CN114990078B

CN114990078B - 带有His标签的重组新城疫病毒的构建方法及用途

Info

Publication number: CN114990078B
Application number: CN202210754217.6A
Authority: CN
Inventors: 胡顺林; 刘秀梵; 王文莉; 陈玉; 王晓泉; 刘晓文
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-06-29
Filing date: 2022-06-29
Publication date: 2024-03-26
Anticipated expiration: 2042-06-29
Also published as: CN114990078A

Abstract

本发明公开了带有His标签的重组新城疫病毒的构建方法及用途。基于已建立的基因VIId亚型新城疫病毒I4强毒株反向遗传操作系统，将His标签(6×His)与I4基因组全长转录载体pNDVI4中的HN基因融合，成功构建带有His标签的重组新城疫病毒基因组全长cDNA感染性克隆pNDVI4‑HN‑His。经转染得到重组新城疫病毒rNDVI4‑HN‑His，可通过标签蛋白抗体用于重组病毒HN蛋白的纯化及其与宿主蛋白互作研究。

Description

带有His标签的重组新城疫病毒的构建方法及用途

技术领域

本发明涉反向遗传学技术及用途，特别涉及标签蛋白与HN蛋白融合构建重组新城疫病毒。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)可感染家禽和野禽，引起一种急性、高度传染性呼吸道和神经系统疾病，给全球养禽业的健康发展造成严重威胁。NDV基因组包括6个编码基因，按3’-NP-P-M-F-HN-L-5’顺序排列，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大蛋白(L)。这些病毒蛋白通过与宿主蛋白相互作用以调控细胞相关生理过程和病毒生命周期，可能诱导细胞出现凋亡、坏死以及代谢失衡等现象。因此，了解NDV感染期间与宿主蛋白的相互作用有助于进一步了解病毒感染和致病机理，对建立新的治疗方法和免疫策略具有重要意义[石金凤，丁媛，陈子杨，等.病毒与宿主蛋白互作研究技术进展[J].动物医学进展，2021，42(12)：97-101.]。

蛋白互作研究的方法包括酵母双杂交、谷胱甘肽转移酶沉淀试验、表面等离子体共振和免疫共沉淀等。目前，有关与NDV蛋白相互作用的蛋白质的研究多采用酵母双杂交系统筛选的方法。有研究报道，利用该方法所得结果的假阳性、假阴性率偏高[Yu Q，Hu Y，SuJ，et al.Evaluation of a Yeast Two-Hybrid Library by High-ThroughputSequencing[J].Journal of proteome research，2020，19(8)：3567-3572.]。同时，针对病毒蛋白的单克隆抗体的制备费时费力，严重制约了NDV与宿主蛋白互作研究。因此在蛋白上引入标签，利用标签蛋白抗体进行研究，有效克服了这一缺点，而且可以利用标签蛋白实现与其融合蛋白的分离纯化。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供基于NDV反向遗传操作系统将6×His标签与HN基因编码蛋白的C端融合表达构建重组新城疫病毒的方法。

本发明的另一目的在于提供上述表达His标签的重组新城疫病毒的应用。

技术方案：以新城疫病毒I4强毒株基因组全长克隆载体pNDVI4为骨架，将6×His标签克隆至HN基因终止密码子之前，构建得到携带His标签的全长cDNA感染性克隆pNDVI4-HN-His；并基于T7 RNA聚合酶NDV拯救系统成功获得重组新城疫病毒rNDVI4-HN-His。然后同时使用标签蛋白抗体和HN蛋白抗体研究与HN蛋白互作的宿主蛋白。

进一步地，所述的重组新城疫病毒的构建所用的载体为pNDVI4。

进一步地，所述的重组新城疫病毒质粒命名为pNDVI4-HN-His。

进一步地，所述的重组新城疫病毒命名为rNDVI4-HN-His。

上述带有His标签蛋白的重组新城疫病毒的构建方法，包括以下步骤：

(1)根据全长质粒pNDVI4和载体质粒pCR2.1-TOPO基因序列设计引物，通过PCR技术扩增目的基因。各目的基因片段在同源重组酶的作用下连接得到中间质粒pCR2.1-HN-His；

(2)将全长质粒pNDVI4和中间质粒pCR2.1-HN-His同时使用限制性内切酶Sac II和FspA I进行双酶切反应，回收目的片段并在T4连接酶的作用下得到全长质粒pNDVI4-HN-His；

