CN114196683A - 鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法、重组病毒rDTMUV-QY21的制备方法 - Google Patents
鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法、重组病毒rDTMUV-QY21的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于兽用制品领域，公开了一种鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法，包括如下步骤：步骤1：构建亚基因组质粒，所述亚基因组质粒为质粒pF1、pF2、pF3、pF4，质粒pF1、pF2、pF3、pF4分别含目标片段F1、F2、F3、F4；步骤2：获取目标片段：从质粒pF1、pF2、pF3、pF4上获取用于体外连接的目标片段f1、f2、f3、f4；步骤3：体外连接目标片段f1、f2、f3、f4，获得鸭坦布苏病毒感染性cDNA。该方法可以成功的克隆出与原病毒株完全相同、无突变的重组病毒。
Description
技术领域
本发明涉及兽用制品领域，具体为一种鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法、重组 病毒rDTMUV-QY21的制备方法。
背景技术
2010年4月，中国各地的许多养鸭场爆发了一种新的疾病。该病特征症状包括食欲下 降、产蛋下降、卵巢的充血、出血、变性、退化以及淋巴细胞浸润，严重病例可致死亡。 经病毒的分离与鉴定，确定引起该病的病原为一种新的黄病毒，命名为鸭坦布苏病毒(DuckTembusu Virus，DTMUV)。近能年来，以生长迟缓和产蛋量下降为特征的鸭坦布苏病毒病 已在中国的养鸭区域出现大面积传播，并对中国的水禽养殖业造成了巨大的经济损失。然而，目前市面上针对该病毒的疫苗仍以传统灭活疫苗为主。该疫苗的保护效价并不十分理想以至于需要重复接种，因此给养鸭行业造成较重的经济负担。
通过建立DTMUV重组平台将为进一步快速创制应对各种流行毒株的新型疫苗打下坚 实基础，并为深入研究该病毒与宿主的相互作用，免疫和致病机制提供切实有用的工具。
DTMUV属于黄病毒属，黄病毒科。其基因组只有一个长的独立开放阅读框，编码3个结构蛋白：核衣壳(C)、膜(M)和包膜(E)；以及7个非结构蛋白：NS1、NS2A、 NS2B、NS3、NS4A、NS4BNS5。
本申请所要解决的技术问题是：如何快速建立鸭坦布苏病毒QY21株感染性cDNA，为进一步开发针对鸭坦布苏病毒的新型疫苗提供平台。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法以及重组病毒rDTMUV-QY21的制备方法，该方法可以成功的克隆出与原病毒株完全相同、无突变的重 组病毒。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备 方法，包括如下步骤：
步骤1：构建亚基因组质粒，所述亚基因组质粒为质粒pF1、pF2、pF3、pF4，质粒pF1、pF2、pF3、pF4分别含目标片段F1、F2、F3、F4；
步骤2：获取目标片段：从质粒pF1、pF2、pF3、pF4上获取用于体外连接的目标片段f1、f2、f3、f4；
步骤3：体外连接目标片段f1、f2、f3、f4，获得鸭坦布苏病毒感染性cDNA；
目标片段F1/f1的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为1-3490；
目标片段F2/f2的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为3471-6599；
目标片段F3/f3的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为6580-10599；
目标片段F4的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为8162-10990；
目标片段f4的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为10580-10990。
在上述的鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法中，所述步骤1具体为：
步骤11：利用引物Vector-F、Vector-R以pBR322-Base为模板，通过PCR扩增pBR322载体，然后经胶回收备用，得到的pBR322-Base-T7pro；
