGGTACACTTGTTTAGAGGCCAAGTATCTTTCATGTCGG |
| S1R-2 | CTGAAGAATCCATCTCCTCC |
| S2L-1 | GATATGATGAGAGGTTGGGC |
| S2L-t-2 | ATACAGCTCCCCACGGGTGGCTAGGCTCTTGAGCCTGAAT |
| S2L-g-2 | GACTTGGTTGACGATCAACACTAGGCTCTTGAGCCTGAAT |
| S2R-gt-1 | CAGGTACACTTGTTTAGAGGGGTTAGAACTTGGCTTGTAG |
| S2R-2 | ATGAACATCTCGCCTGGCTT |
5.3片段扩增及同源重组程序
5.4实验方法
1)以引物对5S-1/5Ssite1-2或5S-1/5Ssite2-2从威尼斯镰刀菌TB01的DNA基因组中扩出内源5SrRNA启动子序列(FVRRES_5S_rRNA_393)，以引物对Site1sg-1/Sg-2或Site2sg-1/Sg-2在人工合成的gRNA scaffold片段的基础上扩出sgRNAsite1/2序列。随后通过融合PCR进行两轮扩增，将5SrRNA片段与sgRNAsite1/2片段进行融合获得5SrRNA-sgRNAsite1/2，并通过同源重组酶将融合后的片段连接到骨架载体pFC322-Cas9上，获得针对鉴定位点Site1和Site2的Cas9和sgRNA表达载体，其中，针对鉴定位点1(Site1)的5SrRNA-sgRNA-Site1序列为ACATACGACCAAAGGTAGTGGAAAATACGGGATCCCGTCCGCTCTCCCATAGTCAAGCCACTAACCGGCGGATTAGTAGTTGGGTCGGTGACGACCAGCGAATCCCCGCTGTTGTATGTTCCGACATGAAAGATACTTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT；针对鉴定位点2(Site 2)的5SrRNA-sgRNA-Site2序列ACATACGACCAAAGGTAGTGGAAAATACGGGATCCCGTCCGCTCTCCCATAGTCAAGCCACTAACCGGCGGATTAGTAGTTGGGTCGGTGACGACCAGCGAATCCCCGCTGTTGTATGTTATTCAGGCTCAAGAGCCTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT。
2)以威尼斯镰刀菌TB01的DNA基因组为模板，通过相应引物分别扩增位于插入位点Site1和Site2两端的同源臂(500bp左右)；同时分别以之前构建好的pK2-Ptef-GFP-Ttrpc-hpt和pK2-PgpdA-GFP-Ttrpc-hpt为模板，tef-1/Ttrpc-2和gpdA-1/Ttrpc-2为引物扩增Ptef-GFP-Ttrpc-hpt和PgpdA-GFP-Ttrpc片段，随后通过融合PCR进行两轮扩增，分别将针对相应位点的左右臂序列与不同启动子(Ptef和PgpdA)驱动的GFP表达盒进行融合，获得用于CRISPR/Cas9介导的基因同源定向重组插入的供体DNA，其中，针对鉴定位点1(Site1)的左端同源臂序列为：ACGCTTCGCTTCTCAGTATGCAAGACCAAAAAGCAAAAAAACCAAGTTGTTGGTCGTTGGGCTTATTTGCTGTCGCGTATTACTGTAAGGATGGGATCCGATCATTTGCATTGAGTAGTTTGACCCATTGATGATGGTCTCGCGTAATAAGGTCAGTCCCAGTTGCCAGAGGATGTACTCACGACTACCTAGGATCAAGGGTCGAAGGAGAATAATATCCTAAGTCCTCTTTACAGGACTGCACCGAAAAAAAAATGGAGATCCTTTGAGGTTGCGTCATGGTCAAAATATAATTCAGACTTCTGTATCTCAGTTGTCTCGAGTTTGCGGCATACAGCACGGAAATTACCAAGACCGGATGGACTCAATGTCACAGCGTTAGACCAGGGGAGCAGGAAAACATGTGAATCTGAAACCGACGACTGATTCTGACGAGGTATTGTGCTGGCGTGGGGGCTATAATGTCTGTCCGAACATCGCAACTCATATCGAGTCATAATAGCGGTAGCTCTGATGTTCACCAATCAATCGACTTATCCAGGCACTTGGTAAGG；针对鉴定位点1(Site1)的右端同源臂序列为：CCAAGTATCTTTCATGTCGGATTCATATCGGAATCCGTGAGTAATACCCCTAGCGCGATGGTGAGATGGCCATTCGGCGTTGTTTGGGACCCTGTCTAGTAGATCCTGTCGGGTTACCAGATTGATGAGGCTCTCGAGATGGCCGCGATATACGTCCCAAGAACCACATACGAGGTTTGAGACGTTCCGAGTCGATGAGAATGCGGCATCGCCCACTTGGGATATGGAAAACCAAAATCGGTCAAAGTGTATGCACAAGGTGCAAGCTTGGTTACCTGGACAAGCAGCTTAGGGCGGCGCAGGCCAAGCAAGCTCAGCCCTTTTGGCGAATGAAGCAGCGAAGGCTTCTCGCCCTATTTAAATGATTGGATATGATGAGAGGTTGGGCCGTTTTGGATGGCGCTGGCTGTTGACCCAACTTGACCCTCCCGGAACATAAGCCGAAAGTCCTCGGCTGTGTCAAAATCGTTTGCACAGCGATATGTGACGATAAACGCCTCTGGAGGAGATGGATTCTTCAG，针对鉴定位点2(Site2)的左端同源臂序列为GATATGATGAGAGGTTGGGCCGTTTTGGATGGCGCTGGCTGTTGACCCAACTTGACCCTCCCGGAACATAAGCCGAAAGTCCTCGGCTGTGTCAAAATCGTTTGCACAGCGATATGTGACGATAAACGCCTCTGGAGGAGATGGATTCTTCAGAGTTCAATCCTGGGGCGTCAGTAGTAAGGATTGAACAAACCCGGACGATACGCATTGTAACATGTCTACGTCATGAGAAAGGCAGTGCTTGAGAGATGCATCAACGTCGATTCAATTCATGTTCGCACGCGTGGTATTTTCTTTTACGCGTGAAGGGTCCTTGAGTTCGGGGGGCATGGATCCAGATGCAGACTGAGCTTGCGATGTCTGGGCCATTCACCAGTCAATGCGATGACGCTAAAGCATCTGGGATCTGCCAAAGATCAAGTCAGCAGGGAAAGTGATAGCAAGGTGACTGACATTTTTTGGTCAACTAGGGAGAGGACGCGCACGCGTAACACACCGACAAAACAAAGTGCTCAAAAGAGAAACACCATGAGCGGCCCATTATGCGACCATGAAGCACAGTGGATCCATGATTCAGGCTCAAGAGCCTAG；针对鉴定位点2(Site2)的右端同源臂序列为GGTTAGAACTTGGCTTGTAGAGGGCGTGCATATGGGCACATGTGGGAGCGTGTAGGAGCTGCAGGTTAATAGTCGCAGTCGTCTCTCCAGCCACCCTGTGATGGAGCATCAGTGCATGATCAAGAGAACTATCTCTTGGCTGGTGAGTTTTTGGCGATGCCGCAGATGAATCGGACGATAGCAGATGCTCGAGACGTGATGTGGAATGCAGTATTGCAGGAAAAAAGATGGGATTTGTGGTGTTGTCGTCTGCAATGATCAACAGCCGGCATTTGTCGGAGATGTCTCTTGTCAAGTTGGATGATGCTCAAGGGTCCAATAACTTGATTACGAAATCAAAGACGTTGCCTGGGACTCTGCTCGATGGTATACCGTTCTACTCGATGGCACGCTTGCTTTAGAGCCTCGCGTAAAGAGTAGTTTGCAGCGCTCAGCTCGCTTAAGCTGATATCCGAGAAATCTCAGATCTATCGCCGAGTTTCCCAAACATCCATCCGCTCGTGCGTAGGATGCAAGACTAACTTGACTGGCTTCCCTGGCAATTTTCGACATGTGGACAGGACAACTGGCGCGGGGATGAAGCCAGGCGAGATGTTCAT。
3)通过原生质体转化法将上述表达载体和供体DNA导入到威尼斯镰刀菌TB01的鉴定位点，并通过手持荧光激发器LUYOR-3415GR筛选荧光转化子。
4)针对上述筛选的荧光转化子，利用菌丝裂解液和中和液对其制备简易模板(取少量菌丝体于8μl菌丝裂解液中，98℃处理2min，随后加入170μl菌丝中和液即为简易模板)，并通过引物对S1L-1/S1R-2或S2L-1/S2R-2进行PCR分析，评估供体DNA在相应位点的整合效率(如果供体DNA定点重组，则只能扩增出一条3kb或4kb的条带)。
5.5结果
实验结果如图5所示，各荧光转化子扩增后只有一条3kb或4kb的条带，表明各供体DNA在位点1和位点2上的整合效率均为100％。注：图5中图A为基于AMA1的Cas9和sgRNA表达载体及相应供体DNA的示意图；图B为CRISPR/Cas9介导供体DNA在靶向插入鉴定位点后获得的荧光菌株。图C为PCR扩增分析各供体DNA在鉴定插入位点的整合效率。
实施例6、CRISPR/Cas9介导靶标基因在鉴定位点表达后的遗传稳定性评估
6.1培养基
GYA培养基：30g/L葡萄糖,8g/L酵母粉，15g/L琼脂糖.