(3)将重组全长质粒pNDVI4-HN-His与三个真核表达辅助质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)共转染BSR-T7/5细胞，拯救获得重组新城疫病毒rNDVI4-HN-His；

(4)将成功拯救的重组新城疫病毒进行鉴定；

(5)通过免疫共沉淀、质谱鉴定进行HN蛋白与CEF细胞蛋白的互作研究。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有如下优势：

1、本发明基于NDV反向遗传操作系统，以新城疫病毒I4强毒株的基因组为骨架，将His标签与HN蛋白融合构建重组新城疫病毒。使用Western Blot鉴定了融合蛋白HN-His的有效表达；并利用His标签蛋白抗体和HN蛋白抗体分别进行免疫共沉淀试验，结合质谱检测技术分析并比较所获宿主蛋白，结果显示两种不同抗体所捕获宿主互作蛋白高度一致。基于His标签抗体研究NDV感染状态下病毒蛋白与宿主蛋白互作的可行性得到了验证。

2、将His标签置于I4强毒株HN蛋白之后，获得标签化的重组新城疫病毒，可用于研究蛋白间相互作用关系、建立新的病原检测方法等。

3、该方法可方便HN蛋白的纯化及用于研究NDV粒子在生理状态下其HN蛋白与宿主细胞蛋白间互作关系。

附图说明

图1重组病毒rNDVI4-HN-His的构建示意图；

图2是利用RT-PCR技术鉴定重组病毒rNDVI4-HN-His的结果图；

图3是融合蛋白纯化后利用WesternBlot试验鉴定的结果图；

图4是与NDVHN蛋白互作的蛋白韦恩图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

若无特别说明，本发明所述的实验方法，均为常规方法；所述的生物材料，均可从商业途径获得。

实施例1：重组新城疫病毒质粒的构建与鉴定

实验中使用的全长质粒pNDVI4和辅助质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)均由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室保存并提供。

根据新城疫病毒I4强毒株HN和L基因的核酸序列设计引物，用于扩增目的基因。同时设计一对引物用于扩增pCR2.1载体片段。对于构建中所用的引物，引物设计使用SnapGene2.3.2软件，交由北京擎科科技生物有限公司(南京)合成。引物信息如表1所示。

表1引物合成信息

注：加粗部分为同源重组所需的重叠序列，加下划线部分为6x His序列。

以pNDVI4质粒为模板，用NEW-F/HISH-R和HISH-F/HNF-R两对引物扩增I4基因组的6418-8130nt区域及8131-9530nt区域，分别命名为HH和HL。按照载体质粒pCR2.1-TOPO说明书，以载体质粒pCR2.1-TOPO为模板，用p2.1-F/p2.1-R一对引物扩增载体片段pCR2.1。按照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收以上3个目的片段。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

将加入PCR产物的1％琼脂糖凝胶块置于电泳仪中，以120v/min的速度电泳30-40min，切取含有目的条带的胶块，按照DNA凝胶抽提试剂盒说明书回收PCR产物，然后测量并记录其浓度(单位：ng/μL)。

将线性化载体和目的DNA片段按一定的摩尔比(1∶2-1∶3)加入到PCR管中。50℃金属浴作用30min。重组反应结束后将PCR管置于碎冰上作用2min，将连接产物转化至感受态细胞。

同源重组反应体系如下：

常规方法小量提取质粒，酶切、电泳初步鉴定后测序，将序列保真的阳性质粒命名为pCR2.1-HN-His。

将全长质粒pNDVI4和中间质粒pCR2.1-HN-His同时使用限制性内切酶Sac II和FspA I进行双酶切反应，前者经酶切后可获得大小为15279bp和2984bp两个DNA片段，后者酶切可获得大小为4058bp和3002bp两个DNA片段，分别回收纯化长15279bp和3002bp两个目的DNA片段，并按照快速连接试剂盒DNA Ligation Kit(Mighty Mix)说明书将其连接起来。连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞。同样经过挑斑、摇菌、提取质粒一系列操作，最后使用限制性内切酶Hind III对所提质粒进行酶切鉴定，酶切结果符合实验要求的质粒送至北京擎科科技生物有限公司(南京)进行测序，测序正确的质粒命名为pNDVI4-HN-His。

双酶切反应体系如下：

连接反应体系如下：

单酶切反应体系如下：

实施例2：重组新城疫病毒的拯救

将重组全长质粒pNDVI4-HN-His与三个真核表达辅助质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)共转染BSR-T7/5细胞，简要步骤如下：