步骤12：分别用带同源臂的引物、以DTMUV-QY21全基因组为模板通过RT-PCR技 术扩增带同源臂的cDNA片段，得到目标片段F1、F2、F3、F4；
步骤13：将目标片段F1、F2、F3、F4分别和pBR322-Base-T7pro进行同源重组，得 到质粒pF1、pF2、pF3、pF4；
步骤12中，扩增目标片段F1所用引物为F1-F、F1-R；
扩增目标片段F2所用引物为F2-F、F2-R；
扩增目标片段F3所用引物为F3-F、F3-R；
扩增目标片段F4所用引物为F4-F、F4-R；
Vector-F、Vector-R、F2-F、F2-R、F3-F、F3-R、F4-F、F4-R的序列如序列表SEQ IDNO：2～SEQ ID NO：9所示；
鸭坦布苏病毒的全长序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
同时，本发明还公开了一种鸭坦布苏重组病毒rDTMUV-QY21的制备方法，采用如上所述的鸭坦布苏病毒感染性cDNA进行体外转录，获得鸭坦布苏重组病毒 rDTMUV-QY21。。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的方法可以成功的克隆出与原病毒株完全相同、无突变的重组病毒。
DTMUV-Q21全基因组共10990nt，如将全长cDNA一次性通过RT-PCR获得，一是 困难，一般市场可买到的DNA聚合酶很难合成大过10k的DNA片段，二是容易在PCR 过程中引入随机突变。因此将DTMUV-Q21全基因组分成4个片段，将其分别克隆到 pBR322载体。片段的大小是基于它所持有的BsmBI酶切位点来确定的，以利于随后的体 外cDNA片段连接。
附图说明
图1为20株坦布苏全基因核苷酸序列遗传进化树图。
图2为本发明的DTMUV-QY21全基因组的跑胶图谱；
图3为本发明的质粒pF1的质粒构造图；
图4为本发明的质粒pF2的质粒构造图；
图5为本发明的质粒pF3的质粒构造图；
图6为本发明的质粒pF4的质粒构造图；
图7为为本发明的单菌落筛选结果图；
图8为pF1、pF2、pF3、pF4质粒酶切跑胶图谱；
图9为F1、F2、F3、F4组成重组毒rDTMUV-QY21基因组全长cDNA模式图；
图10为体外连接rDTMUV-QY21基因组全长cDNA的体外转录电泳图；
图11为未感染病毒的DF1细胞与DTMUV-QY21感染组和rDTMUV-QY21感染组病 变示意图；
图12为重组毒rDTMUV-QY21的F0、F1代DF1细胞上清液中提取RNA并用其进行 RT-PCR产物跑胶图谱；
图13为质粒pBR322质粒构造；
图14为鸭坦布苏病毒荧光定量标准曲线示意图；
图15为DTMUV-QY21和重组毒rDTMUV-QY21的生长曲线示意图；
图16为荧光定量检测攻毒rDTMUV-QY21雏鸭肝脏的病毒含量示意图；
图17为荧光定量检测攻毒rDTMUV-QY21雏鸭脾脏的病毒含量示意图；
图18为荧光定量检测攻毒rDTMUV-QY21雏鸭肾脏的病毒含量示意图；
图19为荧光定量检测攻毒rDTMUV-QY21雏鸭脑组织的病毒含量示意图；
图20为荧光定量检测攻毒rDTMUV-QY21雏鸭胰腺的病毒含量示意图；
图21为DTMUV的独立开放阅读框模式图；
图22和23为对比例的质粒测序图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地 描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本 发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实 施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一、实验材料
主要仪器设备
5424R型离心机；Eppendorf PCR仪；Thermo1300 SERIES A2生物安全柜，均购自Eppendorf。