6.2实验方法
将5)中筛选的荧光转化子连续传代5次，用手持荧光激发器LUYOR-3415GR照射第一代和带五代的荧光菌株平板并通过滤片拍照。随后用imageJ软件对菌株的平均荧光强度进行定量分析。
6.3结果
实验结果如图6所示，第一代和带五代荧光菌株之间的平均荧光强度并无差异，表明CRISPR/Cas9介导GFP基因盒在在上述鉴定的2个位点表达后可以遗传稳定。注：图6中1：第一代荧光菌株；5：第一代和带五代的荧光菌株；Ptef：表达Ptef-GFP-Ttrpc的荧光转化子；PgpdA：表达PgpdA-GFP-Ttrpc的荧光转化子；Ptef：表达Ptef-GFP-Ttrpc的荧光转化子；PgpdA：表达PgpdA-GFP-Ttrpc的荧光转化子。
实施例7、CRISPR/Cas9介导靶标基因在鉴定位点表达后对菌株生长影响
7.1培养基
发酵培养基：40g/L葡萄糖,0.5g/L酵母粉,6g/L硫酸铵,1.5g/L硫酸镁,0.7g/L氯化钾,0.5g/L硫酸钠,2g/L磷酸二氢钾,0.5g/L碳酸钙
7.2实验方法
将实施例6中第五代的荧光菌株制备成5×106孢子/mL的孢悬液，随后取300μL接种于50mL发酵培养基中至于28℃摇床中180rpm培养。待发酵3天后抽滤收集菌体，对其烘干至恒重后测定生物量；同时收集无细胞发酵液，对其用去离子水稀释到合适浓度后进行葡萄糖浓度的测定，最后计算碳源转化效率(生物量/(初始糖浓度-发酵后糖浓度))。
7.3实验结果
实验结果如图7所示，五代荧光菌株与野生型菌株之间的生物量和碳源转化率并无差异，表明CRISPR/Cas9介导GFP基因盒在上述鉴定的2个位点表达后不会对菌株生长造成影响。注：图7中Ptef：表达Ptef-GFP-Ttrpc的荧光转化子；S1:位点1；S2：位点2；PgpdA：表达PgpdA-GFP-Ttrpc的荧光转化子。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (7)
1.威尼斯镰刀菌TB01的整合位点，其特征在于，包括两个配套CRISPR/Cas9系统使用的整合位点，其分别位于：威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游5438bp处和威尼斯镰刀菌TB01的1号染色体FVRRES_00686基因上游4499bp处。
2.根据权利要求1所述的威尼斯镰刀菌TB01的整合位点，其特征在于，GFP表达盒在所述威尼斯镰刀菌TB01上的插入位点为1号染色体FVRRES_00686基因上游4886bp处。
3.包含权利要求2所述的威尼斯镰刀菌TB01的整合位点的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.向权利要求1所述的威尼斯镰刀菌TB01的整合位点定点插入不同启动子驱动下的GFP表达盒，其特征在于，含有用于GFP表达盒在威尼斯镰刀菌TB01定点插入所需的CRISPR/Cas9表达载体和供体DNA。
5.向权利要求4所述的威尼斯镰刀菌TB01的整合位点插入基因的方法，其特征在于，针对向威尼斯镰刀菌TB01整合位点定向插入靶基因，构建包含CRISPR/Cas9序列和sgRNA序列的表达载体及相应的供体DNA片段，将权利要求4中所述的载体和供体片段转化所述的威尼斯镰刀菌TB01。
6.威尼斯镰刀菌TB01的整合位点的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、通过原生质体转化法将GFP表达盒导入到威尼斯镰刀菌TB01中，获得GFP表达文库；
S2、从所述GFP表达文库中筛选出中性插入且能够高表达的荧光菌株；
S3、鉴定GFP表达盒在所述荧光菌株中的插入位点，其插入位点具体为1号染色体FVRRES_00686基因上游4886bp处；
S4、以步骤S3确定的插入位点为中心，选取其上下游各600bp区域作为候选序列，采用CRISPR/Cas9介导的基因同源定向重组插入；
S5、通过CRISPR/Cas9介导靶标基因对步骤S4中选取的候选序列进行整合效率、遗传稳定性、菌株生长评估后，确认威尼斯镰刀菌TB01的整合位点包括权利要求1所述的两个整合位点。
7.威尼斯镰刀菌TB01的整合位点在威尼斯镰刀菌TB01基因工程中的应用。
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