1)将提供T7 RNA聚合酶的痘病毒与DMEM细胞培养基(不含抗生素和血清)按1∶400的比例混匀，置于4℃冰箱暂存。

2)取出细胞培养皿，用无菌PBS清洗2-3遍后，加入步骤1)中所配制的痘病毒液，于37℃细胞培养箱中孵育1h。

3)制备转染体系。将重组全长质粒pNDVI4-HN-His与三个真核表达辅助质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)按1∶1∶0.5∶0.5的比例加入到200μL DMEM细胞培养基(不含抗生素和血清)中，轻轻涡旋混匀后，再向内加入9μL Roche脂质体转染试剂，缓慢吹打混匀，室温静置15min。

4)弃去培养皿中的液体，用无菌PBS清洗2-3遍后加入2mL 1％DMEM，再将转染体系加入培养皿中，轻轻摇匀，于37℃细胞培养箱中培养72h。

5)用封口膜固定培养皿后，置于-70℃和37℃环境中反复冻融3次，将底壁细胞与培养液混匀后接种9日龄SPF鸡胚(0.4-0.5mL/胚)，置于鸡胚孵化箱培养。每隔12h照胚一次，弃去24h内死亡的鸡胚。将死胚置于4℃冰箱5h后，按OIE标准测定鸡胚尿囊液的HA效价，并收集阳性尿囊液于-70℃冰箱保存。

实施例3：重组新城疫病毒的鉴定

原代鸡胚尿囊液在9日龄SPF鸡胚上连续传3代后，收集HA阳性尿囊液并提取病毒的总RNA。重组病毒的RNA提取方法参照RNA快速提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit说明书进行。简要步骤如下：

1)实验准备：将β-巯基乙醇与裂解液RLT按1∶100的比例混匀后置于4℃冰箱暂存。向漂洗液RW瓶和70％乙醇瓶中分别添加40mL和24mL无菌无水乙醇溶液。

2)用镊子夹取2个无RNA酶的1.5mL EP管，分别加入300μL含重组病毒rNDVI4-HN-His的尿囊液，然后再加入等体积的裂解液RLT，做好标记，震荡混匀。

3)再向EP管内加入600μL 70％乙醇溶液，立即吹打混匀，然后将管内混合液转移至吸附柱RA，12000rpm离心1min，弃去废液。每次过柱子的液体体积需小于700μL，故该操作需重复一次。

4)向吸附柱中加入700μL去蛋白液RW1，室温静置30s后，12000rpm离心1min，弃去废液。

5)取500μL漂洗液RW于吸附柱中，12000rpm离心1min，弃去废液。需漂洗2遍。

6)12000rpm离心2min，打开管盖，去除乙醇残留。与此同时，将RNase-free H₂O瓶子放入70℃水浴锅预热。

7)将吸附柱转移至一个新的无RNA酶的1.5mL EP管中，取34μL RNase-free H₂O用于洗脱。

8)取2μL 6碱基随机引物与洗脱下的液体混匀，于70℃水浴锅作用10min，再放入碎冰上冷却5min，再加入反转录组分。

反转录总体系如下：

分别以重组病毒rNDVI4-HN-His的反转录产物为模板，用引物NEW-F/HNF-R扩增出相应DNA片段(图2)。

PCR反应体系如下：

PCR反应体系和扩增程序如实施例1所述。PCR产物经电泳后，切取含目的条带的胶块并送至北京擎科科技生物有限公司(南京)进行测序验证。

实施例4：融合蛋白HN-His的纯化与鉴定

融合蛋白HN-His的纯化流程参照His标签蛋白纯化试剂盒说明书进行。具体操作流程如下：

1)前期准备：将两株重组病毒以0.1MOI接种CEF细胞，培养至48h取出。加入适量的RIPA进行细胞裂解并收集胞浆蛋白，10000rpm离心3min，暂放碎冰中保存。