电热恒温培养箱HZ-100(一恒科学仪器有限公司，中国上海)；三孔电热恒 温水槽DK-8D(一恒科学仪器有限公司,中国上海)；海尔BCD-579WE冰箱(海尔，中国上 海)；CO2恒温培养箱Forma371(Thermo公司，美国)；超净工作台SW-CJ-2FD(苏州 安泰空气技术有限公司，中国江苏)；生物安全柜1300SERIESA2(Thermo公司，美国)； 倒置光学显微镜(Nikon公司，日本)；高速离心机Centrifuge5804R(Eppendorf公司，德 国)；移液器Researchplus(Eppendorf公司，德国)；PCR仪C1000Touch(Bio-Rad公司， 美国)；电泳仪PowerPacBasic(Bio-Rad公司，美国)；垂直电泳槽MiniProteanTetra(Bio-Rad 公司，美国)；凝胶成像系统2500(R)(Tanon公司，中国上海)；超纯水仪Milli-Q(Millipore 公司，美国)；超低温冰箱Forma994(Thermo公司，美国)；核酸蛋白分析仪NanoDrop2000 (Thermo公司，美国)；生化培养箱LRH-250(一恒科学仪器有限公司，中国上海)； 分析天平BSA224S(Sartorius公司，德国)；涡旋振荡器(Thermo公司，美国)； AzureBiosystemsC600多功能分子成像系统(AzureBiosystems公司，美国)；电穿孔系统 (Bio-rad公司)。
主要试剂和材料
TIAN prep Mini Plasmid Kit(DP103-03)购自天根生化科技(北京)有限公司；Gel Extraction Kit(D2500-02)购自OMEGA；M-MLVRT(2641A)购自TAKARA；PRI(2313A) 购自TAKARA；RT Master Mix(RR036A)购自TAKARA；Agarose(E0301)购自 TSINGK；0.25％Trypsin-EDTA(25200-056)，DMEM basic(C11995500BT)购自Gibco； DMEM-Ham’s F12(CM10090)购自中科迈晨(北京)科技有限公司；FBS(10099-141C)购 自Gibco；Premix-Taq(RR902A)购自TAKARA；Pen Strep penicillin Streptomycin (15140-122)购自Gibco；Prime STAR GXL(R050)购自TAKARA；BsmBI(R0739L)， 高浓度T4 DNA Ligase(M0202M)购自NEB；T4连接酶及其他常用限制性内切酶均购 自TAKARA；ClonExpress Multis One StepCloning Kit(C113)购自南京诺维赞生物制品 有限公司；Trizol 15596-026购自Invitrogen；氯仿，异丙醇，无水乙醇等生化试剂购自宁波 萃英化学技术有限公司；10xSDS-PAGE电泳液购自碧云天；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 购自碧云天；TBS缓冲液购自博士德生物公司。pBR322-Base为华农(肇庆)生物技术研 究院提供。DH5α、SOC培养基购自TAKARA；LB平板固体培养基购自海博生物(产品 编号HB0128)mMESSAGEm
T7Kit体外转录试剂盒购自美国Thermo公司 (AM1344)。
二、病毒分离，纯化，测序和分析归类
(a)为了构建一株鸭坦布苏病毒的感染性克隆cDNA反向遗传平台，于2019年 12月从广东清远某规模化蛋鸭养殖场采集DTMUV病料，病料中添加适量生理盐水 后碾磨充分，加入1mL无菌PBS(含氨苄青霉素)，研磨充分直到组织成匀浆样， 置于-80℃反复冻融3次后；4℃条件下，12000r/min离心10min，然后取上清直接 接种到鸭胚尿囊腔中，添加量为200μl/枚；
后进一步在鸭胚的尿囊腔接种繁殖，待鸭胚死后收集尿囊液。
(b)将此尿囊液所含病毒在DF1细胞上进行噬斑纯化，纯化后的病毒命名为DTMUV-QY21。具体操作如下：
使用双蒸水配置2％琼脂糖溶液，高压后置4℃备用。使用前用微波炉加热2～3 分钟融化。将上述2％琼脂糖溶液与2X DMEM按1:1混合。
配置双倍维持液2X DMEM+1％SP抗生素培养液备用。
将从尿囊液回收到的DTMUV病毒用DMEM培养液按1：10稀释成6个梯度， 制得感染液10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6备用。
将DF1细胞置6孔培养皿中培养，待细胞长至90％满后分别加入上述稀释好的感染液各2ml，轻轻摇匀后置37℃孵育2h。弃去孵育液，再用PBS洗2遍。每孔加入 2％琼脂糖溶液与2X DMEM按1:1混合液2ml，使冷却覆盖成凝固层。倒置于37℃培 养箱培养48h。
制备含0.002％中性红的2％琼脂糖:2X DMEM(1:1)，置于40-50℃水浴待用。 吸取上述混合液加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成第二覆盖层。倒置于37℃ 培养箱，48h内观察结果。
挑选1个大小适中噬斑分别感染DF1细胞，待细胞病变明显时提取细胞总RNA。
以这个总RNA为模板，用非特异性引物(Random 6primer(3801))作逆转录， 获得第一条cDNA。
再分别以此cDNA为模板用特异性引物和ExTaq酶作PCR(其中特异性引物如下 附表1中的各质粒对应的引物，PCR的反应条件见表2、表3和表4)；
分别将这些PCR产物纯化后克隆进pMD19载体，再用pMD19载体两端的引物 (M13-F，M13-R)分别测序。总共11个质粒覆盖DTMUV全基因组，详细见附表1。
表1用于检测DTMUV-Q21序列的质粒表
表2 PCR反应条件
表3 PCR的反应条件中的扩增引物表
表4 PCR的反应条件中不同酶的应用配方表
备注：
1.R050PCR反应程序
2.RR902 PCR反应程序
3.本发明中所涉及到的PCR反应体系的配制及反应程序的设定均按照上述方法进行。
在PCR过程中只有退火温度和延伸时间会根据具体引物和片段不同进行调整(如上表中所述)，其他均不发生变化。下面将不再详述PCR反应的过程。
通过NCBI Blast软件将测序结果与已发表的DTMUV序列比对，其结果显示如图 1。结论是此DTMUV-QY21株病毒全基因组全长10990nt，病毒在进化过程中的变异 较少，病毒较为稳定。
为了保证序列准确无误，上述实验从病毒感染到测序结果分析反复重做了3次。其测 序结果均相同，证实由这个噬斑获得的是一株纯化的DTMUV-QY21病毒株。
DTMUV-QY21序列见序列表SEQ ID NO：1。
三、构建重组病毒rDTMUV-QY21
3.1建立为获得重组病毒所需的质粒
3.1.1建立4个亚基因组过渡质粒
DTMUV-QY21全基因组共10990nt，如将全长cDNA一次性通过RT-PCR获得， 一是困难，(一般市场可买到的DNA聚合酶很难合成大过10k的DNA片段)，二是 容易在PCR过程中引入随机突变。因此将DTMUV-QY21全基因组分成4个片段， 将其分别克隆到pBR322载体。片段的大小是基于它所持有的BsmBI酶切位点来确定 的，以利于随后的体外DNA片段连接。
具体构建方法如下：
A.制备质粒片段：利用PCR扩增pBR322-Base载体(又称pBR322载体)，然 后经胶回收备用，PCR后得到的pBR322质粒片段pBR322-Base-T7pro，该质粒片段 环化结构如图13所示，其大小为4427bp。
B.制备目的基因片段：分别用带同源臂的引物和相应的模板(见下表5)在高保真DNA聚合酶的作用下扩增带同源臂的DNA片段即目标片段F1、F2、F3、F4，经跑 DNA胶验证后回收备用。
C.将目的基因片段和pBR322质粒片段用重组酶连接。经细菌转化，单菌落PCR 初选，扩增质粒DNA，酶切质粒DNA后跑DNA胶复选，最后测序验证。
用于构建pF1(T7-1-3490)质粒的目的片段为F1。
用于构建pF2(3471-6599)质粒的目的片段为F2。
用于构建pF3(6580-10599)质粒的目的片段为F3。
用于构建pF4(8162-10990)质粒的目的片段为F4。
表5目的片段所涉及的模板和引物表
表6各质粒的构建配方表
在冰上制备好上述体系后在37℃反应30分钟，得到重组产物，将重组产物转化进DH5α感受态细胞。
(a)在冰上解冻DH5α感受态细胞，取10μl重组产物加入到50μl DH5α感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。
(b)42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。
(c)加入1ml SOC培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。
(d)将AMP+的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。
(e)取100μl的细菌液用无菌涂板棒轻轻涂在含有AMP+抗性的平板固体培养基上。
(f)37℃培养箱中倒置培养12-16h。
D.菌落PCR进行筛选
用引物检测-F和检测F1-R/F2-R/F3-R/F4-R；正确产物分别为773bp、774bp、661bp、 701bp。引物参考表7。
表7目的片段所涉及的模板和引物表
总共筛选各3个单菌落，pF1的1号和2号、pF2、pF3、pF4均呈阳性，具体可参考 图7中单菌落筛选的图。
5)酶切进行质粒鉴定。
分别取上述阳性菌落进行扩增培养，提取质粒DNA。分别用BsmBI(购自NEB)酶 切，反应如下，反应所用试剂参考表8。
表8质粒鉴定所用试剂
| 试剂 | 用量 |
| Buffer | 2μl |
| 质粒DNA | 400ng |
| BtgzI | 1μl |