2)按1∶8的比例混合BeyoGold^TM His-tag purification Resin(耐变性剂型)和胞浆蛋白液。4℃在水平摇床上缓慢摇动2h。

3)将上述混合物装入5mL EP管中，1000rpm离心30s，弃掉剩余上清。

4)加入1mL非变性洗涤液进行重悬，1000rpm离心30s，弃掉剩余上清。重复该步骤2-3次。

5)洗脱目的蛋白3-5次，每次加入400μL非变性洗脱液重悬凝珠，1000rpm离心30s，收集上清。上清液即为纯化得到的融合蛋白。

6)通过SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色法鉴定融合蛋白纯化效果。

经洗脱后，融合蛋白HN-His均能够被检测出，且无杂条带(图3)，表明纯化效果良好。

实施例5：HN与宿主细胞互作蛋白的鉴定

使用免疫共沉淀、质谱鉴定进行HN蛋白与CEF细胞蛋白的互作研究，简要步骤如下：

1)接种病毒：将CEF细胞以2×10⁷个/dish接种于细胞培养皿，待细胞贴壁后，用无菌PBS清洗3遍，再将病毒rNDVI4-HN-His以1MOI接毒剂量接种CEF，吸附1h后，弃掉细胞上清，再用无菌PBS清洗3遍，补加15ml细胞维持液，置于37℃、6％CO2细胞培养箱培养12h。

2)收集胞浆蛋白：向每个dish中加入2ml RIPA裂解液裂解细胞，8000rpm离心5min，将上清平均分成5份备用。

3)孵育抗体：按照单克隆抗体说明书所述，向其中一管细胞蛋白液中加入适量Anti-Mouse IgG作为空白对照，另取两管加入适量Anti-HN抗体作为阳性对照，剩余两管加入适量Anti-His抗体，均4℃孵育过夜，8000rpm离心5min，将上清取出备用。

4)IP：根据protei A+G Agarose说明书加入适量的Agarose，4℃作用1.5h。2500rpm离心2min，弃掉上清，用适量温和型RIPA裂解液进行重悬，再经2500rpm离心2min，弃掉上清，重复清洗5遍。

5)蛋白变性：加入适量SDT buffer，100℃作用10min，2500rpm离心2min，收集上清，并置于-70℃冰箱保存。

将变性后的蛋白送至中科新生命生物科技有限公司进行质谱分析，通过Venny2.1软件对质谱分析所得的蛋白取交集处理。发现Anti-His组和Anti-HN组中共有蛋白比率高达90.2％(图4)，两种不同抗体所捕获宿主互作蛋白高度一致，提示标签蛋白抗体可有效代替病毒蛋白抗体用于蛋白互作研究。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 带有His标签的重组新城疫病毒的构建方法及用途

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtgtgctgg aattcggctt atggaccgcg cggttaacag 40

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcttcttaat ggtgatggtg atgatgaact ctatcatcct tgaggatctc 50

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcatcatcac catcaccatt aagaagctag acgtggccga ttga 44

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atatctgcag aattcggctt ttggtgcgca catctggctc c 41

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagccgaatt ctgcagatat ccatcacact ggcggccgct 40

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagccgaatt ccagcacact ggcggccgtt 30

Claims

1.带有His标签的重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于：以新城疫病毒基因组全长克隆为骨架，将His标签置于HN基因之后，获得带有His标签的重组新城疫病毒基因组全长cDNA感染性克隆，将该感染性克隆与辅助质粒共转染细胞后获得相应表型的重组新城疫病毒，具体包括以下具体步骤：

1）全长克隆pNDVI4-HN-His的构建

以基因Ⅶd亚型新城疫病毒I4强毒株基因组全长转录载体pNDVI4为研究对象，以pNDVI4为模板，用NEW-F/HISH-R和HISH-F/ HNF-R两对引物分别扩增I4基因组的6418-8130nt区域及8131-9530 nt区域，扩增出的两个片段经同源重组克隆入pCR2.1载体后得到HN和His相融合的中间质粒pCR2.1-HN-His；使用限制性内切酶SacⅡ和FspA Ⅰ对该中间质粒进行酶切反应，回收目的片段与经同样酶切后的pNDVI4目的片段相连，构建得到全长克隆pNDVI4-HN-His；

2)重组病毒株rNDVI4-HN-His的拯救

将全长质粒pNDVI4-HN-His与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞，后将上清与底壁细胞混匀后接种9-10日龄SPF鸡胚，置于鸡胚孵化箱培养，按OIE标准测定接种死亡鸡胚的尿囊液的HA效价，并收集阳性尿囊液，获得重组新城疫病毒rNDVI4-HN-His；

其中，用于扩增目的基因的引物如下：

。

2.权利要求1所述的构建方法获得的带有His标签的重组新城疫病毒在HN蛋白的纯化及其与宿主蛋白互作研究中的应用。

3.权利要求1所述的构建方法在其他标签与新城疫病毒HN蛋白融合构建重组病毒的构建中的应用。