| ddH<sub>2</sub>O | upto20μl |
正确的质粒用BsmBI酶切后应分别产生pF1:5783bp/2134bp、 pF2:3110bp/2313bp/2133bp、pF3:4006bp/2313bp/2127bp、pF4:4738bp/2518bp的DNA片段。
酶切结果如图8，四个质粒均有相应质粒产生了正确的片段。
将四个质粒进行测序验证，结果证明该质粒含正确的片段序列序列。
备注：
1.在分别扩增完构建pF1(T7-1-3490)质粒，pF2(3471-6599)质粒，pF3(6580-10599)， pF4(8162-10990)质粒所需要的目的片段后，根据上表6中的重组体系进行混合，之后按 照同源重组的步骤进行操作，构建相应质粒。
2.由病毒基因组全长cDNA片段构建策略可知，病毒基因组中包含三个BsmBI酶切位 点，根据这三个酶切位点将病毒全基因组分成4个片段，此即pF1(T7-1-3490)、pF2(3471-6599)、pF3(6580-10599)、pF4(8162-10990)四个质粒中所包含的四个片段。
3.上表5中pF1(T7-1-3490)质粒，pF2(3471-6599)质粒,pF3(6580-10599)，pF4(8162-10990)质粒的构建过程中所涉及到的PCR扩增反应使用到的酶全部为PrimeSTARGXL DNA Polymerase(R050，TAKARA)，反应体系参考前面所述。根据此酶R050的特性， 在扩增反应中预变性温度和时间均为95℃，3min，变性温度和时间为98℃，10s，退火温 度和时间使用的均为60℃，15s，延伸的温度均为68℃延伸时间则根据片段大小按照1000bp 延伸60s的比例适当选择。反应体系均为30μl。
5.本发明中涉及到使用同源重组方法的实验中，使用的试剂盒均为 ClonExpressMultisOneStepCloningKit(C113，诺维赞)，将不再赘述。
3.1.2连接病毒全基因组cDNA大片段
制备片段：由于分段后的片段不算太长，因此利用PCR从pF1(T7-1-3490)质粒，pF2(3471-6599)质粒，pF3(6580-10599)，pF4(8162-10990)质粒上扩增回收片 段f1，f2，f3，f4；并将片段f1、片段f2、片段f3以及片段f4分别用BsmBI酶切连 接得到病毒全长。
具体来说，参考表9，表10，PCR得到f1，f2，f3，f4经单酶切后回收各片段；
表9目的片段所涉及的模板和引物表
表10各质粒片段的回收配方和工艺参数表
备注：
1.片段f1，片段f2，片段f3，片段f4的制备按照上表中的酶切体系及时间操作； 酶切结束后，可取少量作凝胶电泳观察酶切是否完全，如不完全，需适当多加一点酶 或延长孵育时间，或二者兼备；
2.制备含0.03％全式金染色液的0.6％琼脂(TsingKe,TSJ001)凝胶。取0.6微克琼脂加100毫升TAE缓冲液置微波炉加热1-2分钟至琼脂完全融化，待冷却至50℃左 右加全式金染色液(按1：3000倍稀释)混匀后铺胶。注意染色剂加多了可能抑制DNA 片段的链接。将上述的酶切产物全部经上述的凝胶电泳分离。将凝胶置一清洁的玻璃 平板上，用一次性不锈钢刀片将正确的目的片段切下回收。用GelExtractionKit (D2500-02，OMEGA)按试剂盒提供的方法进行纯化。
所述片段f1、片段f2、片段f3、片段f4通过高浓度T4连接酶作体外连接，获得全长rDTMUV-QY21。具体参数参考表11。全长rDTMUV-QY21的线性结构如图9所示；
表11 rDTMUV-QY21片段的连接配方表
备注：
1.片段f1、片段f2、片段f3、片段f4按照上表的量计算使用(以最长片段为基 准，按比例计算)，并连接。
2.将连接产物直接使用试剂(MiniBEST DNA fragment purificationkitVersion4.0， TAKARA，9761)纯化后用DEPC水回收，纯化后的产物跑琼脂糖电泳胶看是否连接 完全。
3.1.体外转录
以上述病毒全长cDNA为模板，利用mMESSAGEm
T7 Kit体外转录试剂盒(AM1344，美国Thermo公司)进行体外转录，获得具有感染性的RNA。具体参数参 考表12。
表12体外转录体系与反应条件
| 试剂 | 用量 |
| 全长连接纯化产物 | 1μg |
| 2×NTP/CAP | 10μL |
| 10×Reaction Buffer | 2μL |
| GTP | 2μL |
| Enzyme Mix | 2μL |
| Nuelease-free Water | 补齐到20μL |
| 温度 | 37℃ |
| 时间 | 3h |
3.1.4拯救病毒。
将BHK-21细胞置30mm培养皿培养过夜使其达80-90％满。
提前一天将电转杯置于紫外灯下照射。打开离心机，调4℃，500g，将细胞放入37℃培养箱；打冰，用50ml离心管取30ml PBS预冷，将RNA也置于冰上；取3个小皿，向 其中加入2ml 7％FBS DMEM(1％双抗)，放入37℃培养箱中预热；取2ml胰酶消化T75 中的细胞，加入15ml 10％FBS DMEM重悬，转入50ml离心管中，配平后4℃500g离心 5min；弃上清，加入15ml冷PBS再重悬，再离心(重复1次)；弃PBS，加入700μLPBS 重悬，分装，与RNA混匀后置于冰上3min(200μL+阳性对照，200μL+阴性对照；200ul+ 转录产物)。
将电转仪设定为105V，25ms(打开-第3程序-enter-pulse-设定105V)。将培养基与细胞和RNA混合后的液体加入电转杯中，将电转杯放入仪器槽里进行电转，电转完后立 刻将电转杯置于冰上3min，将液体吸出加入到预热的培养基中。将其放入37℃培养箱中 培养，待细胞长满后换液(无血清DMEM+1％双抗)。在无血清DMEM培养基中培养3-4 天。将培养皿(细胞连带培养基)置-800/370发复冻融3次后于12000rpm离心5分钟，取 上清保存。该上清液为含P0代重组病毒rDTMUV-QY21的病毒液。
四、鉴定rDTMUV-QY21
4.1拯救病毒的初步检测
用上述于BHK-21细胞拯救出的病毒在DF-1细胞上传代1次后提取细胞总RNA 进行RT-PCR检测。
用特异性引物作逆转录获得cDNA，再以此cDNA为模板用表1所述11对引物 和DNA聚合酶作PCR。将此PCR产物纯化后用引物 (M13-F:GTAAAACGACGGCCAGT)测序。其结果显示与原毒株无差异。可以初步 确定成功拯救出以DTMUV-QY21为亲本株的拯救毒株。
4.2重组病毒rDTMUV-QY21在DF1细胞出现的病变情况
拯救毒株在DF-1细胞上适应传4代次后，病毒能够稳定在48h开始出现细胞收 缩、变圆等病变。参考图11，分为A、B、C三列，其中，A列代表DF1细胞未感染 病毒48h后的形态；B列为DTMUV-QY21病毒感染DF1细胞48h后形态；C列为r DTMUV-QY21感染DF1细胞48h后细胞的形态。
DTMUV-QY21是指病毒分离，盲传并在DF1细胞上进行噬斑纯化后的病毒；测序和分析归类步骤中涉及的均为此病毒。
rDTMUV-QY21是指重组病毒，即文中通过重组克隆拯救出的病毒。
通过图11可看出，重组病毒rDTMUV-QY21和它的母体病毒DTMUV-QY21均能感 染DF1形成细胞病变。
4.3重组毒rDTMUV-QY21生长特性的检测
扩增E蛋白基因，通过PCR鉴定、胶回收、连接至T载体，转化至大肠杆菌感受 态细胞，菌液放大培养后提取质粒，送往测序公司测序，确定为E蛋白基因后。将阳性质 粒按10-1～10-6倍比稀释作为cDNA模板，参照Takara公司绝对定量荧光定量PCR说明 书，在荧光定量PCR仪上得到以拷贝数对数(拷贝数＝质粒浓度×阿氏常数/质粒分子量) 为X轴，以CT值为Y轴的线性方程，最终得到标准曲线线性方程。根据DTMUV的E 基因建立标准曲线(如图14)，利用qPCR绝对定量的方法检测DTMUV-QY21和 rDTMUV-QY21的病毒复制拷贝数。该曲线提示重组病毒rDTMUV-QY21与其母本毒株 DTMUV-QY21复制周期没有显著区别(如图15)。扩增引物如下表13。
表13扩增E基因及鸭坦布苏病毒荧光定量PCR引物序列
4.4重组毒rDTMUV-QY21致病性检测
4.4.1动物回归实验
选择健康9日龄麻鸭24只，饲养至14日龄，攻毒组15只，以0.2mL/只(含1000 ELD50)的剂量腿部肌肉进行攻毒，对照组的9只鸭子作为空白组，攻毒组与对照组分开 饲养，确保不会通过水平传播，攻毒后记录鸭子采食、排便、体重等变化。分别于攻毒后 1d、3d、5d、7d，无菌条件下，每天剖杀3只感染攻毒组雏鸭和2只空白对照组雏鸭， 取肝脏、脾脏、肾脏、脑组织、胰腺等组织器官。
4.4.2荧光定量PCR检测组织器官病毒
标准曲线制作与4.3所述相同。无菌条件下，取一定量各组织器官，置研钵研磨至匀 浆状态，-80℃和室温状下反复冻融三次，利用Trizol试剂法获得病料总RNA，反转录获得cDNA。根据荧光定量PCR染料法SYBR试剂使用方法，制定荧光定量PCR反应体系 如下表14，配液需在冰上进行；
表14 SYBR Green I荧光定量PCR反应体系
三步法荧光定量PCR反应条件：95℃3min，95℃30s，60℃15s，72℃20s，设 置40个循环。
通过病毒在各组织脏器中分布的含量比较(如图16-20)，提示DTMUV-QY21与rDTMUV-QY21的致病性没有显著差别。
对比例
将片段分为A(1-2586)、B(2557-5386)、C(5366-8186)、D(8161-10990)四 段分别利用同源重组技术构建亚基因组质粒，通过图22和23可见，图22和23表现为无 信号，重叠峰。
由于B片段在构建的过程中无法完整克隆到pBR322载体上，因此无法再利用同源重 组构建覆盖病毒基因组全长的质粒用于体内转录。
综上所述，对于鸭坦布苏病毒而言，并不是所有的重组方式都是适用的，采用本发明 的方法其与原毒株无差异，
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背 离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从 哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (3)
1.一种鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：构建亚基因组质粒，所述亚基因组质粒为质粒pF1、pF2、pF3、pF4，质粒pF1、pF2、pF3、pF4分别含目标片段F1、F2、F3、F4；
步骤2：获取目标片段：从质粒pF1、pF2、pF3、pF4上获取用于连接全长的目标片段f1、f2、f3、f4；
步骤3：体外连接目标片段f1、f2、f3、f4，获得鸭坦布苏病毒感染性全长cDNA；
目标片段F1/f1的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为1-3490；
目标片段F2/f2的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为3471-6599；
目标片段F3/f3的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为6580-10599；
目标片段F4的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为8162-10990；
目标片段f4的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置为10580-10990。
2.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒感染性全长cDNA的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为：
步骤11：利用引物Vector-F、Vector-R以pBR322-Base为模板，通过PCR扩增pBR322载体，然后经胶回收备用，得到的pBR322-Base-T7pro；
步骤12：分别用带同源臂的引物、以DTMUV-QY21全基因组为模板通过RT-PCR技术扩增带同源臂的cDNA片段，得到目标片段F1、F2、F3、F4；
步骤13：将目标片段F1、F2、F3、F4分别和pBR322-Base-T7pro进行同源重组，得到质粒pF1、pF2、pF3、pF4；
步骤12中，扩增目标片段F1所用引物为F1-F、F1-R；
扩增目标片段F2所用引物为F2-F、F2-R；
扩增目标片段F3所用引物为F3-F、F3-R；
扩增目标片段F4所用引物为F4-F、F4-R；
Vector-F、Vector-R、F2-F、F2-R、F3-F、F3-R、F4-F、F4-R的序列如序列表SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：9所示；
鸭坦布苏病毒的全长序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
3.一种鸭坦布苏重组病毒rDTMUV-QY21的制备方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的鸭坦布苏病毒感染性cDNA进行体外转录，获得鸭坦布苏重组病毒rDTMUV-QY21。
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| CN115074389A (zh) * | 2022-06-13 | 2022-09-20 | 华南农业大学 | 稳定表达鸭坦布苏病毒ns1蛋白的细胞系的构建方法及其应用 |
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